Papel potencial del eje de señalización PGE 2-EP4-Ca2+ en la osteoartritis postraumática

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para delinear sistemáticamente los métodos de establecimiento y evaluación de modelos de ratas con osteoartritis, a través de la comparación, proporcionando evidencia científica de la diferente patogénesis entre la osteoartritis inducida por lesiones mecánicas agudas y la osteoartritis crónica inducida por factores metabólicos / ambientales. El modelo ACLT es el enfoque principal, enfatizando los cambios en la vía de señalización de la disfunción mitocondrial EP4-Ca²⁺.

Resumen

La osteoartritis postraumática (PTOA) es una enfermedad articular degenerativa desencadenada por un traumatismo o estrés mecánico intenso, que conduce a la degeneración del cartílago articular y al deterioro funcional. La prostaglandina E2 (PGE₂) contribuye significativamente a la degradación del cartílago después de una lesión mecánica al activar su receptor, el receptor de prostaglandina E 4 (EP4), en las membranas de los condrocitos. La homeostasis del cartílago articular se basa principalmente en el equilibrio dinámico entre la degradación y la reparación del cartílago, un proceso finamente regulado por los condrocitos. Se ha demostrado que la vía de señalización de la proteína quinasa II dependiente de Ca²⁺ / Calmodulina (CAMKII) desempeña un papel fundamental en la mediación de la restauración de la función de los condrocitos. En este estudio, observamos un aumento de la expresión de EP4, receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) y CaMKII fosforilado en condrocitos estimulados por interleucina-1 beta (IL-1β), lo que sugiere un posible vínculo entre la señalización de EP4 y la desregulación del calcio. Sin embargo, aún faltan pruebas directas que confirmen la participación del eje EP4-Ca²⁺/CaMKII en la PTOA. Se necesitan más investigaciones que utilicen intervenciones genéticas o farmacológicas para aclarar este posible mecanismo. Estos hallazgos proporcionan una base preliminar para explorar la homeostasis del calcio y la señalización de EP4 como objetivos para el tratamiento de la PTOA.

Introducción

Aunque la actividad física se promueve ampliamente por sus beneficios para la salud, sigue siendo una causa importante de lesiones musculoesqueléticas de las extremidades inferiores, que pueden conducir a diversos resultados adversos¹. Entre estos, la PTOA se ha convertido en una carga cada vez mayor para los adolescentes y adultos jóvenes que experimentan lesiones articulares a una edad temprana^{de 2} años. De manera alarmante, aproximadamente el 48-52% de las personas que sufren lesiones articulares relacionadas con el deporte desarrollan PTOA dentro de los 11-17 años ^3,4. La articulación de la rodilla, una de las articulaciones lesionadas con mayor frecuencia en los deportes juveniles y las actividades recreativas, es particularmente vulnerable en la progresión de una lesión articular a la PTOA. Un estudio prospectivo informó que las personas con lesiones de rodilla tienen un riesgo 10 veces mayor de desarrollar osteoartritis de rodilla confirmada radiográficamente 12-20 años después de la lesión en comparación con las personas no lesionadas⁵. Además, en adultos jóvenes, las evaluaciones radiográficas han demostrado que las jugadoras de fútbol con lesiones por transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) tienen un riesgo del 51% de desarrollar PTOA dentro de los 12 años, mientras que los jugadores masculinos tienen un riesgo del 41% dentro de los 14 años⁵. Estos hallazgos resaltan el impacto negativo a largo plazo de las lesiones articulares relacionadas con el deporte en la salud musculoesquelética. Por lo tanto, comprender los mecanismos patológicos irreversibles que subyacen al desarrollo de la PTOA es crucial para identificar estrategias de intervención adecuadas destinadas a mitigar la progresión de la enfermedad.

