Inducción de hipertermia leve dirigida en modelos tumorales murinos mediante conversión fototérmica de luz infrarroja cercana mediante nanovarillas de oro intratumorales

Resumen

Este protocolo presenta las técnicas y la metodología necesarias para la terapia hipertérmica dirigida en modelos de tumores sólidos. El enfoque aprovecha la conversión fototérmica de la luz infrarroja cercana mediante nanovarillas de oro inyectadas intratumoralmente para inducir un calentamiento localizado dentro del microambiente tumoral.

Resumen

La hipertermia leve (42-48 °C) es una modalidad terapéutica bien establecida que puede inducir la muerte controlada de las células tumorales y estimular las respuestas inmunitarias anticancerígenas. Sin embargo, administrar calor con precisión al tejido tumoral sin afectar el tejido sano circundante sigue siendo un desafío importante. Los métodos tradicionales de hipertermia, como la perfusión aislada de extremidades, requieren procedimientos complejos e invasivos y conllevan un riesgo sustancial de toxicidad local y morbilidad del paciente. Por el contrario, la terapia fototérmica con nanopartículas de oro activadas por luz infrarroja cercana (NIR) se ha convertido en una estrategia prometedora y menos invasiva para lograr la hipertermia localizada. Las nanovarillas de oro (GNR), en particular, exhiben propiedades ópticas sintonizables y una alta eficiencia de conversión fototérmica, lo que las convierte en candidatas ideales para la modulación térmica precisa de los sitios tumorales. Aunque esta técnica ha demostrado ser muy prometedora, especialmente para tumores superficiales y accesibles, la administración reproducible, el confinamiento espacial y la seguridad siguen siendo áreas activas de refinamiento. En este protocolo, presentamos nuestro método validado y optimizado para lograr una hipertermia leve y localizada mediante la inyección intratumoral de GNR biocompatibles seguida de una exposición dirigida al láser NIR de corta duración. Este enfoque permite un calentamiento rápido y controlable dentro del rango terapéutico, promoviendo la muerte inmunogénica de las células tumorales y estimulando las respuestas inmunes innatas, mecanismos particularmente relevantes para los tumores inmunológicamente "fríos". El monitoreo de temperatura en tiempo real y la administración local garantizan la reproducibilidad, la seguridad y una exposición sistémica mínima. Este protocolo simplificado ofrece una plataforma sólida y accesible para estudios preclínicos, apoyando esfuerzos más amplios para aprovechar la hipertermia leve en la inmunoterapia contra el cáncer.

Introducción

Siguen existiendo desafíos significativos en el tratamiento del cáncer, incluida la resistencia a los medicamentos, la evasión inmune y la toxicidad fuera del objetivo, todo lo cual socava el éxito a largo plazo de las terapias convencionales. Estas limitaciones han impulsado el desarrollo de estrategias terapéuticas complementarias diseñadas para superar los mecanismos de resistencia y minimizar el daño colateral al tejido sano. La hipertermia leve, definida como la elevación de la temperatura de los tejidos a 42-48 °C, ha sido reconocida durante mucho tiempo como un complemento eficaz de las terapias estándar contra el cáncer. Históricamente, la hipertermia leve se ha utilizado en combinación con cirugía, quimioterapia o radioterapia para mejorar la eficacia de estas terapias al aumentar la perfusión tumoral, alterar la arquitectura estromal y sensibilizar las células malignas a los agentes citotóxicos¹. Más recientemente, con el creciente éxito de la inmunoterapia en oncología, existe un creciente interés en aprovechar el potencial inmunomodulador inherente de la hipertermia leve para mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales ^1,2,3.

A pesar de sus beneficios clínicos demostrados, la aplicación más amplia de la hipertermia tumoral sigue siendo limitada debido a los desafíos para lograr un calentamiento localizado, controlable y reproducible de los tumores al tiempo que se evita el daño tisular fuera del objetivo⁴. Las técnicas actuales de hipertermia clínica y experimental, como la perfusión regional de las extremidades o los enfoques basados en nanopartículas administradas sistémicamente, a menudo sufren de precisión espacial limitada, absorción tumoral variable y potencial de toxicidad sistémica 2,5,6,7,8,9 . La terapia hipertérmica dirigida es una modalidad emergente en este campo del tratamiento del cáncer, diseñada para elevar selectivamente las temperaturas tumorales y minimizar el daño al tejido sano circundante. Más específicamente, la administración dirigida de nanovarillas de oro (GNR) es un método prometedor para superar las limitaciones actuales de la precisión y toxicidad de la hipertermia tumoral leve. Los GNR son particularmente adecuados para aplicaciones fototérmicas debido a su resonancia de plasmones de superficie sintonizable en la región NIR, alta eficiencia de conversión fototérmica y perfiles de biodistribución favorables en comparación con otras nanoestructuras de oro^10,11. Su capacidad de respuesta a las longitudes de onda NIR permite una absorción eficiente de la luz y un calentamiento localizado incluso en tejidos más profundos, con un daño mínimo a las estructuras circundantes. Como tal, los GNR pueden proporcionar una mayor eficacia, orientación y seguridad en terapias hipertérmicas.

