Artículo de método

Imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica

DOI:

10.3791/68644

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28 de octubre de 2025

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1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El blanqueo iterativo espectral extiende la multiplexidad (IBEX) se basa en la técnica IBEX base al agregar bloqueo de heparina para minimizar la unión inespecífica y aprovechar la detección espectral con desmezcla computacional para suprimir la autofluorescencia. Este enfoque acelera la adquisición de imágenes al tiempo que reduce las fuentes de fondo, lo que permite análisis proteómicos espaciales robustos de múltiples rondas y altos parámetros.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las imágenes altamente multiplexadas permiten el estudio de células funcionalmente diversas y sus nichos dentro de sus entornos de tejidos nativos. El blanqueamiento iterativo extiende la multiplexidad (IBEX) es una técnica de inmunomarcaje cíclico e inactivación de fluoróforos que permite visualizar múltiples marcadores en la misma sección de tejido. Las imágenes capturadas se pueden analizar posteriormente para adquirir datos de una sola célula para definir grupos de células, sus localizaciones y tipos de células vecinas. La interpretación de estos datos se basa en la capacidad de distinguir las expresiones de marcadores reales de las fuentes de fondo inherentes a la microscopía de fluorescencia. Spectral IBEX, una adaptación del protocolo IBEX, integra la detección confocal espectral con la desmezcla computacional e incorpora el bloqueo de heparina para reducir la unión fuera del objetivo basada en la carga. Esta combinación mejora la relación señal-fondo, suprime la autofluorescencia tisular y minimiza el sangrado, al tiempo que reduce el tiempo de adquisición en comparación con las imágenes confocales multipista convencionales. La aplicación al tejido de pólipos nasales humanos, un modelo caracterizado por un alto contenido de eosinófilos y una fuerte autofluorescencia, demostró imágenes confiables de 26 marcadores en compartimentos estructurales, inmunológicos y de estado celular durante seis rondas de imágenes. El flujo de trabajo resultante genera información proteómica de alta dimensión y resuelta espacialmente que captura la arquitectura tisular compleja y los nichos celulares. En conjunto, este enfoque optimizado proporciona una estrategia sólida y ampliamente aplicable para imágenes multiplexadas, particularmente adecuada para tejidos donde la autofluorescencia y la tinción no específica limitan los enfoques convencionales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tejidos están compuestos por un conjunto diverso de células con funciones especializadas que se organizan en estructuras tridimensionales y, a través de la interacción, coordinan los procesos biológicos que son necesarios para la vida. La patología surge cuando las alteraciones en la composición celular o la arquitectura tisular interfieren con estas interacciones y comprometen la homeostasis tisular1. Se requiere conocimiento de cómo los numerosos tipos de células especializadas se localizan e interactúan dentro de nuestros tejidos para comprender la biología que subyace a la salud y la enfermedad humanas.

Los avances en las tecnologías de perfiles unicelulares a nivel transcriptómico, epigenómico y proteómico han descubierto una diversidad excepcional de tipos de células especializadas. 2,3 Tecnologías como la secuenciación de ARN unicelular y la citometría de flujo espectral pueden medir el número de parámetros necesarios para caracterizar estas poblaciones heterogéneas. Sin embargo, estos enfoques carecen de información espacial, ya que las células deben disociarse de su entorno tisular nativo en suspensiones unicelulares 4,5. Como tal, se han identificado tipos de células asociadas con varios contextos de enfermedad, pero sus interacciones dentro del tejido y su contribución a la perpetuación de la enfermedad siguen sin estar claras.

Para abordar algunas de estas limitaciones, se han desarrollado varias tecnologías espacioómicas para capturar la heterogeneidad celular dentro de un tejido y al mismo tiempo preservar la posición de cada célula6. Por ejemplo, la transcripción de genes se puede medir amplificando el ARN en puntos rasterizados en una sección de tejido (por ejemplo, Visium) o mediante el uso de sondas de hibridación de ARN dirigidas a un panel de genes específicos que se visualizan con resolución de una sola célula (por ejemplo, Xenium)7,8. Estos métodos son efectivos para rastrear patrones transcripcionales y mecanismos reguladores dentro de los tejidos. Sin embargo, los perfiles transcripcionales a menudo se correlacionan mal con la expresión de proteínas, lo que refleja más directamente las capacidades funcionales de una célula9. La expresión de proteínas se puede identificar utilizando anticuerpos específicos conjugados con fluoróforos, que pueden detectarse mediante microscopía de fluorescencia10,11. El uso de la microscopía de fluorescencia tradicional puede permitir obtener imágenes discretas de más de seis de estos fluoróforos conjugados con anticuerpos. Sin embargo, los perfiles de excitación y emisión superpuestos de estos fluoróforos dan lugar a incertidumbre en cuanto al origen de la señal de fluorescencia en cualquier canal12 dado.

El blanqueo iterativo extiende multipleXity (IBEX) es un método de imagen de alto contenido que se desarrolló para superar esta limitación de la microscopía de fluorescencia 13,14,15. IBEX utiliza borohidruro de litio (LiBH4) para inactivar químicamente los fluoróforos después de la obtención de imágenes, lo que permite volver a teñir la misma muestra de tejido con una ronda posterior de anticuerpos conjugados con fluoróforos antes de la nueva imagen. IBEX preserva la integridad del tejido, lo que permite muchas rondas de imágenes para visualizar un número teóricamente ilimitado de marcadores en la misma sección de tejido. La alineación computacional de las imágenes adquiridas proporciona una caracterización a nivel ómico con una resolución de una sola célula al tiempo que preserva los datos espaciales para revelar nichos celulares. Estos datos también pueden revelar interacciones celulares putativas, aunque estas deben validarse utilizando otras técnicas16. IBEX es un método de código abierto que es compatible con los fluoróforos disponibles comercialmente y cuenta con el apoyo de una comunidad internacional de investigadores que han validado los reactivos y comparten datos públicamente para promover la accesibilidad, la adopción rápida y la generación de datos de alta calidad17,18.