La desregulación temprana de la homeostasis de Ca²⁺ es uno de los indicadores clave para el inicio de la PTOA⁶. El Ca²⁺ se une a la calmodulina (CaM) para formar un complejo Ca²⁺/CaM que puede interactuar con CaMKII, aliviando su conformación autoinhibitoria y regulando la actividad de la quinasa⁷. Tanto en la OA humana como en la murina, la expresión de CaMKII fosforilada (la forma activada de CaMKII) está aumentada, mientras que el uso de inhibidores de CaMKII bloquea esta elevación en los niveles de fosforilación, lo que lleva a la destrucción del cartílago articular⁸, lo que demuestra el importante papel regulador de Ca²⁺/CaMKII en la mediación de la homeostasis del cartílago OA. Normalmente, estos cambios están influenciados de manera crucial por la activación de mecanismos inflamatorios en el desarrollo de la PTOA. Los niveles altos de PGE₂, como mediador proinflamatorio clave del dolor, influyen en la progresión de la OA al activar el receptor EP4. Específicamente, la eliminación condicional de EP4 en el cartílago articular mejora la formación de cartílago y el metabolismo anabólico, al tiempo que inhibe la hipertrofia y el catabolismo de los condrocitos, promoviendo así la regeneración del cartílago articular estable y maduro en lugar del fibrocartílago y aliviando el dolor articular⁹. Dado el papel crucial de la vía de señalización Ca²⁺/CaMKII en la fisiología de los condrocitos y la participación reconocida del receptor EP4 en la progresión de la osteoartritis, este estudio tuvo como objetivo explorar si la activación de EP4 está asociada con cambios en la señalización del calcio y la disfunción mitocondrial durante el desarrollo de la PTOA. Aunque la relación causal entre EP4 y la desregulación de Ca²⁺ aún no se ha determinado, los datos aquí sugieren un posible vínculo mecanicista que justifica una mayor investigación.

Este estudio se centra en los posibles mecanismos que vinculan la activación del receptor EP4 con la señalización de Ca²⁺ y la disfunción mitocondrial durante el desarrollo de PTOA. En comparación con los métodos de diagnóstico tradicionales, como las técnicas de imagen que detectan la progresión de la PTOA, y los enfoques terapéuticos actuales, como los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) para el alivio de los síntomas, nuestro enfoque tiene como objetivo revelar alteraciones tempranas de la señalización intracelular en la patogénesis de la PTOA. Esta visión mecanicista proporciona una comprensión más precisa del inicio y la progresión de la enfermedad, ofreciendo nuevas vías para el diagnóstico temprano y las intervenciones específicas. Por lo tanto, este estudio estableció un modelo de rata PTOA inducido por la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) para imitar las lesiones mecánicas comúnmente observadas en atletas con deterioro del control motor durante la actividad física aguda o crónica. Este modelo sirve como una representación óptima del daño articular mecánico postraumático, ofreciendo una plataforma reproducible para investigar tanto los cambios histopatológicos como los mecanismos moleculares subyacentes. Un grupo de dieta alta en grasas más exposición al ambiente húmedo (FD) sirve como control positivo, con el objetivo de simular los factores de riesgo metabólicos y ambientales asociados con la osteoartritis crónica. El primero modela la lesión aguda causada por traumatismos mecánicos, mientras que el segundo representa un modelo de enfermedad natural inducido por trastornos metabólicos y factores ambientales, aunque la patogénesis final en este grupo podría no seguir el eje mitocondrial EP4-Ca².

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital Provincial de Medicina China de Guangdong (número de aprobación ética: 2024014-2). El estudio se realizó de acuerdo con las regulaciones sobre el uso ético de animales de laboratorio estipuladas por el Consejo de Estado de la República Popular China.

1. Animales

1. Use ratas Sprague-Dawley (SD) endogámicas SPF para reducir los posibles efectos de confusión asociados con el ciclo estral. Seleccione un total de nueve ratas SD macho, de 4 semanas de edad y con un peso de entre 90 g y 100 g, para este experimento.
   NOTA: Estas ratas provienen de un proveedor autorizado de animales de laboratorio en China (número de certificado: 20240410Aazz0619000774).
2. Mantenga a todos los animales en un entorno específico libre de patógenos (SPF). Mantenga un ambiente controlado a una temperatura de 24 ± 2 °C con una humedad promedio de 60 ± 1% y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
3. Asegúrese de que las ratas tengan libre acceso al agua acidificada y a una dieta estándar para roedores.