El objetivo de este método es proporcionar un protocolo altamente eficiente, de bajo consumo de recursos y reproducible para lograr una hipertermia leve mediada por nanovarillas de oro en tumores sólidos. Esta técnica, denominada terapia hipertérmica dirigida (THT) mediada por GNR, aborda las limitaciones clave de los enfoques convencionales de hipertermia al combinar la inyección directa intratumoral de GNR con la activación externa de la luz NIR. Esto garantiza una alta concentración local de nanopartículas, mejorando la reproducibilidad y la seguridad, particularmente para tumores pequeños o poco vascularizados que pueden no acumularse de manera eficiente en los agentes administrados sistémicamente. Además, el empleo de la inyección intratumoral directa de GNR seguida de la exposición a la luz infrarroja cercana (NIR) garantiza un calentamiento preciso, controlado y localizado de los tumores, al tiempo que minimiza la exposición sistémica, la toxicidad y los efectos fuera del objetivo asociados con las técnicas convencionales de hipertermia regional.

Muchos cánceres presentan mecanismos complejos y diversos de escape inmunológico, lo que les permite resistir la inmunoterapia a través de varios medios, más evidentemente, a través de una mala infiltración de células inmunes dentro del microambiente tumoral ^2,4,5. La hipertermia leve ofrece una solución sinérgica cuando se usa en combinación con inmunoterapias. Además de los efectos citotóxicos directos, la hipertermia leve induce preferentemente la muerte celular inmunogénica (DAI), lo que lleva a la liberación de antígenos asociados a tumores (AAT) y patrones moleculares asociados al daño (DAMP)^1,2. Estas señales activan las vías inmunitarias innatas, mejoran la presentación de antígenos tumorales, promueven la maduración de las células dendríticas y mejoran el cebado de las células T, lo que en última instancia aumenta la infiltración de células inmunitarias en el microambiente tumoral ^1,6,12. En nuestros propios modelos preclínicos, esta técnica THT mediada por GNR funcionó para activar las respuestas inmunes locales y mejorar la infiltración inmune tumoral¹³. Cuando se combina con la terapia intratumoral de interleucina-2 (IL-2) o la inhibición sistémica del punto de control anti-PD1, esta técnica THT mediada por GNR aumentó aún más la inmunidad antitumoral y superó a cualquiera de las monoterapias solas en modelos de cáncer de mama y melanoma¹³. Estos resultados son consistentes con un creciente cuerpo de evidencia que respalda la sinergia entre la hipertermia mediada por nanopartículas y la inmunoterapia en tumores sólidos, incluido el cáncer de mama 14,15,16 y los tumores cerebrales ^17,18. En resumen, al convertir los tumores inmunológicamente "fríos" en "calientes", la THT mediada por GNR puede mejorar la capacidad de respuesta a las inmunoterapias, incluidos los inhibidores de puntos de control ^1,2,12.

El protocolo THT mediado por GNR que se presenta aquí es de bajo consumo de recursos, técnicamente sencillo y ampliamente adaptable a tumores subcutáneos o superficiales. Esta técnica es particularmente apropiada para investigadores que trabajan con modelos murinos de tumores subcutáneos o superficiales, incluidos el melanoma y el cáncer de mama. Sin embargo, con modificaciones menores, se puede extender a otros tipos de tumores y sitios anatómicos. Además, esta técnica ofrece una plataforma versátil para integrar la hipertermia controlada espacialmente en estudios preclínicos de cáncer, particularmente aquellos que investigan estrategias de mejora de la inmunoterapia, y buscan explorar la hipertermia leve para mejorar la respuesta al tratamiento o superar la resistencia a los tratamientos de inmunoterapia. Además, el conocimiento y el equipo necesarios para la implementación de esta técnica son accesibles y adaptables a una variedad de entornos de atención médica, lo que mejora su viabilidad en un uso clínico más amplio³.

En este manuscrito, proporcionamos instrucciones detalladas paso a paso para implementar nuestro protocolo THT mediado por GNR en modelos de ratón utilizando un sistema láser NIR que funciona a 860 nm. El éxito de este protocolo depende de la activación eficiente de los tejidos profundos de las nanovarillas de oro utilizando la longitud de onda adecuada de la luz infrarroja cercana. También destacamos las consideraciones de procedimiento para lograr una dosificación hipertérmica leve consistente, segura y efectiva en modelos de tumores murinos, como el monitoreo preciso en tiempo real de la temperatura interna del tumor durante todo el procedimiento. Este método se basa y reúne aspectos de los enfoques de hipertermia de nanopartículas informados anteriormente, ofreciendo una alternativa completa, validada, altamente precisa y reproducible para la investigación preclínica del cáncer. En general, este protocolo ofrece un método biológicamente seguro, rentable y de baja toxicidad para administrar hipertermia localizada en el tumor, con un gran potencial para mejorar la eficacia de las inmunoterapias contra el cáncer existentes y ampliar la utilidad clínica de la hipertermia en oncología.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Universitario de Animales de Laboratorio de la Universidad de Dalhousie bajo las pautas de los estándares éticos del Consejo Canadiense de Cuidado Animal. Se siguieron todas las pautas internacionales, nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales utilizados en este protocolo.