En este trabajo, se ha diseñado un protocolo modificado de IBEX para superar dos desafíos principales de la técnica: la autofluorescencia tisular y la unión no específica de sondas de anticuerpos conjugados con fluoróforos (denominadas colectivamente como fondo). La autofluorescencia surge cuando la excitación de moléculas fluorescentes endógenas a un tejido emite luz que se superpone con la señal deseada obtenida de fluoróforos conjugados con anticuerpos 19,20. La unión fuera del objetivo o no específica de anticuerpos conjugados con fluoróforos da como resultado fluorescencia de células o estructuras que no expresan la proteína diana 21,22. Estos artefactos pueden dar lugar a la conclusión inexacta de que una célula expresa un marcador que no expresa realmente, lo que complica los análisis computacionales y la asignación precisa del tipo de célula. Al combinar la neutralización de carga basada en heparina de la señal fuera del objetivo con la adquisición espectral completa y la desmezcla computacional, el IBEX espectral reduce notablemente el sangrado, mejora la relación señal-fondo (SBR) y reduce a la mitad el tiempo de adquisición por ronda.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tejidos de pólipos nasales utilizados en este estudio se recolectaron durante la cirugía de los senos paranasales en Hamilton Health Sciences con la aprobación ética de la Junta de Ética de Investigación Integrada de Hamilton. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes.

1. Recogida de muestras

  1. Obtener muestras durante los procedimientos de polipectomía de rutina realizados en pacientes con rinosinusitis crónica. Tras la extracción quirúrgica, coloque las muestras en un vial que contenga solución salina médica en hielo para su transporte y procéselas inmediatamente para obtener imágenes para preservar la integridad del tejido.

2. Preparación del reactivo

  1. Prepare la solución de fijación y permeabilización diluyendo la solución de fijación y permeabilización obtenida a 1:4 en PBS. Prepare la solución de criopreservación como sacarosa al 30% en PBS. Prepare el tampón de dilución como Triton X-100 al 0,1% v/v en PBS.
  2. Preparar el reactivo de bloque BSA como albúmina sérica bovina al 1% p/v en tampón de dilución. Prepare el reactivo del bloque de heparina como sal de heparina sódica 10KU en 1 ml de PBS. Prepare el tampón de bloqueo mezclando el reactivo de bloque de heparina (1:50) con el reactivo de bloque Fc (1:100) en el reactivo de bloque BSA.
  3. Preparar la mezcla de tinción como anticuerpo titulado en diluciones apropiadas en tampón de bloqueo. Prepare la solución blanqueadora agregando 10 mg de LiBH4 en 10 ml de agua ultrapura.

3. Procesamiento y macroscopía de tejidos

  1. Inspeccione el tejido bajo un microscopio de disección (generalmente con un aumento de ~ 15x, aunque esto puede variar según la muestra y el microscopio) y elimine la grasa y el hueso con fórceps y un bisturí. Para preservar mejor el tejido, use instrumentos limpios, trabaje sobre una superficie fría y húmeda y minimice la duración del procesamiento.
  2. Los tejidos macroscópicos > 0,5 cm de grosor en rodajas de 4-5 mm con un bisturí23. Sumerja las rodajas en una solución de fijación y permeabilización y gírelas a °C durante 16 h.
    NOTA: El volumen de esta solución y las demás en el paso 3.3 debe ser aproximadamente 20 veces el volumen de la muestra, en un tubo del tamaño adecuado.
  3. Mueva el pañuelo a PBS y enjuague durante 5 min. Sumerja el tejido en una solución de criopreservación e incube a °C durante 16 h. No se lave después de este paso, ya que esto reintroduciría agua en el tejido.

4. Congelación de tejidos

  1. Etiquete una placa de 6 pocillos con los detalles del experimento y la muestra encima de cada pocillo y colóquela en un congelador a -20 °C para que se enfríe durante al menos 20 min.
  2. Llene un criomold del tamaño adecuado con compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Evite crear burbujas en la OCT. Arrastre las burbujas grandes a los bordes del criomold con una aguja o una punta de pipeta.
    NOTA: Se puede hacer un criomold con papel de aluminio envuelto alrededor de un pequeño frasco o tubo de fondo plano.
  3. Retire el tejido de la solución de criopreservación. Frote suavemente el pañuelo en una toallita de papel sin pelusa para eliminar el exceso de líquido, ya que esto puede comprometer la congelación.
  4. Llene un vaso de precipitados de 250 ml con aproximadamente 100-150 ml de isopentano en una campana extractora y colóquelo en una caja de espuma o hielera parcialmente llena de nitrógeno líquido.
    NOTA: El isopentano se evapora si se deja abierto durante más de 2 h; Úselo inmediatamente después de abrirlo. El isopentano facilita la congelación uniforme y rápida del tejido. El isopentano puede congelarse lentamente con el tiempo. Si se congela, retire el vaso del nitrógeno líquido y deje que se descongele. El isopentano se puede verter en una botella de vidrio con tapa para reutilizarlo hasta 5 veces. El nivel de isopentano debe ser más alto que el nitrógeno líquido para evitar que el vaso de precipitados flote o se vuelque.
  5. Ajuste la orientación del tejido como desee dentro de la OCT bajo un microscopio de disección.
    NOTA: Para los tejidos de pólipos nasales, generalmente orientamos la muestra a lo largo de su eje largo para obtener secciones simétricas que capturen el área de sección transversal más grande posible. Consulte los manuales de histología para conocer el tejido de interés para una orientación óptima de la inclusión.
  6. Sumerja la parte inferior del criopol en el isopentano. Retire el criomold del isopentano cuando el centro del tejido esté completamente blanco y opaco. Evite sumergir completamente el criomolde; El bloque puede agrietarse, comprometiendo la sección.
  7. Saque suavemente el bloque del criomulto aplicando presión en la parte posterior y colóquelo en la placa de 6 pocillos preenfriada a -20 °C. Después de congelar todas las muestras, transfiera la placa a un congelador a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: Este es un punto de pausa. Los tejidos se pueden almacenar a -80 °C durante años.