2. Construcción e intervención de modelos animales

1. Aclimatar a las ratas durante un período de 2 semanas en el centro de alimentación. Asigne aleatoriamente las ratas en tres grupos a las 6 semanas de edad: grupo de control, grupo PTOA y grupo FD, con tres ratas en cada grupo.
2. Actualice el grupo de control en condiciones estándar.
3. Anestesiar el grupo PTOA con isoflurano (4% para inducción y 1%-2% para mantenimiento).
4. Exponga quirúrgicamente las articulaciones bilaterales de la rodilla a través de una incisión cutánea longitudinal utilizando un enfoque parapatelar medial.
5. Realice ACLT con un bisturí y confirme la transección completa realizando una prueba positiva del cajón anterior.
   NOTA: Se realizó una transección bilateral del LCA para garantizar la consistencia del modelo y reducir la variabilidad individual. Los datos de ambas rodillas se promediaron para obtener un valor por animal para el análisis.
6. Transfiera periódicamente las ratas de los grupos FD a una cámara climatizada, situada en la misma instalación. Somete a estas ratas a una dieta alta en grasas.
   NOTA: La dieta alta en grasas contenía 20% de sacarosa, 15% de manteca de cerdo, 1.2% de colesterol, 0.2% de colato de sodio, 10% de caseína, 0.6% de hidrogenofosfato de calcio, 0.4% de polvo de piedra caliza, 0.4% de premezcla y 52.2% de alimento basal. El perfil de nutrientes del alimento control fue el siguiente: 19% de proteína, 31% de grasa y 50% de carbohidratos, con una relación calórica de 17% de proteína, 37% de grasa y 46% de carbohidratos.
7. Mantenga las condiciones ambientales dentro de la cámara climática a una temperatura de 24 ± 2 °C, un nivel de humedad del 90 ± 4% y un ciclo de luz diario de 12 h.
   NOTA: Debido al mayor riesgo de crecimiento bacteriano en un entorno de alta temperatura y alta humedad, esterilice el agua potable y los alimentos y repóngalos diariamente para minimizar la contaminación. La duración total de la intervención experimental fue de 12 semanas.

3. Análisis de la marcha (huellas)

1. Realizar análisis de la huella 12 semanas después del inicio del tratamiento en las ratas modelo, utilizando un método previamente descrito¹⁰.
2. Cubra las superficies ventrales de las patas traseras de las ratas con tinta roja, y se les permitió caminar por un sendero de 100 cm de largo y 8 cm de ancho, que se cubrió con papel blanco.
3. Para alentar a las ratas a moverse, coloque una cámara oscura al final del camino para estimular el movimiento hacia adelante.
4. Tome tres mediciones secuenciales para obtener valores promedio para cada parámetro, incluida la longitud de zancada y la longitud del paso, que se utilizaron para evaluar la irregularidad.
5. Determine la longitud de la zancada (cm) midiendo la distancia recorrida por la misma pata trasera entre dos pasos sucesivos.
6. Defina la longitud del paso (cm) como la distancia horizontal entre las patas traseras izquierda y derecha.
7. Mida el ángulo de la pata (°) como el ángulo entre el segundo dedo del pie y el calcáneo, en relación con una línea horizontal¹¹.
8. Mida la longitud de la zancada, la longitud del paso y el ángulo de la pata directamente en las imágenes de huella escaneadas utilizando el software Image-Pro Plus (versión 6.0), utilizando sus herramientas integradas de medición de distancia y ángulo.
   NOTA: Estos parámetros de la marcha son cruciales para identificar deficiencias funcionales sutiles en las primeras etapas de la osteoartritis. Los pacientes pueden exhibir una zancada y una longitud de paso reducidas para proteger las articulaciones dolorosas, mientras que el aumento del ángulo de salida de la punta y la asimetría de la marcha a menudo ocurren como respuestas compensatorias a la inestabilidad articular inducida por el dolor.

4. Medición del diámetro de la junta

1. Mida el diámetro de la junta con un micrómetro espiral calibrado (mm) después de modelar en cada grupo.
   NOTA: A medida que avanza la osteoartritis, los pacientes suelen presentar hinchazón y dolor en las articulaciones. Un mayor grado de hinchazón puede indicar una etapa más grave de la enfermedad.

5. Medición de la fuerza de agarre

1. Mida la fuerza de agarre de las extremidades posteriores con un medidor digital de fuerza de agarre equipado con una rejilla de tracción, un medidor de fuerza equipado con una rejilla de tracción (90 mm × 90 mm).
   1. Sostenga suavemente a la rata por la cola y la piel en la parte posterior del cuello.
   2. Baje al animal hasta que sus extremidades traseras agarren firmemente la rejilla, luego tire firmemente del animal horizontalmente a lo largo del eje del sensor de fuerza hasta que suelte su agarre.
   3. Repita la prueba tres veces por animal. Registre el valor más alto como la fuerza de agarre máxima.
      NOTA: Durante la prueba de fuerza de agarre de las extremidades posteriores, inmovilice las extremidades anteriores pegándolas con cinta adhesiva a una superficie de cartón para evitar el enganche accidental de las extremidades anteriores con la rejilla de tracción. La disminución de la fuerza de agarre es indicativa de una disminución de la función muscular y posibles déficits motores relacionados con el dolor asociados con la progresión osteoartrítica.