1. Requisitos de las instalaciones de tratamiento y láser

1. Acceso seguro a un sistema láser totalmente calibrado capaz de entregar luz a una longitud de onda de 860 ± 10 nm con una intensidad de hasta 4.000 mA. Asegúrese de que el sistema láser tenga los mecanismos de apagado adecuados.
   NOTA: En este estudio, utilizamos un láser diseñado a medida. El modelo utilizado en este protocolo tiene una llave de habilitación láser, un botón de parada de emergencia y un puente de enclavamiento (el puente conectado también se puede conectar a un interruptor de seguridad que se utiliza para el cumplimiento de la seguridad, por ejemplo, acceso de puerta a una sala láser de Clase 4).
2. Conecte una sonda de temperatura insertable y calibrada para el monitoreo de temperatura intratumoral capaz de transmitir datos de temperatura en vivo a través del software de registro de termopar adecuado.
3. Prepare una sala láser designada que cumpla con los estándares de seguridad requeridos para la clase de láser. Asegúrese de que haya un área de trabajo sin obstrucciones, con buena ventilación, iluminación adecuada y todas las superficies reflectantes cubiertas. Restrinja el acceso a la habitación durante el funcionamiento del láser para evitar una exposición involuntaria. Asegúrese de que todo el personal involucrado en el estudio esté completamente capacitado en la operación del láser y los protocolos de seguridad y use el EPP y la protección ocular adecuados.
4. Establezca un espacio de trabajo dentro de la sala de láser que acomode una máquina de anestesia muy cerca de la configuración del láser. Asegúrese de que el láser esté montado de forma segura, pero ajustable, con el sujeto experimental capaz de colocarse aproximadamente a 1-2 cm de la fuente del rayo láser para garantizar una orientación precisa del sitio del tumor.
5. Utilice una cámara termográfica en un trípode, colocada para capturar lecturas de temperatura de la superficie del sujeto, durante la exposición al láser.

2. Cultivo celular e inoculación (inyección de células tumorales)

1. Seleccione modelos de ratón apropiados según el tipo de tumor de interés, siguiendo técnicas estandarizadas de preparación y mantenimiento de cultivos celulares de laboratorio. Para seguir este protocolo, seleccione ratones BALB/c hembra de 6 a 8 semanas de edad para la inoculación del tumor CT26.
   NOTA: Se pueden utilizar ratones inmunocompetentes o inmunocomprometidos de diferentes edades y cepas, según los requisitos del estudio.
2. Cultive la línea celular de cáncer CT26 en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 2 mM de glutamina. Mantener las células a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO₂. Renueve el medio cada 2-3 días y subcultive las células al 70-80% de confluencia utilizando una proporción dividida de 1:4 a 1:10. Use células dentro de los primeros pasajes (p. ej., ≤10 pasajes) para garantizar un crecimiento constante y la eficiencia de la inoculación. Amplíe los cultivos según sea necesario para obtener el número requerido de células para la inoculación.
   NOTA: El número de células necesarias por ratón variará según el modelo, por ejemplo, para el modelo de cáncer colorrectal murino CT26, requerimos 5 × 10⁵ células por ratón.
3. Desprender las células adherentes mediante tripsinización y lavar 2x con 1x PBS estéril. Vuelva a suspender en una solución estéril de 1x PBS para lograr la concentración deseada de 5 × 10⁶ células/ml. Almacene la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml con hielo durante un máximo de 1 h antes de la inyección.
4. Antes de la inyección, anestesiar ratones usando una cámara de inducción con isoflurano vaporizado al 4% a un caudal de 0,8 L / min. Una vez anestesiado, reduzca el isoflurano al 2% y mantenga la anestesia con un cono nasal durante el procedimiento de inoculación. Confirme la profundidad de la anestesia mediante una prueba de pellizco del dedo del pie para garantizar la ausencia de una respuesta al dolor. Aplique lubricante ocular en ambos ojos para evitar que se sequen y minimizar el daño potencial del láser.
5. Afeite el lugar de la inyección (por ejemplo, el flanco izquierdo para este modelo CT26 heterotópico) con una afeitadora eléctrica y limpie el área con una toallita con alcohol para eliminar los desechos y desinfectar la piel. Pellizque la piel en el lugar de la inyección e inyecte 100 μL de la suspensión celular a 5 × 10⁶ células/mL por vía subcutánea con una aguja de 26 G y una jeringa de 1 mL. Después de la inyección, retire el ratón del cono de la nariz y devuélvalo a su jaula para que se recupere sobre una manta térmica durante 1 h.

3. Crecimiento tumoral y medición

1. Comience las mediciones diarias del tumor, generalmente a partir del día 7 después de la inyección, utilizando un calibrador de medición de tumores. Mida las dimensiones del tumor en tres ejes: ancho, largo y alto y calcule los volúmenes tumorales utilizando una fórmula de volumen tumoral elipsoide de π/6 × largo × ancho × alto.
2. Planifique iniciar THT mediada por GNR una vez que los tumores alcancen un volumen aproximado de 50 mm³ (± 20 mm³).
   NOTA: Para nuestro modelo CT26, este volumen tumoral se logró entre los días 10 y 12 posteriores a la inyección de células tumorales).
3. Antes del tratamiento con láser, asegúrese de asignar aleatoriamente los ratones a grupos de control y tratamiento. El grupo de tratamiento recibirá una inyección intratumoral de GNR seguida de exposición al láser; y el grupo de control recibirá una inyección intratumoral de PBS (el mismo volumen que la inyección de GNR) en lugar de GNR, seguida de exposición al láser.