5. Preparación de portaobjetos y criosección

  1. Pipetear 10-1 μL de adhesivo de gelatina de cromo alumbre en portaobjetos; Extender uniformemente y secar al aire durante 15 min. Para una adhesión óptima, aplique adhesivo de gelatina de cromo alumbre a los cubrevasos con cámara 2x-3x, añadiendo 5 μL por aplicación (total 15 μL).
  2. Después del secado, coloque los portaobjetos en un horno a 80 °C durante 1 h para garantizar un secado completo. Si usa un cubreobjetos con cámara, déjelo secar a 37 °C durante la noche, ya que el plástico puede derretirse a 80 °C.
    NOTA: Una vez que los portaobjetos están recubiertos y secos, se pueden almacenar a temperatura ambiente durante días hasta que se utilicen. Deben cubrirse para evitar el polvo.
  3. Transfiera los tejidos de -80 °C a -20 °C (o al criostato a la temperatura de corte) para equilibrarlos y enfríe previamente durante 1 h antes de seccionarlos. Corte secciones de 10-2 μm en un criostato24.
    1. Si se secciona en una cubierta de vidrio con cámara, recoja suavemente la sección con fórceps después de levantar la placa antivuelco. Usa un pincel para colocarlo plano sobre el vidrio dentro de la cámara. Presione el pulgar debajo de la muestra en la parte inferior del cubreobjetos para derretir la sección sobre el vidrio.
  4. Secar los portaobjetos a 3 °C durante 1 h o a temperatura ambiente durante 24 h.
    NOTA: Si los portaobjetos se usan inmediatamente, se pueden almacenar temporalmente a temperatura ambiente en una caja de portaobjetos para protegerlos del polvo mientras se preparan para las manchas. Sin embargo, si no se usan de inmediato, guárdelos a -80 ° C para preservar la integridad del tejido. Este es un punto de pausa. Si los portaobjetos se almacenan a -80 °C, el proceso se puede pausar aquí.

6. Bloqueo e inmunomarcaje de anticuerpos

  1. Dibuje un círculo en el vidrio alrededor del tejido con un bolígrafo PAP para crear una barrera hidrofóbica que contenga el líquido durante la tinción u otros pasos. No dibuje sobre la OCT, ya que la tinta hidrofóbica se lavará cuando la OCT se disuelva.
    NOTA: Este paso no es necesario para el vidrio de cubierta con cámara, ya que las paredes retienen el líquido en el pozo.
  2. Agregue ~ 100 μL de PBS a cada tejido e incube durante ~ 2 min a temperatura ambiente para rehidratar los tejidos y lavar la OCT. Use ~ 1 ml de PBS para cubrir el vidrio con cámara.
    NOTA: Para evitar que el tejido se levante del vidrio, no pipetee el líquido directamente sobre la muestra.
  3. Aspire el PBS y agregue 100 μL del tampón de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente en una cámara de humedad cubierta durante 1 h. Utilice ~400 μL de tampón de bloqueo para el vidrio de cubierta con cámara.
  4. Aspire el tampón de bloqueo y agregue 100 μL de la mezcla de tinción. Incubar en una cámara de humedad cubierta, colocada dentro del refrigerador (4 ° C) durante la noche. Utilice ~400 μL de la mezcla de tinción para cubrir el vidrio con cámara. Prepare secciones teñidas con solo uno de los fluoróforos del panel, y un control negativo sin manchas, para definir el espectro de los fluoróforos y la autofluorescencia de los tejidos.
    NOTA: Las diluciones de anticuerpos deben optimizarse experimentalmente ajustando a 1:50, 1:100 y 1:200, u otra dilución según sea necesario. Elija la cantidad mínima de anticuerpo que producirá la señal óptima. Apunte a que las intensidades de todos los anticuerpos en el panel sean aproximadamente equivalentes para maximizar la efectividad de la desmezcla espectral. Proteja las muestras de la luz más allá de este paso para minimizar el fotoblanqueo de los fluoróforos.
  5. Aspirar la mezcla de tinción y lavar 3 veces con PBS (10 μL, 2 min cada uno), aspirando líquido entre cada lavado. Use ~ 1 ml de PBS para el vidrio de cubierta con cámara.
  6. Agregue ~ 10 μL de medios de montaje a cada sección. Pipetee lentamente para evitar burbujas de aire que crearán aberraciones ópticas durante la obtención de imágenes. Aspira las burbujas que se formen con una pipeta. Para el vidrio de cubierta con cámara, agregue 1 ml de medio de montaje a cada pocillo.
    NOTA: Los siguientes pasos, 6.7 y 6.8, no son necesarios para el vidrio de cubierta con cámara.
  7. Coloque suavemente el cubreobjetos n.º 1 de 22 mm x 50 mm sobre la muestra.
    NOTA: Las burbujas se pueden minimizar presionando firmemente un extremo del cubreobjetos sobre el medio de montaje y permitiendo que el vidrio caiga sobre la muestra, esparciendo el medio de manera uniforme. El grosor del vidrio de cobertura debe coincidir con las especificaciones de la lente del objetivo (por ejemplo, cubreobjetos # 1.5 para la mayoría de los objetivos de apertura numérica alta). Si la lente del objetivo tiene un collar de corrección, asegúrese de que esté ajustado al tamaño correcto del cubreobjetos. El uso de un grosor o una configuración de cuello incorrectos puede causar aberración esférica y dar como resultado imágenes borrosas o distorsionadas.
  8. Voltee la corredera y presione suavemente sobre una toallita sin pelusa para expulsar el exceso de medio de montaje.
    NOTA: Evite empujar hacia abajo con demasiada fuerza sobre la corredera. La fuerza excesiva puede dañar o deformar el tejido, lo que podría afectar la alineación entre las rondas de imágenes.