6. Aislamiento y cultivo primario de condrocitos

1. Aísle los condrocitos primarios de ratas Sprague-Dawley macho de 6 semanas de edad.
2. Diseccione las cabezas femorales y las mesetas tibiales para recolectar aproximadamente 100-150 mg de tejido cartilaginoso.
3. Lave el tejido dos veces con PBS que contenga penicilina-estreptomicina al 1%.
4. Digerir el cartílago en 5 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a 3 °C durante 30 min.
5. Cortar el cartílago en trozos de 1-2 mm³ y volver a digerir en 10 ml de colagenasa II al 0,2% a 37 °C durante 4 h en un agitador a temperatura constante.
6. Filtrar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μm, centrifugar a 300 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender el sedimento celular en medio DMEM / F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina.
8. Incubar las células a 3 °C en una atmósfera humidificada con 5% de_CO2.

7. Tratamiento celular

1. Cuente los condrocitos aislados con un hemocitómetro.
2. Siembre los condrocitos en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10⁵ células por pocillo en 0,1 ml de medio de cultivo completo (DMEM / F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina).
3. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5% durante 24 h para permitir la adhesión.
4. Para establecer un modelo de PTOA inflamatorio in vitro , tratar los condrocitos adherentes con IL-1β (10 ng/mL) durante 48 h una vez que la confluencia celular alcance aproximadamente el 80%.
5. Para el control positivo FD, disuelva el ácido palmítico (PA, CAS No. 57-11-4) en cloroformo a una dilución 1:1000 para preparar una solución madre de 500 μM.
   1. Cuando la confluencia celular alcanzó aproximadamente el 80%, agregue 1 μL de la solución madre de PA por 1 mL de medio de cultivo para alcanzar una concentración final de PA de 500 nM. Trate los condrocitos con esta solución durante 48 h.
6. Agregue 1 μL de cloroformo (control del vehículo) por 1 mL de medio de cultivo para controlar las células sin PA.

8. Recogida de muestras, descalcificación y preparación de la inclusión

1. Eutanasia a los animales a las 12 semanas después de la intervención mediante la inhalación de una sobredosis de isoflurano (≥5%) en una cámara sellada durante al menos 5 min, y confirme el cese completo de la respiración y los latidos del corazón.
   NOTA: Este método fue aprobado por el Comité de Ética Animal y cumplió con las pautas nacionales para la eutanasia humanitaria de animales de laboratorio.
2. Recolecte ambas articulaciones de la rodilla de tres ratas por grupo (n = 3, total = 6 rodillas) para la evaluación histológica.
3. Fije las muestras en paraformaldehído (PFA) al 4% a una relación de volumen de tejido a fijador superior a 1:20 durante más de 48 h en un agitador a °C.
4. Enjuague los pañuelos con agua corriente del grifo durante 1-2 h para eliminar el fijador residual.
5. Descalcifique los tejidos en una solución de EDTA 0,5 M (pH 7,4, ~15%) a una proporción de tejido a solución de 1:20 durante 21 días a 3 °C, y reemplácelos con una solución nueva cada 3 días.
6. Evalúe la finalización de la descalcificación sondeando el hueso con una aguja para ablandarlo.
7. Lave los pañuelos descalcificados con agua corriente del grifo durante 2 h y colóquelos en casetes de inclusión.
8. Deshidrate las muestras a través de una serie de etanol graduado: etanol al 75% durante 2 h (o durante la noche), etanol al 80% durante 2 h, etanol al 95% durante 0,5 h y etanol absoluto dos veces durante 60 min. A continuación, sumergir en xileno:etanol 1:1 durante 20 min.
9. Limpie los tejidos en xileno dos veces (10 min y 60 min).
10. Infiltrar los tejidos con parafina en el siguiente orden: xileno: parafina (1:1) durante 15 min, parafina blanda a 52-5 °C durante 1 h (dos veces), luego parafina dura a 56-5 °C durante 30 min.
11. Incruste los tejidos utilizando un sistema de inclusión de parafina (por ejemplo, Leica, ajustado a 6 °C) y transfiera los bloques a una placa fría de -2 °C durante 2 h.
12. Bloquea la parafina de sección sagitalmente a un grosor de μm usando un micrótomo.
13. Flote las cintas en un baño de agua a 4 °C y móntelas en portaobjetos de vidrio limpio.
14. Seque al aire las secciones montadas y hornee en un horno a 60 ° C durante 2 h para eliminar la parafina residual.
15. Desparafina las secciones sumergiéndolas secuencialmente en xileno (10 min), xileno fresco (10 min), etanol absoluto (5 min), etanol absoluto fresco (5 min), etanol al 90% (5 min) y etanol al 75% (5 min), luego enjuague con agua del grifo antes de teñir.