4. Conversión fototérmica de la luz NIR utilizando GNR intratumorales

1. En una cabina de seguridad biológica estéril, use una jeringa de 0.3-1 ml con una aguja de 31 G para extraer el volumen apropiado de GNR en función de cada volumen tumoral.
2. Anestesiar al ratón de la misma manera que para la inyección de células cancerosas (con un cono nasal que administra isoflurano al 2% a un caudal de 0,8 L / min y confirmar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la prueba de pellizco del dedo del pie).
3. Una vez anestesiado, reduzca el isoflurano al 2% y coloque el ratón en posición prona sobre la plataforma láser mientras mantiene la anestesia con un cono nasal. Aplique lubricante ocular en ambos ojos para evitar que se sequen y minimizar el daño potencial del láser.
4. Afeite el exceso de pelo alrededor del tumor, si es necesario, para garantizar la exposición de la superficie de la piel al láser. Use etanol para desinfectar la superficie del tumor, limpiando cualquier pelaje / escombros.
   NOTA: En este estudio, utilizamos GNR optimizados para la absorción a 860 nm. Si utiliza un producto GNR diferente al sugerido aquí, asegúrese de que la entrega de longitud de onda NIR láser esté optimizada de acuerdo con el espectro de absorción de GNR.
5. Antes de la exposición al láser, inyecte GNR por vía intratumoral a una concentración de 1 μg/mm³ del volumen tumoral. Si es necesario, divida la inyección entre dos sitios intratumorales para garantizar una distribución eficiente de los GNR dentro del tumor.
   NOTA: En este video de protocolo, se utilizaron GNR a una concentración de 2 μg/μL; por lo tanto, para un tumor de 50 mm³ , se inyectaron 25 μL de GNR en el tumor. Asegúrese de limpiar cualquier exceso de GNR en la superficie de la piel después de las inyecciones respectivas.
6. Para ratones del grupo de control, administre una inyección intratumoral de PBS estéril del volumen equivalente utilizado para los grupos de inyección de GNR (por ejemplo, inyecte 25 μL de PBS en el caso de un tumor de 50 mm³).
7. Desinfecte la sonda de temperatura intratumoral con etanol e insértela suavemente en el centro de la masa tumoral.
8. Aplique una capa uniforme de gel de aloe vera de aproximadamente 5 mm de espesor sobre la superficie del tumor para prevenir la ulceración de la piel y minimizar el riesgo de lesión térmica durante el tratamiento.
9. Asegúrese de que el láser esté ajustado para alinearse directamente sobre la mitad del tumor. Utilice la tabla de búsqueda de irradiancia (Tabla 1) para determinar la altura adecuada del láser en función del diámetro del rayo láser requerido para cubrir el área de la superficie del tumor. Optimice la altura del láser en función del diámetro del tumor para garantizar un suministro de energía constante.
   NOTA: En nuestro experimento, un tumor con un diámetro de 1,3 cm requirió una altura de láser de 1,5 cm).
10. Encienda la fuente de enfriamiento eléctrico (TEC) láser y termo, luego conecte el sistema láser a la fuente de alimentación (adaptado según el protocolo del fabricante). Encienda la fuente de enfriamiento termoeléctrica; espere a que se encienda el LED azul y la temperatura de la fuente TEC del láser se estabilice en 25 °C después de 30 s.
11. Utilice la tabla de búsqueda de irradiancia (Tabla 1) para lograr una irradiancia objetivo de 1 W/cm² ± 0,2 W/cm² ajustando la salida de corriente del láser (gire la perilla de la fuente láser al punto de ajuste de corriente deseado).
    NOTA: En nuestro experimento, una altura de láser de 1,5 cm, un diámetro de haz de 1,3 cm y la corriente láser de 1.800 mA dieron como resultado un valor de irradiancia de 0,82 W/cm², que se optimizó para este modelo tumoral.
    A partir de este momento, asegúrese de que todas las personas en la sala de operaciones láser usen gafas de seguridad láser certificadas para la longitud de onda de la luz utilizada.
12. Configure la cámara térmica adyacente a la plataforma láser, dirigida al ratón, para controlar la temperatura de la superficie de la piel durante el procedimiento con láser.
13. En el software de grabación de termopares, cree un nuevo archivo y haga clic en el botón de grabación . Asegúrese de que el gráfico interno de temperatura del tumor en función del tiempo se muestre en tiempo real.
14. Gire la llave de seguridad para habilitar la salida de la fuente láser. Comience la administración del láser presionando el pedal hacia abajo.
    NOTA: En este protocolo, un controlador Raspberry Pi es la interfaz interna entre el pedal y la fuente láser.
15. Verifique y asegúrese de que el software de la computadora detecte un aumento en la temperatura del tumor una vez que el tumor inyectado por GNR se expone al rayo láser.
    NOTA: La temperatura interna del tumor comenzará a aumentar en el momento del inicio del láser, tardando aproximadamente de 15 s a 2 min en entrar en el rango de hipertermia objetivo de 42 °C, dependiendo del tamaño y tipo de modelo tumoral.
16. Mantenga la temperatura interna del tumor en un rango hipertérmico (entre 42 °C y 48 °C) durante 5 min completos. Controle continuamente la temperatura interna del tumor y, si se acerca a los 48 ° C, retire el pie del pedal y deje que la temperatura vuelva a bajar. Busque esta caída de temperatura en tiempo real en el gráfico de visualización de temperatura versus tiempo. Una vez que la temperatura interna del tumor haya bajado a ~43 °C, vuelva a habilitar la administración del láser presionando el pedal nuevamente. Continúe con este patrón de ciclo de pedal láser de encendido / apagado para mantener la temperatura interna del tumor en el rango hipertérmico apropiado durante 5 minutos completos y controle el gráfico de visualización de temperatura versus tiempo.
    1. Si la temperatura del tumor desciende por debajo de 42 °C en cualquier momento durante el período de hipertermia de 5 minutos, aumente el tiempo de hipertermia para compensar el tiempo perdido. Por ejemplo, si la temperatura desciende por debajo de 42 °C durante 20 s, agregue 20 s al final del tiempo inicial de 5 minutos. Es posible que algunos tumores inyectados con GNR no alcancen los 48 ° C y no será necesario el ciclo de encendido / apagado del láser.
       NOTA: En ratones de control inyectados intratumoralmente con PBS, los tumores no alcanzarán el rango hipertérmico. Si se desea, el ciclo de encendido / apagado del láser para ratones de control debe seguir el mismo patrón establecido para el grupo tratado con GNR, a pesar de la falta esperada de respuesta hipertérmica.
17. Durante el mantenimiento de la hipertermia tumoral, controle continuamente la temperatura de la superficie de la piel para asegurarse de que se mantenga por debajo de 50 °C. Independientemente de la temperatura interna del tumor, si la temperatura de la superficie de la piel alcanza los 50 °C, apague el láser para permitir el enfriamiento. Si la temperatura interna no puede alcanzar el rango hipertérmico deseado sin que la temperatura de la piel supere los 50 °C, reduzca la potencia del láser y/o aplique aloe vera adicional en el sitio del tumor para ayudar a disipar el calor. Después de 5 minutos en el rango hipertérmico, suelte el pedal para detener la administración del láser y deje que la temperatura interna del tumor baje a ~ 37 ° C y apague la llave de seguridad del láser.
    NOTA: Es importante minimizar el daño cutáneo que podría provocar ulceración tumoral manteniendo la temperatura de la piel por debajo de 50 °C¹⁹.
18. Controle la sonda de temperatura interna del tumor, permitiendo que la temperatura del tumor vuelva a bajar a aproximadamente 37 °C. Retire suavemente la sonda de temperatura del tumor y limpie el gel de aloe vera restante en la superficie del tumor.
19. Retire el ratón del anestésico del cono nasal y controle la excitación del animal antes de devolverlo a la jaula. Coloque la jaula parcialmente sobre una almohadilla térmica a 37 ° C durante el período de recuperación posterior al procedimiento, permitiendo que los ratones se muevan entre áreas más cálidas y más frías según sea necesario para regular su temperatura corporal. Supervise a cada ratón para garantizar que vuelva a su comportamiento normal antes de devolverlos a sus instalaciones de alojamiento.