7. Configuración del microscopio e imágenes

NOTA: Este protocolo se refiere específicamente al ZEISS LSM980 y otros sistemas ZEISS. Estos pasos pueden ser diferentes en otros sistemas. Se detallan dos flujos de trabajo: confocal tradicional + desmezcla (adquisición multipista con desmezcla espectral computacional post hoc), que se puede utilizar cuando no se dispone de un detector espectral, pero que tiene tiempos de adquisición más largos y algo de sangrado residual; y detección espectral completa (adquisición espectral de 34 canales de un solo paso), nuestro método preferido, ya que proporciona la mejor SBR, diafonía casi nula y tiempos de imagen más rápidos.

  1. Microscopía confocal tradicional
    1. Encienda el sistema de microscopio (incluidos los láseres, los detectores y la computadora) aproximadamente 30 minutos antes de la obtención de imágenes.
    2. En la pantalla de control del microscopio a la que se accede haciendo clic en Microscopio > objetivos, seleccione la lente del objetivo adecuada (por ejemplo, 20x 0,8 NA) y límpiela con una toallita segura para lentes si es necesario.
    3. Monte la muestra de forma segura en la platina. Intente alinear el vidrio o la cámara de vidrio de la cubierta contra la misma esquina / extremo del soporte de la diapositiva para facilitar la alineación X-Y de rondas consecutivas. Esto dependerá del soporte instalado.
    4. Concéntrese en la muestra usando los oculares en la iluminación GFP, YFP o RFP, luego cambie a la pestaña Adquisición en la pantalla de la computadora.
      NOTA: No utilice el filtro DAPI cuando enfoque la muestra con los oculares porque la exposición de la tinción DAPI a la luz ultravioleta (utilizando el cubo del filtro DAPI) hará que se fotoconvierta en una molécula verde fluorescente (Figura complementaria 1A).
    5. Configure pistas de imágenes que minimicen la superposición y la excitación cruzada del láser (la Tabla complementaria 1, la Tabla complementaria 2 informa la configuración de adquisición para los experimentos de microscopía confocal tradicionales que se muestran aquí).
      NOTA: Las combinaciones ideales implican distintos picos de excitación y emisión, como DAPI o AF488 junto con AF594, AF647 o AF700.
      1. Asigne los láseres de excitación óptimos para cada pista. Ajuste el tamaño del orificio a 1 AU o Airy Unit para cada pista para un corte óptico óptimo.
      2. Ajuste el rango de longitud de onda de adquisición para cada detector sintonizable en la pista por separado, de acuerdo con los fluoróforos de la pista.
      3. Ajuste la potencia del láser y la configuración de ganancia del detector para maximizar el SBR. Asegúrese de que muy pocos píxeles, si los hay, alcancen la intensidad máxima.
        NOTA: Para evitar el fotoblanqueo y/o la sobreexposición de los detectores, mantenga la potencia del láser lo más baja posible. Optimice las diluciones de anticuerpos para que se detecte una señal fuerte por encima del fondo.
    6. Presione el botón Modo de escaneo continuo para obtener una vista previa de la muestra y configurar los parámetros de escaneo (velocidad de escaneo, resolución y promedio si es necesario).
      NOTA: Para mosaicos pequeños y para minimizar el fondo, se recomienda un tiempo de permanencia entre 0,2 y 0,3 μs, con 1 o 2 rondas de promedio. Para maximizar la velocidad y preservar la segmentación y la resolución de una sola celda, utilice la velocidad de escaneo más rápida sin promedio y un tamaño de píxel de 0,2-0. μm/píxel. Por ejemplo, la creación de imágenes a 2048 x 2048 píxeles por mosaico con un objetivo de 20x/0,80 NA produce 0,20 μm/píxel en un campo de 424,26 x 424,2 μm2.
    7. Realice escaneos de prueba para cada pista para verificar si hay diafonía o sangrado.
      1. En el portaobjetos teñido con todos los marcadores, en el modo de escaneo continuo, inicie cada láser a baja potencia y levántelo solo hasta que el marcador sea claramente visible sin saturación (use el indicador LUT/saturación).
        NOTA: Si es posible, se recomienda utilizar una muestra replicada o una región no deseada para optimizar la configuración del microscopio antes de obtener imágenes de la muestra experimental. Esto es especialmente importante cuando se tiñe con DAPI (para evitar el riesgo de fotoconversión) o fluoróforos que fotoblanquean rápidamente (por ejemplo, PE).
      2. Pase al control de tinción única para ese fluoróforo. Ajuste la potencia del láser y la ganancia del detector para que la señal sea brillante e insaturada.
      3. En el mismo portaobjetos de una sola tinción, escanee todos los demás canales de detección. Si la intensidad fuera del canal excede el fondo, reduzca la ventana de detección y/o reduzca la excitación/ganancia.
      4. Repita 7.1.7.1-7.1.7.2 para cada fluoróforo. Después de cualquier ajuste, verifique brevemente las tinciones previamente optimizadas para mantener intensidades comparables, especialmente para marcadores que se colocalizan.
    8. Habilite la función Mosaicos y defina una región de adquisición de mosaicos.
      1. Optimice el enfoque para la región de adquisición de baldosas en el centro del tejido. Encuentre una característica única (un conjunto de celdas en una disposición determinada) como referencia para la alineación en rondas posteriores.
    9. Habilite la función Z-stack y vaya a la pestaña Z-stack. Vaya a la pestaña Centro. Establezca el número de cortes en la pila Z en al menos 6, con un intervalo de al menos 1 μm entre cortes. A continuación, haga clic en el botón Centrar para colocar el punto de enfoque actual (determinado en el paso 6.1.8.1) como el segmento central de la pila.