9. Tinción de hematoxilina y eosina (HE)

1. Las secciones de tejido desparafinado y rehidratado sumergidas se sumergieron en una solución de tinción de hematoxilina al 0,5% durante 3-5 min a temperatura ambiente (RT; ~2 °C), seguido de un enjuague completo con agua corriente del grifo.
2. Trate brevemente las secciones con una solución de diferenciación de hematoxilina durante 2-5 s y enjuague con agua corriente del grifo.
3. Realice el azulado sumergiendo secciones en una solución de azulado de hematoxilina durante 2-5 s, seguido de enjuague.
4. Deshidratar secciones en etanol al 85% y 95% durante 5 min cada una, luego teñir en eosina Y al 0,05% (alcohólica) durante 5 min.
5. Deshidratar dos veces en etanol absoluto (5 min cada uno), luego aclarar en xileno (5 min), seguido de xileno fresco (5 min).
6. Monte las secciones con bálsamo neutro y cúbralas con un cubreobjetos.
   NOTA: En cartílago bien conservado, la hematoxilina tiñe los núcleos de azul y la eosina tiñe la matriz de rosa. El cartílago dañado muestra pérdida de condrocitos, fibrilación y matriz desorganizada.

10. Safranina O - tinción verde rápida (SOFG)

1. Tiñe las secciones con una solución Fast Green al 2% durante 1-5 min a temperatura ambiente. Lavar con agua corriente del grifo hasta que el cartílago se vuelva incoloro.
2. Diferencie brevemente las secciones en ácido clorhídrico al 1% durante 10-15 s, luego enjuague bien con agua corriente.
3. Tiñe las secciones con una solución de Safranina O al 0,2% durante 5-10 s, luego deshidrate rápidamente a través de cuatro cambios de etanol absoluto (3-5 s cada uno).
4. Limpie las secciones en xileno (5 min), seguido de xileno fresco (5 min).
5. Monte las diapositivas con bálsamo neutro y cúbralas con un cubreobjetos.
   NOTA: La safranina O tiñe de rojo los proteoglicanos del cartílago, mientras que Fast Green tiñe de verde los tejidos óseos/fibrosos. La pérdida de rojo indica agotamiento y degeneración de proteoglicanos.
6. Evaluar los cambios histológicos utilizando el sistema de puntuación de la Sociedad Internacional de Investigación de la Osteoartritis (OARSI). Mida el ancho del espacio articular y el grosor del cartílago para evaluar la degeneración estructural. Capture imágenes bajo un microscopio óptico (por ejemplo, ECLIPSE Ti2-E) a 4× (barra de escala = 50 μm) y 20x (barra de escala = 10 μm).
   NOTA: Utilice el software de imágenes del sistema para la captura de imágenes e ImageJ (v1.48v) para el análisis. Calibre imágenes a través de Analizar > Establecer escala con un micrómetro. Para cada articulación, cuantifique cinco campos aleatorios de tres secciones sagitales utilizando el análisis ciego de tres observadores independientes.

