Artículo de método

Fabricación de una matriz cerebral expansible personalizable a través de las etapas de desarrollo

DOI:

10.3791/68638

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20 de febrero de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Spinal Cord and Brain Injury Research Center, Department of Physiology, College of Medicine, University of Kentucky, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, University of Kentucky, 3Department of Neurosurgery, University of Kentucky

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un método innovador para construir matrices cerebrales expansibles que corten cortes coronales o sagitales para su aplicación en lechones neonatales. Este enfoque económico utiliza placas acrílicas talladas con plantillas de moldura cerebral en gel de agarosa, se aplica a múltiples especies y permite la expansión para acomodar el crecimiento cerebral.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El creciente interés en utilizar lechones recién nacidos como modelo de estudio para el desarrollo y la patología neonatal ha generado la necesidad de una matriz cerebral para adquirir con precisión las secciones histológicas. Sin embargo, el rápido crecimiento del cerebro recién nacido limita la utilidad de las matrices disponibles comercialmente a una ventana de desarrollo estrecha. Por ello, se desarrolló un método ajustable de construcción de matrices cerebrales. Primero, se colocó un recipiente de cristal sobre hielo húmedo y se colocó una capa de gel de agarosa al 4% en el fondo. A continuación, se colocó un cerebro fijado con formol sobre esta capa y se incrustó con gel de agarosa al 4%. Después de que el gel se solidificó, se retiró cuidadosamente el gel sobre el cerebro y se extrajo el cerebro. La cavidad se rellenó con gel de agarosa al 4% y tinta india al 2%. Tras la solidificación, el bloque de gel se retiraba y cortaba en el grosor deseado (2 mm o 5 mm) y la orientación (coronal o sagital) para imprimir las plantillas cerebrales en papel de escamas. Las plantillas se copiaban en una serie de placas acrílicas transparentes (de 2 mm o 5 mm de grosor) y se recortaban en consecuencia con una sierra de cinta. Finalmente, las placas se ensamblaron y aseguraron con tres juegos de tornillos y tuercas a través de orificios de alineación preperforados para construir una matriz cerebral personalizada. Se ilustra la construcción de matrices tanto coronales como sagitales para un cerebro cerdito neonatal de día 5 con pasos de 2 mm y una matriz coronal para cerebros postnatales de día 32-38 con pasos de 5 mm. Al añadir o eliminar placas acrílicas adecuadas, la matriz se ajustaba para adaptarse a los distintos tamaños de cerebros de cerdito. Así, se introduce en la comunidad de investigación neurológica un método sencillo y rentable para personalizar matrices cerebrales de diferentes tamaños de animales grandes.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El desarrollo cerebral de los cerditos imita de cerca al de loshumanos 1,2,3,4. Por ello, existe un interés creciente en el uso de lechones para estudios preclínicos de trastornos del neurodesarrollo, enfermedades neonatales y pediátricas, y lesiones (Figura 1A,B)5,6,7,8,9,10. Como se ve en la Figura 1, el cerdito neonatal, como modelo animal grande, tiene un tamaño de cráneo y cerebro más cercano al de un feto humano prematuro (Figura 1A,B), mientras que los cráneos adultos de ratón y rata son al menos dos magnitudes más pequeños.

Sin embargo, existen desafíos con el uso de mamíferos más grandes en la investigación biomédica en comparación con los modelos murinos más ampliamente utilizados. Los cerebros de los lechones neonatales crecen rápidamente durante los primeros 3 meses tras el nacimiento. En las primeras 5 semanas de vida, el cerebro del lechón casi duplica su peso y triplica su volumen (Figura 1C)4,11,12,13. Durante el periodo que abarca de p5 a p38, el crecimiento cerebral y el desarrollo de giros y surcos fueron notables (Figura 1C). El peso y volumen del cerebro de cerdito p5 fueron de 29,5 g y 18,9 mL, mientras que los dos cerebros de p32 fueron de 51,4 y 52,6 g, y 49,6 y 53,5 mL, respectivamente. A los 38 días, el cerebro creció hasta 53,7 g y 52,5 mL, lo que representa un aumento del 80% en peso y un aumento del 170% en volumen respecto al p5. Este rápido crecimiento del cerebro cerdo neonatal supone un reto para la sección histológica precisa de los cerebros de lechones de diferentes edades, cepas o sexos, utilizando una sola matriz.