    10. Haga clic en el botón Iniciar experimento para comenzar a adquirir las imágenes. Guarde la configuración de adquisición y haga una copia de seguridad de los datos de la imagen haciendo clic con el botón derecho en la miniatura de la imagen y seleccionando Guardar como. A continuación, elija la ubicación del archivo y asigne un nombre a la imagen.
    11. Desmezcle la imagen utilizando la misma configuración optimizada de la adquisición de la región en mosaico, capture un Snap de cada control de tinción única para obtener el espectro de señal real y del control sin teñir para capturar el fondo/autofluorescencia, preparado en el Paso 6.4.
      1. Estas imágenes se utilizan para la desmezcla espectral; No seleccione la señal verdadera de las muestras multiplexadas. Confirme que la región seleccionada realmente representa la señal asegurándose primero de que la intensidad/morfología esté ausente o sea equivalente al fondo en el control sin teñir y luego haciendo coincidir la localización esperada del marcador (p. ej., membrana frente a núcleo, citoplasma frente a patrones secretados).
      2. Abra la imagen instantánea. Haga clic en la pestaña Desmezcla . Utilice una de las herramientas de selección de pasajes en la pestaña Herramientas de desmezcla para dibujar un ROI alrededor de la señal positiva (aparecerá un espectro de esa región). Repita esto para cada imagen instantánea de cada fluoróforo para crear espectros de referencia para la desmezcla.
        1. Compare este espectro con el espectro teórico del fluoróforo para asegurarse de que la región seleccionada sea representativa de la señal real. Asigne un nombre al espectro de acuerdo con cada fluoróforo y guárdelo en la base de datos espectral.
          NOTA: Se puede identificar un espectro para la autofluorescencia y tratarlo como un fluoróforo separado para desmezclarlo de otras señales. Tras la optimización completa del panel, no es necesaria la adquisición de nuevas referencias, ya que se pueden reutilizar los mismos ajustes siempre que se utilice el mismo protocolo y tipo de tejido.
      3. Cargue la imagen en mosaico y navegue hasta la herramienta Desmezclar. Utilice el botón + para agregar los espectros de referencia para cada fluoróforo a la lista de desmezcla, luego haga clic en el botón Desmezcla lineal .
    12. Guarde la imagen sin mezclar para su posterior análisis.
      NOTA: La salida es una imagen en varios mosaicos con un canal para cada marcador. El experimento se puede pausar aquí antes de continuar.
    13. Adquisición de imagen de referencia de sombreado
      1. Utilizando exactamente la misma configuración utilizada para obtener imágenes de la muestra, adquiera una imagen de un portaobjetos de calibración DAPI. Guarde la imagen y, a continuación, extraiga solo el canal DAPI para que sirva como referencia de sombreado. La salida es una imagen de campo plano (Figura complementaria 1B).
        NOTA: No es necesario adquirir una imagen de referencia para cada muestra. Siempre que se utilice el mismo instrumento con los mismos ajustes, la referencia debe ser la misma. No es necesaria esta referencia si las imágenes adquiridas no tienen artefactos de sombreado, como se muestra en la Figura complementaria 1C.
  2. Microscopía confocal espectral
    1. Encienda el sistema de microscopio (incluidos los láseres, los detectores y la computadora). Seleccione la lente del objetivo adecuada (por ejemplo, 20x 0,8 NA o cualquier otro objetivo) y límpiela si es necesario.
    2. Monte la muestra de forma segura en la platina. Asegúrese de que el cubreobjetos esté orientado hacia el objetivo.
    3. Concéntrese en la muestra usando campo claro o DIC, luego cambie al modo de fluorescencia. Configure la adquisición espectral. La Tabla complementaria 3 informa la configuración de adquisición para los experimentos de microscopía confocal espectral que se muestran aquí.
      1. Asigne los láseres correctos.
        NOTA: Algunos láseres pueden excitar múltiples fluoróforos. Por lo tanto, puede que no sea necesario tener un láser único para cada fluoróforo.
      2. Seleccione un divisor de haz apropiado para las líneas láser que se están utilizando. Permita que todos los detectores capturen la mayor cantidad posible del espectro. Ajuste el tamaño del orificio a 1 AU para un corte óptico óptimo.
    4. Optimizar el ajuste del láser
      1. Usando una sección teñida con todos los marcadores, inicie el modo de escaneo continuo con láseres a baja potencia. Ajuste la intensidad de cada láser hasta que se puedan identificar los marcadores con un buen SBR.
        NOTA: Si bien esto no permitirá un ajuste preciso para los fluoróforos espectralmente superpuestos, ayudará a minimizar la cantidad de veces que los portaobjetos de tinción única deben cambiarse al microscopio.
      2. Utilice secciones de tinción única para ajustar las intensidades del láser para cada fluoróforo. Cambie iterativamente de secciones de tinción única a la sección con todos los marcadores hasta que la señal de cada marcador se pueda visualizar sin sobresaturación.
        NOTA: Cada vez que se ajuste un ajuste de intensidad o ganancia del láser, vuelva a visitar los portaobjetos de una sola tinción previamente optimizados para asegurarse de que la señal siga siendo óptima. Para una desmezcla más óptima, los niveles de intensidad de la señal deben ser lo más similares posible entre los marcadores, especialmente entre los marcadores que se colocalizan. Si es posible, se recomienda utilizar una muestra replicada o una región no deseada para optimizar la configuración del microscopio antes de obtener imágenes de la muestra experimental. Esto es especialmente importante cuando se tiñe con DAPI (para evitar el riesgo de fotoconversión) o fluoróforos que fotoblanquean rápidamente (por ejemplo, PE).
    5. Realice los pasos 7.1.8 a 7.1.14.