11. Micro-μ TC

1. Diseccionar las articulaciones de la rodilla de rata 12 semanas después de la intervención y fijarlas inmediatamente en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 24 h para preservar la morfología del tejido.
2. Enjuague las muestras fijadas con PBS y guárdelas en etanol al 70% hasta el escaneo.
3. Monte cada muestra de articulación de rodilla en un portamuestras dedicado antes de escanear. Alinee la articulación a lo largo de su eje largo para minimizar los artefactos de movimiento.
4. Realice un escaneo de micro-μCT utilizando un sistema de micro-μCT con los siguientes parámetros de escaneo: voltaje de rayos X 70 kV, corriente 100 μA y potencia 7 W.
5. Adquiera cuatro fotogramas por proyección y apílelos para mejorar la calidad de la imagen, con un tamaño de paso de rotación de 0,72°, completando una rotación completa de 360°.
6. Establezca el tamaño del vóxel resultante (grosor de corte) en 15 μm, proporcionando imágenes de alta resolución adecuadas para el análisis de huesos trabeculares.
7. Defina la región de interés (ROI) entre la placa de crecimiento tibial proximal y la meseta tibial, centrándose en el hueso subcondral tanto del fémur como de la tibia.
8. Reconstruya los datos de escaneo sin procesar en imágenes transversales utilizando un software de reconstrucción.
9. Importe las pilas de imágenes reconstruidas en un software apropiado para el análisis morfométrico cuantitativo.
10. Evaluar parámetros clave que incluyen la fracción de volumen óseo (BV/TV, %), la densidad mineral ósea (DMO, g/cm³) y la separación trabecular (Tb.Sp, mm).
11. Para una visualización cualitativa y tridimensional, utilice un software de visualización 3D para generar representaciones volumétricas de la microarquitectura ósea.
12. Realizar una evaluación visual para confirmar la integridad estructural y los cambios morfológicos observados en los datos cuantitativos.
    NOTA: Todo el procesamiento y análisis de imágenes fue realizado por operadores ciegos para garantizar resultados imparciales.

12. Elisa

1. Anestesiar a las ratas 12 semanas después de la intervención. Exponga y diseccione cuidadosamente la aorta abdominal para recolectar muestras de sangre.
2. Deje que la sangre recolectada se coagule a temperatura ambiente durante 30 min y luego centrifugue a 755 × g (equivalente a 3000 rpm, usando una centrífuga con un radio de rotor de 7,5 cm) a ° C durante 15 min.
3. Separe y almacene el suero para la medición posterior de los niveles de PGE₂ utilizando un kit ELISA disponible en el mercado.
4. Paralelamente, sembrar condrocitos primarios y cultivarlos durante 24 h, seguido de tratamiento con IL-1β y PA durante 48 h, según el protocolo de tratamiento celular establecido. Después de la intervención, recolecte y analice los sobrenadantes de cultivo para la concentración de PGE₂ utilizando el mismo kit ELISA.

13. RT-PCR cuantitativa

1. Extraiga el ARN total de las muestras celulares utilizando el reactivo de extracción de ARN comercial (TRIzol).
2. Sintetice ADNc utilizando un kit de transcripción inversa (con eliminador de ADNg) y almacene el ADNc resultante a -8 °C para su posterior análisis.
3. Realice PCR cuantitativa utilizando SYBR Green y calcule los niveles de expresión relativos utilizando el método 2−ΔΔCt.
   NOTA: Las secuencias de cebadores utilizadas fueron las siguientes: β-actina directa: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-actina inversa: CTGACCCATACCCACCACCACCAC; Delantero del EP4: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; EP4 delantero: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; Delantero COX-2: GATGACGAGCGACTGTTCCA; COX-2 inverso: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. Análisis de Western blot

1. Lisar las células con tampón RIPA en hielo durante 30 min.
2. Separe las muestras de proteínas mediante SDS-PAGE durante 90 min, luego transfiéralas a membranas de nitrocelulosa durante 2 h.
3. Bloquee las membranas con BSA al 5% y lávelas con una solución tamponada con fosfato.
4. Realice inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos.
   NOTA: Los anticuerpos y sus respectivas diluciones fueron los siguientes: anti-MMP9 (1:1000), anti-colágeno II (1:1000), anti-COX2 (1:1000), anti-CaMKII (1:1000), anti-p-CaMKII (1:1000), anti-IP3R (1:1000), anti-Cyt-C (1:1000) y anti-β-actina (1:2000).
5. Después de la incubación nocturna con anticuerpos primarios, lavar las membranas con TBST e incubar durante 1 h con anticuerpos secundarios: HRP de ratón (1:2000) o HRP de conejo (1:2000) en la oscuridad.
6. Después de otro lavado con TBST, realice la detección de proteínas utilizando un kit de quimioluminiscencia mejorado.
7. Analice los datos con el software ImageJ (versión 1.48v).