Las matrices cerebrales comerciales para lechones tienen un coste aproximado de entre 1.000 y 3.600 dólares cada una y solo están disponibles en una sola opción, diseñadas para usarse en lechones de 2 semanas o menos. Aunque existen algunas publicaciones que han utilizado la técnica de escaneo 3D e impresión 3D para crear diversas matrices cerebrales para peces cebra, ratones yaves 14, 15, 16, esas matrices son a una escala relativamente pequeña. No existe una serie de imágenes de resonancia magnética establecida ni una tabla detallada de crecimiento para los cerebros de lechones neonatales, especialmente para aquellos de 2 semanas o menores. Por ello, creamos varias plantillas de corte cerebral utilizando cerebros recogidos entre el día 5 y el día 38, sobre los cuales se estableció un sistema de matriz cerebral ajustable.

Este protocolo describe un método innovador para establecer plantillas cerebrales neonatales de lechón y desarrollar una matriz cerebral personalizable basada en placas acrílicas que puede utilizarse para la sección coronal o sagital de cerebros a lo largo de un espectro de tamaños.

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Protocolo

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En este artículo, se obtuvieron y prepararon los cuatro cerebros de lechón para la tinción histológica tras la eutanasia humanitaria, siguiendo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Kentucky para un estudio independiente. Se aprobaron todos los procedimientos en animales y se tomó el cuidado adecuado para minimizar el estrés o el dolor asociados con los tratamientos o la eutanasia.

1. Animales

  1. Conseguir cuatro lechones masculinos naïfs neonatales (días postnatales 4, p4) (peso corporal 1,5-1,8 kg) con antecedentes genéticos de 62,5% Landrace, 25% Large White y 12,5% Yorkshire.
  2. Alojar a los animales juntos en una habitación dedicada en un corral de cerdos, con el apoyo de una lámpara de calor y un suelo cubierto de toallas. Dales de comer ad libitum con sustituto de leche durante la primera semana y ve pasando gradualmente a la comida en pellets a las 2-3 semanas.
  3. Monitoriza la actividad fisiológica y el peso corporal y realiza resonancias magnéticas semanales bajo anestesia isofluorana.
  4. Eutanasiar con sobredosis de pentobarbital y perfundir transcárdicamente con solución fisiológica heparinizada, seguido de formalina tampón neutra al 10%.
  5. Disecciona el cerebro desde elcráneo 17, fija con formalina durante la noche y luego pon un 30% de sacarosa en PBS durante 3 días para la criopreservación.

2. Moldeo en gel de agarosa

  1. Sumerge un recipiente de cristal en un cubo con hielo húmedo hasta su media altura (Figura 2A).
  2. Utiliza una tira de plástico resistente como forro para el recipiente y asegúrate de que la parte inferior y las paredes laterales estén completamente cubiertas, dejando ambos extremos al menos 5 cm por encima del borde superior.
  3. Calienta 150 mL de PBS en un vaso de cristal a 90 °C sobre una placa de agitación con un agitador de imán y añade y disuelve gradualmente 6 g de agarosa para obtener un gel de agarosa al 4% en PBS.
  4. Vierte una capa de 0,5-1 cm de grosor en el recipiente de cristal (Figura 2B) y espera a que se solidifique.
  5. Aplica una capa fina de aceite mineral tópicamente sobre el cerebro (Figura 2C) y coloca el cerebro sobre la capa de gel (Figura 2D).
  6. Deja que la solución de agarosa se enfríe hasta 50 °C. Incrustar el cerebro con gel de agarosa enfriado (Figura 2E) y dejar solidificar (Figura 2F), lo que generalmente tarda ~10 minutos en hielo húmedo.
  7. Retirar cuidadosamente la capa superior de gel de agarosa sobre el cerebro (Figura 2G) con una sonda quirúrgica y extraer el cerebro del moho solidificado (Figura 2H,I).
  8. Calienta 98 mL de PBS en otro vaso de cristal a 90 °C sobre una placa de remoción con un agitador imán, añade 4 g de agarosa y 2 mL de tinta india, y deja que se remueva y mezcle bien. Vierte un 4% de agarosa con tinta de India al 2% en la cavidad dejada por el cerebro extraído (Figura 2J) hasta que esté llena y deja que se solidifique sobre hielo húmedo durante 15 minutos (Figura 2K).
  9. Utilizando las partes sobresalientes de la tira de plástico, levanta la tira de plástico para retirar todo el bloque de agarosa del recipiente (Figura 2L).