Resultados

El objetivo de este protocolo THT mediado por GNR es calentar tumores sólidos de manera consistente y confiable al rango hipertérmico leve deseado de 42-48 ° C. Los pasos principales de este procedimiento se describen en la Figura 1. El éxito de este protocolo depende del establecimiento y mantenimiento de una hipertermia leve controlada y reproducible dentro de un modelo de tumor sólido determinado. Los GNR utilizados se sintetizaron utilizando un método patentado sin CTAB, en el que la sal de oro se redujo en una solución surfactante patentada para promover el crecimiento de cristales en forma de varilla. Después de la síntesis, los tensioactivos nativos se reemplazaron en gran medida con PEG de bajo peso molecular para mejorar la biocompatibilidad. Los GNR resultantes eran uniformes en tamaño (51,1 ± 10,8 nm por 12,2 ± 1,9 nm), tenían una longitud de onda de excitación óptima de 860 ± 10 nm y estaban libres de endotoxinas detectables.

Para garantizar un calentamiento adecuado del tumor y un seguimiento preciso de la temperatura, se debe insertar una sonda de temperatura intratumoral en el centro del tumor. Además, es crucial controlar la temperatura de la superficie de la piel durante todo el procedimiento mediante una cámara termográfica. Es posible, especialmente para los tumores que son de menor volumen, que los GNR inyectados intratumoralmente puedan difundirse en el espacio peritumoral y/o subcutáneo alrededor del tumor. Tras la exposición a la luz NIR, esto puede causar un calentamiento de la piel por encima de los niveles fisiológicos básicos, y si la piel alcanza temperaturas superiores a niveles hipertérmicos leves (superiores a 50 °C), esto podría provocar daños en la piel como costras y/o ulceraciones¹⁹. La aplicación de una capa de gel de aloe vera en la superficie del tumor es un paso de precaución importante para ayudar a regular la temperatura de la superficie de la piel y prevenir el daño térmico durante la exposición al láser NIR. En cualquier caso, se recomienda controlar la zona tratada para detectar signos de ulceración durante las 48 h siguientes a la THT. La Figura 2 muestra una representación visual de la configuración sugerida para optimizar el manejo de la temperatura del tumor, mostrando la ubicación de la sonda de temperatura interna del tumor y la capa de gel de aloe vera en relación con la sonda láser NIR.

El éxito relativo de este protocolo experimental se puede determinar observando el gráfico de temperatura interna del tumor frente al tiempo durante la operación del láser. Para los ratones inyectados intratumoralmente con GNR, se espera que los tumores se calienten en el rango hipertérmico leve (42-48 ° C) dentro de 15 s a 2 min. Una vez que la temperatura interna del tumor ha entrado en el rango hipertérmico leve, se espera que se estabilice dentro del rango apropiado o requiera un ciclo de encendido / apagado de la administración del láser para garantizar que la temperatura interna del tumor no supere los 48 ° C (como se muestra en la Figura 3A). El mantenimiento exitoso de la hipertermia leve durante 5 minutos se considera un resultado positivo. Para los ratones inyectados intratumoralmente con PBS, no se espera que los tumores se calienten en el rango hipertérmico. La exposición a la luz NIR a una longitud de onda de 860 nm no es suficiente por sí sola para causar el calentamiento del tejido en el rango hipertérmico leve, y se espera que los tumores de control se estabilicen alrededor de 39-40 ° C. La Figura 3B muestra un gráfico interno de temperatura del tumor versus tiempo entre GNR y ratones de control (inyectados con PBS) durante el procedimiento de 5 minutos. Si un tumor inyectado por GNR no puede alcanzar el rango hipertérmico tras la exposición a la luz NIR o no puede mantenerse en el rango hipertérmico apropiado durante 5 minutos completos, esto se considera un resultado negativo.