15. Tinción de inmunofluorescencia

1. Cultive condrocitos en cubreobjetos en placas de 12 pocillos hasta que alcancen el 80% de confluencia.
2. Después del tratamiento con IL-1β y PA durante 48 h, o ningún tratamiento como control, fijar las células con paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min a RT.
3. Permeabilizar las células con PBS que contenga 0,2% de Triton X-100 durante 15 min.
4. Lave las células tres veces con PBS (5 min cada una), luego incube con anticuerpo primario (anti-IP3R, dilución 1:200) en tampón de dilución de anticuerpos a °C durante la noche.
5. Exponga las células a una dilución 1:500 de anticuerpo secundario IgG de cabra anti-conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína durante 1 h.
6. Contratiña las células con una solución DAPI de 5 μg/ml durante 10 min.
   NOTA: Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando una lente de objetivo de 40x (barra de escala = 2 μm). Todas las imágenes se procesaron con el software ZEN y se cuantificaron con ImageJ (versión 1.48v), siguiendo procedimientos de calibración consistentes.

16. Análisis estadístico

1. Realice análisis estadísticos con GraphPad Prism (versión 8.0.2).
2. Antes de aplicar las pruebas paramétricas, evalúe los datos para la distribución normal utilizando la prueba de Shapiro-Wilk y la homogeneidad de la varianza utilizando las pruebas de Brown-Forsythe y Bartlett.
3. Use ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones entre múltiples grupos, y aplique una prueba t de Student no apareada de dos colas para comparaciones de dos grupos.
4. Considere un valor de p inferior a 0,05 como estadísticamente significativo.
5. Presente todos los datos como media ± desviación estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes.

Resultados

La PTOA inducida por ACLT exhibe destrucción prematura del cartílago y déficits de comportamiento en relación con la KOA crónica inducida por FD (Figura 2 y Figura 3)
El estrechamiento del espacio articular y la degeneración del cartílago son los resultados principales de la OA. Estudios previos han identificado el sobrepeso y los factores ambientales (por ejemplo, clima húmedo) como posibles contribuyentes a...