8. Extracción del cubreobjetos (solo se aplica a portaobjetos, no a la cubierta de vidrio con cámara)

  1. Sumerja la corredera en PBS y deje que el cubreobjetos se desprenda. No intente forzar el cubreobjetos, ya que esto puede deformar el tejido, causando problemas de alineación en rondas de imágenes posteriores o desprendimiento completo del portaobjetos. Use un recipiente lo suficientemente grande como para que quepa el portaobjetos y asegúrese de que pueda sumergirse completamente en PBS.

9. Blanqueo y ciclo de fluoróforos

  1. Solo para cubreobjetos con cámara: Aspirar la mayor cantidad posible de medios de montaje con una pipeta, teniendo cuidado de no dañar el tejido.
    NOTA: Inclinar la cámara hacia un lado puede facilitar la aspiración.
  2. Lave 3 veces con ~1 ml (cubreobjetos con cámara) o ~100 μl (portaobjetos) de PBS durante 2 minutos hasta que el medio de montaje se retire por completo.
  3. Prepare la solución blanqueadora en la campana extractora. Pesar 10 mg de LiBH4 directamente en un vaso de precipitados seco con una microespátula. Agregue con cuidado 10 ml de agua ultrapura directamente en el vaso de precipitados que contiene LiBH4 y mezcle hasta que se disuelva por completo para hacer la solución blanqueadora.
    NOTA: Prepárelo inmediatamente antes de usarlo para obtener la máxima reactividad.
    PRECAUCIÓN: LiBH4 es extremadamente inflamable, por lo que este paso requiere un cuidado extremo: asegúrese de que la campana extractora se use correctamente (es decir, hoja a la altura adecuada, EPP adecuado, etc.) y solo trabaje con <10 mg de LiBH4 a la vez. Asegúrese de que el vaso de precipitados esté completamente seco antes de agregar LiBH4, ya que si no lo hace, puede provocar un incendio.
  4. Agregue ~ 100 μL de solución blanqueadora, con una pipeta Pasteur de vidrio, a cada sección de tejido e incube a temperatura ambiente en la campana extractora durante 15 min. Use 2 ml de solución blanqueadora para portaobjetos de cámara.
  5. Si blanquea tintes BV (por ejemplo, BV421, BV510, etc.), mueva con cuidado el pocillo a un microscopio epifluorescente. Seleccione el filtro DAPI, enfoque la muestra e ilumínela a plena potencia.
    1. Utilice el objetivo 5x para un mayor campo de iluminación. Baje el escenario lo más bajo posible para evitar daños a los objetivos y la carcasa.
  6. Decantar la solución de LiBH4 fuera del pocillo con una pipeta Pasteur de vidrio y volver a añadirla al vaso de precipitados de la solución de LiBH4 .
    NOTA: Esto ahora es LiBH4 de desecho; La solución no se puede almacenar para uso futuro.
  7. Lave los portaobjetos 3 veces con tampón de dilución e incube durante ~ 3 min. El volumen total es de 2 ml para los portaobjetos de la cámara.
  8. Agregue la mezcla de anticuerpos y tiñe según el protocolo normal (pasos 6.3 a 6.8).
  9. Añadir 2N H2SO4 gota a gota al LiBH4 de desecho en la campana extractora, mezclando regularmente.
    PRECAUCIÓN: LiBH4 burbujeará agresivamente. Estas burbujas son gas H2 que se libera del LiBH4; El H2 es muy inflamable, así que tenga mucho cuidado en este paso y agregue H2SO4 muy lentamente.
  10. Viértalo en una almohadilla absorbente cuando la solución ya no burbujee. Enjuague el vaso de precipitados con agua ultrapura y viértalo en la almohadilla absorbente.
    PRECAUCIÓN: Coloque la almohadilla absorbente en una bolsa de riesgo químico / biológico, asegúrela y deséchela de acuerdo con las pautas locales de peligro químico.

10. Procesamiento posterior a la adquisición de imágenes

  1. Abra la imagen de referencia (desde el paso 7.1.14) en el software Zen haciendo clic en Archivo > Abrir > Seleccionar imagen de referencia.
    NOTA: Los pasos de procesamiento de imágenes posteriores a la adquisición se pueden realizar alternativamente en paquetes de software de código abierto. (por ejemplo, ImageJ).
  2. Ajuste el brillo y el contraste para optimizar el rango dinámico haciendo clic en Procesamiento > Intensidad > Contraste Estirar > Aplicar > automático.
  3. Cambie el tipo de píxel a 32 bits haciendo clic en Procesamiento > imagen > Convertir tipo de píxel > 32 bits (flotante).
  4. Normalice la imagen de referencia haciendo clic en Procesamiento > Intensidad > Normalizar (píxeles saturados = 0%) > Aplicar.
  5. Suaviza la imagen de referencia haciendo clic en Procesamiento > Suavizar > gaussiano > ingresa el radio (por ejemplo, 2-5 px) > Aplicar (Figura complementaria 1B).
    NOTA: Optimice el radio de desenfoque gaussiano probando diferentes valores. Para conocer el valor correcto, divida (Proceso > Calculadora de imágenes) la imagen de referencia sin procesar por la imagen procesada y la imagen resultante debe tener una intensidad uniforme (todos los píxeles aproximadamente el mismo valor).
  6. Abra la imagen de varios mosaicos que se va a corregir haciendo clic en Archivo > Abrir > seleccione la imagen de varios mosaicos.
  7. Aplique la corrección de costura y sombreado utilizando la referencia procesada haciendo clic en Procesamiento > Costura con los siguientes parámetros.
    1. Marque la casilla de mezcla. Marque la casilla de sombreado correcta y, en el menú desplegable, elija la imagen de referencia procesada (paso 10.5). Mantenga todos los demás parámetros iguales.
      NOTA: Es posible que sea necesario ajustar los parámetros para obtener los mejores resultados.
    2. En el menú Entrada/Salida, elija la imagen de varios mosaicos como entrada y la referencia de sombreado como referencia.
    3. Presione el botón Aplicar en la parte superior y se generará una nueva imagen con costuras y sombreados corregidos (Figura complementaria 1D).
      NOTA: La corrección de unión (Figura complementaria 1I-J) es necesaria para garantizar la precisión de la alineación de la imagen más adelante en el proceso.
    4. Guarde la imagen corregida haciendo clic en Archivo > Guardar > Seleccionar carpeta.