El análisis posterior adicional para determinar el éxito de este protocolo THT mediado por GNR implica medir los cambios en el volumen tumoral después del procedimiento. La THT mediada por GNR realizada con éxito provoca la muerte de las células tumorales dirigidas y la activación de respuestas inmunitarias anticancerosas, lo que conduce a la regresión tumoral y a la reducción del volumen tumoral asociado¹³. La Figura 4 muestra los cambios en el volumen tumoral después de la THT mediada por GNR para dos modelos de cáncer murino de flanco subcutáneo (modelo de cáncer colorrectal heterotópico B16 y CT26) y un modelo de cáncer murino de almohadilla de grasa mamaria (4T1 - cáncer de mama). En cada modelo, es evidente una reducción significativa en el volumen tumoral en comparación con los controles 48-72 h después del procedimiento THT mediado por GNR. Se espera que la escala de tiempo y la magnitud de la reducción del volumen tumoral después del procedimiento varíen según la cepa del ratón y el modelo de cáncer. Además de la reducción tumoral, observamos una potente respuesta inmune innata dentro de las 48 h de THT mediada por GNR, caracterizada por una mayor expresión de genes involucrados en la vía STING-cGAS y la regulación positiva y activación de células dendríticas, macrófagos y células NK en los modelos B16F10 y 4T1¹³. En particular, en un modelo tumoral 4T1 bilateral, la THT habilitada para GNR indujo una respuesta inmune sistémica, como lo demuestra el aumento de la infiltración de células T CD8⁺ en tumores contralaterales no tratados¹³. Estos hallazgos respaldan aún más el potencial de este enfoque para provocar efectos anticancerígenos citotóxicos directos e inmunomoduladores más amplios.

Tabla 1: Tabla de búsqueda de irradiancia. Tabla que proporciona valores de irradiancia (W/cm²) para diferentes configuraciones de salida de corriente láser (mA) y distancias de trabajo (cm). La tabla se utiliza para determinar la altura adecuada del láser en función del diámetro del haz requerido para cubrir la superficie del tumor y lograr una irradiancia objetivo de 1 W/cm² ± 0,2 W/cm². Los valores resaltados en verde indican niveles óptimos de irradiancia cercanos a 1 W/cm². Esta tabla de irradiancia es específica para el láser LDX y fue proporcionada por el fabricante. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura 1: Esquema gráfico del procedimiento THT mediado por GNR. Metodología de la terapia hipertérmica dirigida mediada por nanovarillas de oro para tumores de flanco subcutáneo en un modelo murino. Después del establecimiento de un tumor palpable (aproximadamente 50 mm³) y anestesia con ratones, (1) inyecte GNR intratumoralmente a una concentración de 1 μg / mm³, (2) inserte una sonda de temperatura intratumoral en el medio de la masa tumoral, (3) aplique una capa de ~ 5 mm de gel de aloe vera en la superficie del tumor, (4) comience la administración de láser NIR y (5) mantenga la temperatura interna del tumor en un rango hipertérmico leve (42 ° C-48 ° C) durante 5 min. Abreviaturas: GNR = nanovarilla de oro; THT = terapia hipertérmica dirigida; NIR = infrarrojo cercano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Representación visual de la configuración experimental. Un ratón BALB/c portador de un tumor colorrectal heterotópico con una sonda de temperatura intratumoral insertada centralmente y una capa tópica de gel de aloe vera aplicada directamente debajo de la exposición a un rayo láser infrarrojo cercano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Gráficos de temperatura interna en tiempo real. Perfil representativo de temperatura interna del tumor a lo largo del tiempo (en ms) registrado por la sonda de temperatura interna durante la exposición del tumor al láser NIR. (A) Patrón de ciclo láser NIR encendido / apagado en un ratón inyectado con GNR requerido para mantener la temperatura interna del tumor en un rango hipertérmico leve (42 ° C-48 ° C) durante 5 min. Esto destaca la importancia de un control estrecho de la temperatura interna del tumor y el ciclo de administración del láser para mantener el rango hipotérmico durante todo el procedimiento. (B) Diferencia promedio en la temperatura interna del tumor entre ratones inyectados con GNR (n = 15) y control (inyectados con PBS) (n = 8) durante 5 minutos de exposición al láser NIR. Los tumores de los ratones inyectados con PBS no se calientan en un rango hipotérmico leve y se estabilizan alrededor de 39-40 ° C a pesar de recibir la misma duración de exposición al láser NIR que el grupo inyectado con GNR, cuyos tumores alcanzan temperaturas hipertérmicas de 42-48 ° C. Abreviaturas: GNR = nanovarilla de oro; NIR = infrarrojo cercano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Gráficos de volumen tumoral después de THT mediada por GNR. La THT mediada por GNR induce la reducción del volumen tumoral en múltiples modelos de cáncer murino dentro de las 48-72 h posteriores al tratamiento. (A) Mediciones del volumen tumoral en el modelo 4T1 (cáncer de mama) después de THT mediada por GNR (n = 24 PBS, n = 28 THT). (B) Mediciones del volumen tumoral en el modelo B16-F10 (melanoma) siguiendo THT mediada por GNR (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) Mediciones del volumen tumoral en el modelo CT26 (cáncer colorrectal) siguiendo THT mediada por GNR (n = 9 PBS, n = 9 THT). Una reducción o desaceleración del crecimiento del volumen tumoral dentro de las 48-72 h posteriores al tratamiento es indicativa de un resultado positivo. Los datos de volumen tumoral para el modelo CT26 en el punto de tiempo '24 h pre' no se combinan: los valores son similares y se superponen. Las barras de error representan SEM. * p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Pasos críticos dentro del protocolo
El diseño y la implementación de esta técnica THT mediada por GNR proporciona la capacidad de realizar un calentamiento dirigido, preciso, de bajo consumo de recursos y reproducible de tumores sólidos in vivo. Una ventaja clave de este sistema radica en su precisión espacial y control térmico, lo que permite un tratamiento localizado sin dañar el tejido circundante. Un paso crítico para una conversión fototérmica exitosa es garantizar la compatibilidad entre los GNR utilizados y la fuente de luz NIR. En este estudio, utilizamos GNR optimizados para la absorción a 860 nm. En esta longitud de onda, la luz penetra en el tejido de manera efectiva y el calor se genera selectivamente en los tumores que contienen GNR, mientras que el tejido sano circundante permanece cerca de la temperatura fisiológica²⁰. Además, al realizar este protocolo, el monitoreo preciso en tiempo real de la temperatura interna del tumor es crucial para confirmar que se logra un rango hipertérmico leve y que el tratamiento se administra de manera constante. La colocación de una sonda de temperatura intratumoral, como se muestra en la Figura 2, permite el monitoreo en tiempo real de la dosis térmica del tumor, como se ve en la Figura 3B.