Discusión

En comparación con la OA crónica inducida por factores ambientales y dietéticos, el traumatismo articular inducido por ACLT conduce a una progresión más rápida de la enfermedad. Nuestros resultados, basados en evaluaciones conductuales que incluyen hinchazón articular, fuerza de agarre de las extremidades posteriores y análisis de la marcha, revelaron diferencias significativas entre el grupo de control, el grupo de PTOA y el grupo de control positivo inducido por factores ambientales y ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,2% de colagenasa II	Sigma-Aldrich, Estados Unidos	Nº CAS: 9001-12-1	Aislamiento y cultivo primario de condrocitos
0,2% Triton X-100	Beyotime, China	ST795	Inmunofluorescencia
0,25% tripsina-EDTA	Tecnología biológica de Wuhan Boster Co., Ltd.	AR1071	Descalcificación
0,25% de tripsina-EDTA	Gibco, Estados Unidos	25200072	Aislamiento y cultivo primario de condrocitos
Solución fijadora de paraformaldehído al 4%	Biyuntian, China	P0099-3L	Fijación de tejidos
Anticuerpo Anti-CaMKII	Huabio, China	ET1608-47	Western blot (1:1000)
Anticuerpo anticolágeno II	Abcam, Reino Unido	ab34712	Western blot (1:1000)
Anticuerpo Anti-COX2	Abcam, Reino Unido	AB179800	Western blot (1:1000)
Anticuerpo anti-Cyt-C	Selleck, China	F2534	Western blot (1:1000)
Anticuerpo anti-IP3R (B-2)	Santa Cruz, Estados Unidos	SC-377518	Western blot (1:1000)
Anticuerpo anti-MMP9	Abcam, Reino Unido	AB76003	Western blot (1:1000)
Anticuerpo anti-p-CaMKII	Selleck, China	F0342	Western blot (1:1000)
Anticuerpo anti-β-actina	Tecnología de señalización celular (CST), EE. UU.	8H10D10	Western blot (1:2000)
Solución de bloqueo de BSA	Sigma Aldrich, Estados Unidos	N/A	5% BSA para el bloqueo de Western blot
Centrífuga (5424 R)	Eppendorf, Alemania	N/A	755 &veces; g Velocidad de centrifugación
Cloroformo	Sigma Aldrich, Estados Unidos	N/A	Disolvente para PA
Cámara climatizada (RXZ-158A)	Fabricante nacional, China	N/A	Modelo de ambiente húmedo
Kit de transcripción inversa de color	Invitrogen, Suzhou, China	N/A	Síntesis de ADNc
Software CTAn	Bruker	Versiones 1.9 y 4.1	Para el análisis morfométrico cuantitativo
Software CTVol	Bruker	Versión 2.0	Para visualización cualitativa y tridimensional
Solución de tinción DAPI	Beyotime, China	N/A	La tinción nuclear (5 µ g/ml)
Medidor digital de fuerza de agarre	Instrumento Puxin	N/A	Medición de la fuerza de agarre de las extremidades traseras
DMEM/F12 Medio	Corning, Estados Unidos	N/A	Medio de cultivo celular
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)	Aladdin	N/A	Descalcificación de tejidos óseos
Kit ELISA para PGE2	Elabscience, Wuhan, China	PGE2E-EL-0034	Detección de ELISA
Kit de quimioluminiscencia mejorado	Millipore, Estados Unidos	WBKLS0500	Detección de Western blot
Etanol	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 64-17-5	Deshidratación de tejidos
Suero fetal bovino (FBS)	Corning, Estados Unidos	N/A	10% de concentración para cultivo
IgG anti-conejo de cabra con etiqueta FITC	Beyotime, China	Kit P0179	Inmunofluorescencia (1:500)
Prisma GraphPad	Software GraphPad, EE. UU.	Versión 8.0.2	Análisis de datos
Hematoxilina y eosina (H& E) Kit de tinción	Servicebio, Wuhan	G1005	Histología
IL-1 y beta;	PeproTech, Estados Unidos	400-01B	10 ng/ml para el modelo de célula PTOA
ImagenJ	NIH, Estados Unidos	Versión 1.48v	Análisis de imágenes
Software Image-Pro Plus	Cibernética de los medios	Versión 6.0	Análisis cuantitativo de la marcha a partir de huellas escaneadas
Isoflurano	Biología Yaji de Shanghái	YS1412C	Anestesia para cirugía animal
Centro de Incrustación Leica	Leica Microsystems	EG1160	Inclusión de parafina
Micrótomo Leica	Leica Microsystems	RM2235	Corte de tejidos incluidos en parafina
Baño de agua Leica	Leica Microsystems	HI1210	Secciones de parafina flotantes
Microscopio óptico (ECLIPSE Ti2-E)	Nikon, Japón	N/A	Observación histológica
Escáner Micro-CT (ZKKS-MCT-Sharp)	Fabricante nacional, China	N/A	Imágenes óseas
Anticuerpo secundario HRP de ratón	Tecnología de señalización celular (CST), EE. UU.	7076	Dilución 1:2000
Software de imágenes NIS-Elements	Nikon	N/A	Captura y análisis de imágenes de microscopio
Software NRecon	Bruker, Alemania	Versión 1.6	Reconstrucción por TC
Ácido palmítico (PA)	Sigma Aldrich, Estados Unidos	P0500	500 µ Stock M para el modelo de celda FD
Cera de parafina para seccionamiento, grado de patología, punto de fusión 52-54 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258797-500g	Se utiliza para la inclusión de parafina durante el procesamiento de tejidos
Cera de parafina para seccionamiento, grado de patología, punto de fusión 56-58 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258799-500g	Se utiliza para la inclusión final de cera dura en el corte de tejidos
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Gibco / Thermo Fisher	C10010500BT	Lavado celular y enjuague de tejidos
Penicilina-Estreptomicina	Corning, Estados Unidos	N/A	1% para cultivo celular
Membrana de PVDF (0,45 µ m)	Millipore, Estados Unidos	IPVH00010	Membrana Western blot
Anticuerpo secundario HRP de conejo	Tecnología de señalización celular (CST), EE. UU.	7074	Dilución 1:2000
Tinta roja	HÉROE	HÉROE 204	Seguimiento de la huella en el análisis de la marcha
Tampón de lisis RIPA	Keygen, China	N/A	Extracción de proteínas
Safranin O– Kit de tinción verde rápido	Servicebio, Wuhan	G1053	Tinción histológica
Micrómetro espiral (calibrador Vernier)	Huangshan, China	N/A	Medición del ancho de la junta
Software de análisis óseo subcondral (CTAn)	Bruker, Alemania	Versiones 1.9 y 4.1	Análisis morfométrico
Mezcla maestra de PCR verde SYBR	AG Scientific, China	N/A	Análisis de qPCR
Reactivos Western blot (tampón RIPA, componentes de gel SDS-PAGE, tampón de carga, TBST, etc.)	Beyotime Biotechnology (China)	N/A (utilizado como entrada de grupo)	Todos los reactivos de rutina utilizados para los procedimientos de Western blot
Xileno	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 1330-20-7	Limpieza de tejidos