11. Alineación de imágenes

  1. Convierta las imágenes procesadas desde cualquier formato en el que se encuentren (.czs, .tif, etc.) al formato Imaris utilizando la herramienta Imaris File Converter.
    NOTA: La herramienta se puede descargar e instalar siguiendo las instrucciones de este sitio web (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
  2. Inicie la herramienta de registro de extensiones de Imaris para registrar (alinear) las imágenes de todas las rondas en una sola imagen con todos los canales.
    NOTA: Para instalar la herramienta y alinear correctamente las imágenes, siga las instrucciones del siguiente sitio web (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
  3. Haga clic en el botón Extensiones de Imaris . Seleccione Utilidades SimpleITK > Exportar configuración de canal a CSV.
  4. Haga clic en Examinar, navegue hasta una imagen .ims (de una de las rondas), selecciónela y haga clic en Abrir.
  5. Haga clic en Exportar y elija una ubicación para guardar el archivo CSV. Introduzca un nombre y haga clic en Guardar.
  6. Abra el archivo CSV guardado y verifique que los nombres de los canales sean correctos. Edite si es necesario.
  7. Si se realizan ediciones, vaya a Extensiones de Imaris > Utilidades de SimpleITK > Configurar ajustes de canal por lotes.
    NOTA: Este paso no es necesario si no se realizaron ediciones en el paso anterior.
  8. Haga clic en Examinar, navegue hasta el archivo CSV, selecciónelo y haga clic en Abrir. Haga clic en Siguiente, luego en Examinar de nuevo para seleccionar la misma imagen .ims y haga clic en Abrir.
  9. Haga clic en Configurar para aplicar los cambios. Repita los pasos 11.3-11.8 para todas las imágenes de diferentes rondas.
  10. Una vez que los canales estén correctamente nombrados, vaya a Extensiones de Imaris > Algoritmos SimpleITK > Registro afín de Z-Stacks usando un canal común.
  11. Haga clic en Examinar, navegue hasta la carpeta que contiene todas las rondas, seleccione todas las imágenes y haga clic en Abrir.
  12. Haga clic en Siguiente, seleccione el canal de registro (canal fiducial). Para este protocolo, se utilizó el canal DAPI. Luego elija la imagen fija.
    NOTA: Elija un canal/marcador que permanezca constante en todas las rondas y que sea resistente al blanqueo químico o al fotoblanqueo (por ejemplo, tintes nucleares como DAPI). Luego elija la imagen fija.
  13. Haga clic en Configuración de registro avanzada, marque todas las casillas excepto Máscara automática y establezca sigma de suavizado gaussiano en 5.0.
  14. Haga clic en Listo y, a continuación, en Registrarse para realizar la alineación. Una vez completado el registro, haga clic en Volver a muestrear y Guardar imagen combinada.
  15. Después del remuestreo, seleccione el canal fiducial y haga clic en Calcular correlación. Los archivos de salida incluyen una imagen output.ims alineada, dos archivos PDF que muestran la calidad de la alineación antes y después del registro, un archivo JSON que contiene la configuración utilizada para el registro y un archivo TXT con el registro de todo el proceso.

12. Alineación de imágenes

  1. Segmentar celdas/objetos usando CellPose (v2.5)25
  2. Para cada conjunto de datos de tinción única, genere una máscara de segmentación desde el propio canal de detección del marcador (Ejemplo: Para la tinción única CD20, genere la máscara desde el canal de detección AF488 (el canal previsto para CD20)).
  3. Aplique la máscara de segmentación del paso 2 a todos los canales del mismo conjunto de datos (en el ejemplo de CD20, la máscara derivada de AF488 se aplica a AF488 para medir la señal real y a todos los demás canales de detección para medir el sangrado).
  4. Extraiga intensidades y áreas por objeto en Python usando scikit-image (regionprops_table) y NumPy.
  5. Relación señal/fondo (SBR)
    1. Calcule la intensidad media del objeto en todos los ROI segmentados en el canal de detección previsto del marcador.
    2. Defina la intensidad de fondo como la intensidad media de todos los píxeles fuera de los ROI en el mismo campo de visión, excluyendo el relleno de valor cero o los píxeles fuera de los límites.
      Calcule SBR como:
      figure-protocol-1
    3. Visualice las distribuciones SBR con gráficos de violín, mostrando los valores por objeto como puntos (o valores por campo donde se indique).
  6. Cuantificación de sangrado
    1. Para cada canal no deseado, calcule el sangrado (%) utilizando los mismos ROI de la máscara del paso 12.2:
      figure-protocol-2
    2. NOTA: las entradas diagonales son iguales al 100%, ya que en el canal previsto de una imagen de una sola mancha, el numerador y el denominador son idénticos (señal de marcador real medida en su propio canal).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dos desafíos fundamentales a los que se enfrentan las técnicas de imagen de inmunofluorescencia son la unión no específica de las sondas de anticuerpos conjugados con fluoróforos y la autofluorescencia tisular. Este protocolo está diseñado para ayudar a distinguir una señal verdadera del fondo para optimizar las técnicas de inmunofluorescencia multiplexadas.