3. Corte de bloques de agarosa y copia de plantillas a papel a escala

  1. Para proteger el papel de la humedad durante el corte, coloque una hoja de papel a escala entre dos placas transparentes de acrílico de 0,76 mm (0,03") de grosor (Figura 3A), y coloque la placa de papel-acrílico laminado cerca del borde del banco.
  2. Asegura los cuadros de las esquinas al banco con las abrazaderas en la posición adecuada para mantener dos placas de acrílico de 5 mm de grosor en pie y sujetando firmemente el bloque de gel en el medio con la orientación deseada (sagital en la Figura 3). Asegúrate de que el borde de cada placa acrílica vertical esté alineado con la misma línea en el papel de escala para usarlo como referencia al cortar el bloque de gel. Utiliza un peso para asegurar el bloque de gel en el extremo opuesto al que se cortará (Figura 3B).
  3. Usando el papel de escamas subyacente como guía, mueve el bloque de gel hacia adelante desde entre las placas de acrílico en el paso deseado (2 mm o 5 mm), sujeta la hoja del microtomo con ambas manos y corta la parte más allá del borde frontal de la placa acrílica (Figura 3B).
  4. Recoge cada rebanada (Figura 3C), colócala sobre un papel a escala aparte (Figura 3D), presiona suavemente la parte teñida con tinta india del molde sobre el papel a escala para transferir el contorno (Figura 3E), traza el contorno de toda la sección de gel con un bolígrafo, retira la sección de gel y delimita la impresión en tinta india también con un bolígrafo (Figura 3F). Presta atención a mantener la orientación de cada porción y la plantilla copiada consistentes.
  5. Repite los pasos 2.3 y 2.4 hasta que todas las piezas de gel se copien al papel de la escala y se numeren secuencialmente. Revisa de nuevo las cortes y sus impresiones (imágenes representativas de las cortes coronales y las impresiones en la Figura 3G,H).

4. Talla en placa acrílica

  1. Corta ranuras en la placa acrílica grande con un cuchillo de plexiglás y rompe las placas grandes en piezas de 10 x 8,5 cm.
    NOTA: El número total de piezas depende del tamaño del cerebro, el grosor deseado de la rebanada y la orientación para cortar. Generalmente, preparamos 25 piezas de placas acrílicas de 2 mm para una matriz coronal o sagital para cerebros de cerdito neonatales y 15 piezas de placas de 5 mm para cerebros más grandes para facilitar su manejo.
  2. Referencia de tres agujeros de anclaje en la placa de acrílico en las coordenadas x, y medidas desde la esquina inferior izquierda (en mm): (11, 42); (45, 15); y (88, 42).
  3. Fija las placas de acrílico con el soporte de cuadrados y abrazaderas en las esquinas en la plataforma de la taladro de columna. Taladra tres agujeros de anclaje en las coordenadas mencionadas con una broca de placa acrílica (Figura 4A). Dibuja una línea de color en el lado derecho de todas las placas para indicar la orientación.
  4. Retira la película protectora de la placa acrílica y colócala sobre la plantilla sobre el papel de escamas, alineando el borde superior de la placa acrílica con las líneas superiores de la plantilla que se copió al papel de escamas. Traza el contorno del cerebro sobre la placa acrílica con un rotulador permanente (Figura 4B). Etiqueta la matrícula de forma secuencial como en la plantilla.
  5. Corta la placa de acrílico de la sierra de cinta a lo largo de las líneas de plantilla (Figura 4C). Alternativamente, utiliza una herramienta rotativa con un kit de corte multiusos y una punta para tallar madera y eliminar las zonas no deseadas.
  6. Pule el filo cortado usando la herramienta rotatoria con una punta de lijado para pulir para alisar los bordes que deja la herramienta de corte (Figura 4D).
  7. Revisa de nuevo los cortes en las placas de acrílico contra la plantilla del papel de escala (Figura 4E). Recorta y pule si es necesario.
  8. Preensamblar la matriz apilando las placas cortadas en orden secuencial y comprueba la alineación de las placas (Figura 4F).

5. Ensamblaje y expansión de la matriz cerebral

  1. Coloca tres arandelas entre placas de acrílico, cada una centrada en un agujero de anclaje (Figura 5A). Pegádelas alrededor de los agujeros de anclaje con superpegamento en el mismo lado de todas las placas de acrílico para reducir el tiempo de montaje (Figura 5A).
  2. Apila las placas de acrílico secuencialmente, introduce tornillos de acero inoxidable por cada orificio de anclaje para montar la matriz y aprieta las tuercas para asegurar (Figura 5A).
  3. Aplica el pulido final de los bordes cortados que entrarán en contacto con los cerebros para alisar las placas.
  4. Codifica por colores la parte superior de la matriz para ayudar a identificar los pasos durante el corte. Alterna colorear los bordes superiores de la placa con negro, rojo y luego blank para formar un patrón. Repite este paso hasta que todas las placas estén codificadas por colores con el mismo patrón (Figura 5).
  5. Para ajustar la geometría o modificar el tamaño de la cavidad para adaptarse mejor a ciertos cerebros, retira o añade algunas placas de acrílico seleccionadas (Figura 5B) para adaptarlas a diferentes tamaños de cerebro, lo que aumenta considerablemente la flexibilidad de estas matrices y puede ahorrar materiales y esfuerzo.