Solución de problemas de la técnica
Dependiendo del modelo in vivo y del tipo de tumor, pueden ser necesarias ligeras modificaciones en el protocolo para optimizar los resultados. Por ejemplo, en los modelos de melanoma murino, cáncer colorrectal y cáncer de mama a los que se hace referencia en la Figura 4, hemos optimizado la concentración de volumen de GNR a tumor en 1 μg / mm³. También hemos optimizado la eficiencia de este protocolo al realizar la exposición al láser NIR directamente después de la inyección de GNR, ya que no se observaron diferencias en la eficacia del tratamiento al comparar esta inyección y el tiempo del tratamiento con intervalos más largos de 0,5, 1, 4, 18 o 24 h. Para los modelos tumorales que varían de nuestros modelos en términos de fisiopatología tumoral o localización corporal, una concentración diferente de GNR, inyectada en un momento diferente, puede ser óptima para lograr y/o permanecer dentro del rango hipertérmico. Después de este procedimiento, se deben realizar mediciones diarias del volumen tumoral para registrar los cambios en el volumen tumoral. La regresión tumoral dentro de los 2-3 días es un indicador positivo del éxito del tratamiento.

Debido a la naturaleza del protocolo láser, las quemaduras y ulceraciones superficiales de la piel son un factor de riesgo potencial, particularmente en pieles pigmentadas o sensibles. Es posible que sea necesario ajustar la salida de corriente del láser para mantener un equilibrio adecuado entre la superficie de la piel y la temperatura interna del tumor, según el modelo in vivo utilizado. Por ejemplo, hemos encontrado que debido a las diferencias en el contenido de agua y el pigmento de melanina en la piel²¹, los ratones C57Bl / 6 requieren la administración de láser NIR a una corriente más baja en comparación con los ratones BALB / c, para mantener la temperatura de la piel por debajo de 50 ° C. Al modificar la salida de corriente del láser, asegúrese de que la altura del láser se ajuste en consecuencia para mantener una irradiancia objetivo de 1 W/cm² ± 0,2 W/cm² mientras cubre la mayor parte de la superficie del tumor con el diámetro del rayo láser. Alternativamente, la aplicación de gel de aloe vera adicional puede ayudar a reducir la temperatura de la piel durante el procedimiento sin afectar drásticamente la temperatura interna del tumor. Mantener la temperatura adecuada de la superficie de la piel a través de las modificaciones necesarias es importante para minimizar el riesgo de ulceración, que se ha observado como un efecto secundario potencial de este tratamiento. Al realizar modificaciones en la capa de gel de aloe vera, asegúrese de detener momentáneamente la administración del rayo láser NIR. En los días posteriores al protocolo láser, asegúrese de que los ratones estén siendo monitoreados de cerca para detectar posibles quemaduras y / o ulceraciones.

Limitaciones de la THT mediada por GNR
Un problema de seguridad importante que debe abordarse al realizar este procedimiento es el uso de gafas de seguridad láser certificadas para la longitud de onda de la luz utilizada durante el funcionamiento del láser. El sistema láser debe incluir características de seguridad integradas, como un enclavamiento con llave, para evitar la activación accidental. Sin embargo, se requiere equipo de protección personal adicional, particularmente gafas de seguridad láser apropiadas, para proteger contra la exposición potencial de rayos reflejados o dispersos. El ojo es el más vulnerable a las lesiones causadas por un rayo láser, y las quemaduras de retina son una preocupación importante con los láseres NIR²². Por último, todo el personal que opera el láser debe tener la capacitación adecuada.