El bloqueo de heparina reduce...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spectral IBEX, una adaptación del protocolo IBEX, aborda con éxito dos problemas clave en las imágenes de inmunofluorescencia: la unión no específica y la autofluorescencia. El tratamiento de tejidos altamente eosinofílicos con heparina y el uso de la mezcla espectral para eliminar la autofluorescencia y la superposición espectral entre canales aumentó significativamente la detección de la señal verdadera por encima del fondo. La captura de todos los marcadores en una sola pasada reduce ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JFEK, MJ recibe fondos de ALK Abello A/S. JFEK recibe honorarios de consultoría de Merida Biosciences.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los Dres. Andrea Radtke y Ziv Yaniv por su apoyo durante la incorporación e iteración de IBEX. Agradecemos a los Dres. João Bronze de Firmino y Mouhanad Babi por el apoyo y la resolución de problemas de microscopía, y al Centro de Microscopía Óptica Avanzada de McMaster por el acceso a sus microscopios. Agradecemos a Tina Walker, Jianping Wen y Rangana Talpe Guruge por su apoyo técnico. Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención de investigación sobre alergias alimentarias revisada por pares financiada conjuntamente por el Instituto de Infección e Inmunidad del CIHR (CIHR-III), el Instituto de Salud Circulatoria y Respiratoria del CICH (CIHR-ICRH) y la Fundación Canadiense de Alergia, Asma e Inmunología (CAAIF). Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (PJT-198169; JFEK), Beca de Investigación Médica de la Fundación JP Bickell (JFEK), Fundación Canadiense de Alergia, Asma e Inmunología (JFEK, MJ), Sociedad Canadiense de Alergia e Inmunología Clínica (VO, MJ), Fundación Schroeder (JFEK, SW, MJ), Food Allergy Canada (JFEK, SW, MJ), ALK Abello A/S (JFEK, MJ), Familia Zych (SW, MJ), Familia Buckrell (JFEK), Beca de Posgrado de Ontario (SD) y el Programa de Licenciatura en Ciencias de la Salud de la Universidad McMaster (VO).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de ácido sulfúrico 2N (H2SO4)N/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
Vaso de precipitados de 500 mLN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
Placa de 6 pozosN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
BCL-6 - Alexa Fluor 647BD Biociencias561525Factor de dilución 1:100
Kit de fijación/permeabilización de citofix/citoperma BDBD Biociencias554722
Microscopio de disección de mesaN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
Albúmina sérica bovina (BSA)SIGMA-ALDRICHA4503
CD11c - Alexa Fluor 700BD Biociencias561352Factor de dilución 1:100
CD138/Syndecan-1 - PEBioLegend356503Factor de dilución 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488Invitrogen53020282Factor de dilución 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532NovusBioNBP2-60733AF532Factor de dilución 1:100
CD23 - PEBioLegend338507Factor de dilución 1:200
CD3 - iFluor 594AAT Bioquest100320C0Factor de dilución 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700BioLegend303134Factor de dilución 1:100
CD34 - iFluor 594AAT Bioquest103400C0Factor de dilución 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700BioLegend303523Factor de dilución 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647BioLegend300520Factor de dilución 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532ThermoFisher Scientific58045942Factor de dilución 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647BioLegend353113Factor de dilución 1:100
Adhesivo de alumbre y gelatina de cromoSuministro de Nuevos Jugadores1033A
CryomoldFisher Scientific & nbsp;NC9511236Además, el número de catálogo 50-465-347 para muestras más grandes
Diapositiva de calibración DAPIAgar ScientificAG2273
Solución DAPI, 1 mg/mLThermoFisher Scientific62248Factor de dilución 1:3000
E-cadherina/CD324 - Alexa Fluor 647BioLegend147307Factor de dilución 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594BioLegend324228Factor de dilución 1:100
Tubos Eppendorf/FalconN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
PinzasN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
FoxP3 - eFluor 660ThermoFisher Scientific50577382Factor de dilución 1:100
Portaobjetos de microscopio de extremo esmeriladoChemScienceGEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific53590282Factor de dilución 1:100
Sal sódica de heparinaSIGMA-ALDRICHH339310KU
HLA-DR - PENovusBioNB100-77855PEFactor de dilución 1:200
Human TruStain FcX (solución bloqueadora de receptores Fc)BioLegend422302Factor de dilución 1:100
Cámara de humedadN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
Cubo de hielo con tapaN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
IgD - Alexa Fluor 488BioLegend348215Factor de dilución 1:100
IL4Ra/CD124 - PEBioLegend144803Factor de dilución 1:200
Convertidor de archivos ImarisInstrumentos OXFORDN/ACubrir cualquier formato de archivo de imagen al formato .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
Isopentano (2-metilbutano)N/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
Ki-67 - Alexa Fluor 488BD Biociencias558616Factor de dilución 1:100
Kimberly-Clark limpiaparabrisas delicados de tareas delicadas de Kimtech Kimtech Science Kimwipes, 1 capaCiencia Kimtech06-666
Pinzas grandes (es decir, de 25 cm de largo)N/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
Nitrógeno líquidoN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
Borohidruro de litio (LiBH4)SIGMA-ALDRICH222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488Invitrogen53603680Factor de dilución 1:100
Tapa de portaobjetos de microscopio Vidrio nº 1 22x50 mmFisher Scientific & nbsp;12-542A
Agua Milli-QN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
MUC2 - Alexa Fluor 488NovusBioNB120-11197AF488Factor de dilución 1:100
Tapa de recámara Nunc Lab-TekThermoFisher Scientific155380
Lápiz PAPABCAMAB2601
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)N/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
BisturíN/AN/ALo que esté disponible o usado en el laboratorio
Extensiones SimpleITK ImarisN/AN/ASoftware utilizado para alinear imágenes de diferentes rondas (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
SacarosaSIGMA-ALDRICHS0389
Compuesto Tissue-Tek O.C.T.Sakura Finetek USA4583
Triton X-100SIGMA-ALDRICHX100
Zeiss LSM 980Microscopía ZEISSN/AEl sistema de imagen utilizado en este estudio
Zen BlueMicroscopía ZEISSN/AEl software utilizado para el procesamiento de imágenes tras la adquisición

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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