6. Corte coronal o sagital del cerebro

  1. Envuelva un extremo de la hoja de criostato de alto perfil con cinta de laboratorio durante al menos 2 cm de longitud para proteger la mano del usuario. Coloca el cerebro de forma segura en la cavidad de la matriz. Sosteniendo el extremo envuelto de la hoja, coloca cuidadosamente la hoja entre las placas acrílicas de la matriz y luego corta el cerebro en cortes coronales o sagitales con el cerebro sostenido y asegurado con la otra mano (Figura 6A,B).
    NOTA: Precaución: 1) Dado que cada parte del cerebro tiene diferentes texturas tras la fijación de formalina, se debe tener cuidado para aplicar una presión uniforme sobre la hoja. 2) Además, el cerebro del lechón es grande, por lo que es mejor usar un movimiento de corte para cortar el cerebro que un movimiento directo de "empuje hacia abajo". 3) Es fundamental mantener el cerebro bien ajustado en la matriz con el apoyo de la otra mano durante el corte para evitar cualquier inclinación o cambio en su orientación. Se debe evitar en todo momento la presión excesiva sobre el cerebro contra la matriz.
  2. Pon todas las lonchas en un plato de 6 pozos o bandeja de acero inoxidable lleno de PBS. Coloca cuidadosamente las rebanadas en la misma orientación (Figura 6C, D) y conserva o procede según sea necesario.

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Resultados

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Un lechón fue sacrificado con sobredosis de pentobarbital a la edad de p5. Los otros tres animales mostraron actividades fisiológicas normales y un aumento de peso corporal similar (alcanzando entre 7,44 y 8,4 kg). Dos lechones recibieron una resonancia magnética semanal bajo anestesia isoflurana hasta que fueron sacrificados en p32. El cuarto lechón permaneció ingenuo hasta la eutanasia en la página 38.

La similitud en el tamaño de la cabeza entre un lechón y...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta la metodología para crear matrices cerebrales asequibles y fáciles de construir que pueden usarse para ayudar en el corte del cerebro del lechón o de cualquier otra especie de animal grande en la orientación y grosor deseados. Es importante destacar que, a diferencia de las matrices comerciales de "tamaño fijo" que solo funcionan con un rango limitado de tamaños cerebrales, este enfoque permite ajustar o expandir la matriz cómodamente para adaptarse a una amplia g...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud ( NIH) #R21-NS114771 (K.E.S.), #R56-NS117587, #R01-EB028792, #R01-HD101508, #R21-HD091118, #R41-NS122722, #R42-MH135825 (G. Y.), la American Heart Association (AHA) #16GRNT30820006 (G.Y.) y #14SDG20480186 (L.C.), y el Área Prioritaria de Investigación en Neurociencia de la Universidad de Kentucky (L.C.). Los ingenuos cerdos machos neonatales fueron adquiridos a través de la División de Recursos Animales de Laboratorio (DLAR) al Centro de Porcinos de la Facultad de Agricultura de la Universidad de Kentucky.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Rosca para máquina de celosía Phillips de acero inoxidable 1/4"-20 x 2-1/2" (25 unidades), rosca gruesa, acero inoxidable 18-8 (304), por cuenta-gotas de pernoLanzacerrojoshttps://www.amazon.com/
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Paquete de 3 3" (4,5 mm) lámina acrílica transparente de 8" x 12" fundido (0,177") AZM de tamaño nominal gruesoPantallas AZMhttps://www.amazon.com/4-5mm
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3  Acortamiento de hombros para cuñas planas  Arandela, acero inoxidable 18-8, tamaño de perno de 1/2", diámetro diámetro interior de 0,501", diámetro exterior de 0,750", grosor de 0,016" (paquete de 50)Partes Pequeñashttps://www.amazon.com/Shoulder-
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Tinta Indiaspeedball SUPER NEGRO
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Cinta de laboratorioavantor76276-016
Loctite 1363589 botella de 4 gramos Super Glue Ultra Gel Control Adhesive, pack de 3Loctitehttps://www.amazon.com/Loctite-
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Aceite mineralSigma-AldrichM8410-100ml
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Pulir y lijarBrocas de muela de carburo de 20 piezas de 1/8"
Plétulos pre-arranque no mediáticos - #50 (Pipestone)PipestoneSKU  8228https://pipevet.com/pre-starter-pellet-non-med-50-hubbard
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Bandeja quirúrgicaavantor10193-194
hielo húmedoFabricado en laboratorio
Punta de carvign de maderaHerramientas de tallado en madera para herramienta rotativahttps://www.amazon.com/
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Referencias

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