Este protocolo optó por la inyección intratumoral de GNR en lugar de una inyección sistémica para minimizar la toxicidad del sistema, limitar la distribución de nanopartículas en órganos fuera del objetivo, como el hígado, el bazo y los riñones, y mejorar la precisión, la eficacia y el perfil de seguridad del tratamiento hipertérmico. Sin embargo, debido a que este protocolo requiere inyecciones intratumorales de GNR, puede estar limitado en su capacidad para inducir hipertermia en ciertos modelos tumorales. Hasta ahora, hemos demostrado la eficacia de este método en tumores de almohadilla de grasa subcutánea y mamaria, los cuales residen cerca de la superficie de la piel y son fácilmente accesibles en términos de inyección de GNR y exposición a la luz NIR. Pueden surgir dificultades logísticas al dirigirse a tumores que residen dentro de cavidades corporales, como el peritoneo, o al intentar atacar sitios metastásicos de un tumor primario. Una posible modificación de este protocolo podría implicar la inyección sistémica de GNR, siempre que las nanopartículas estén diseñadas o modificadas para garantizar una acumulación eficiente en los sitios tumorales antes de la exposición a NIR²³. Además, es posible que la inyección intratumoral de GNR pueda resultar en una distribución desigual de nanopartículas en el tumor, lo que afecta la uniformidad del calor. Sin embargo, no se espera que el calentamiento tumoral no uniforme tenga un gran impacto en el grado de efectividad del tratamiento, dado que el resultado primario de este protocolo THT mediado por GNR es la inducción de ICD para activar la inmunidad contra el cáncer. Por último, la lectura de temperatura intratumoral depende de la ubicación de la sonda de temperatura dentro del tumor. El centro del tumor es la ubicación más óptima para que la sonda refleje con precisión la temperatura promedio general del tumor. Sin embargo, si es difícil asegurar y/o confirmar la inserción de una sonda central debido al tamaño y/o la forma del tumor, puede ser necesario registrar usando dos o más sondas de temperatura en diferentes ubicaciones.

Importancia con respecto a los métodos existentes
Este manuscrito proporciona un protocolo completo, optimizado y reproducible para THT mediada por GNR en tumores sólidos y superficialmente accesibles. En comparación con otros métodos de inducción de hipertermia, esta técnica ofrece claras ventajas, a saber, es poco intensiva en recursos, espacialmente precisa y asociada con una toxicidad sistémica mínima. Si bien el uso de GNR para la terapia fototérmica está bien documentado, sigue existiendo una variabilidad significativa en la literatura sobre cómo se implementan estos protocolos. Los elementos clave del procedimiento, como la duración de la irradiación NIR, la elección de las herramientas de monitoreo térmico (sondas de termopar o cámara térmica), la preparación de la solución GNR y los métodos de inyección de GNR a menudo varían entre los estudios.

Por ejemplo, otros métodos requirieron dosis más largas (20 min)²⁴ o múltiples (4 x 15 min)²⁵ de exposición a NIR para lograr resultados similares a los nuestros. Además, la mayoría de los protocolos utilizan sondas de termopar o cámaras térmicas, pero rara vez combinan ambas herramientas^26,27. Además, las soluciones GNR a menudo se preparan con CTAB 28,29,30, y su método de administración varía entre inyecciones sistémicas ^24,30 e inyecciones intratumorales³¹, lo que puede afectar su dispersión/ubicación dentro del TME. Como tal, aún no se ha establecido un método integral y adaptable para THT mediado por GNR que optimice y mejore los protocolos actuales.

Nuestro protocolo aborda estas deficiencias integrando los componentes más efectivos y reproducibles de la literatura en un enfoque único y estandarizado. Específicamente, utilizamos monitoreo térmico dual (termopar y cámara térmica) para garantizar un suministro de calor preciso y seguro; empleamos la inyección intratumoral de GNR libres de CTAB para maximizar la localización del tumor y minimizar la toxicidad; e incorporamos el uso de gel de aloe vera para proteger contra quemaduras superficiales en la piel. Además, los GNR utilizados en este protocolo están optimizados para una conversión fototérmica eficiente a 860 nm NIR, lo que permite alcanzar rápidamente temperaturas hipertérmicas suaves en cuestión de segundos. Una vez que se alcanza este rango de temperatura, se puede mantener de manera estable durante los 5 minutos de duración del tratamiento, que hemos determinado que es suficiente para inducir la muerte celular inmunogénica y la activación inmune. La longitud de onda NIR de 860 nm en sí misma también proporciona un equilibrio favorable entre la profundidad de penetración en el tejido y la seguridad, lo que mejora aún más la ventana terapéutica de este método.

En resumen, nuestro protocolo ofrece una alternativa consolidada, validada y biológicamente efectiva a los enfoques de hipertermia mediados por GNR existentes, y llena un vacío crítico en el campo al proporcionar un método completamente detallado y adaptable adecuado para la investigación preclínica del cáncer y el desarrollo de terapias combinadas.

Aplicaciones futuras de la técnica
Por último, aunque este protocolo podría combinarse fácilmente con varios tratamientos contra el cáncer, es particularmente adecuado para mejorar la eficacia de las inmunoterapias, dada la capacidad inherente de THT para estimular la inmunidad contra el cáncer. Al inducir la muerte celular inmunogénica, promover la liberación de antígenos específicos del tumor y aumentar el número de células inmunitarias innatas reclutadas en el TME dentro de las 48 horas posteriores al tratamiento, la THT mediada por GNR ayuda a "resensibilizar" los tumores inmunológicamente fríos a la detección y ataque del sistema inmunológico¹³. Como resultado, esta técnica puede utilizarse para mejorar la eficacia de las inmunoterapias en el tratamiento de cánceres que pueden haber desarrollado resistencia previamente, ofreciendo una estrategia potencial para superar las barreras del tratamiento del cáncer y la progresión de la enfermedad¹³.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,25% de tripsina	Thermo Fisher Scientific	25200-056
10 ml de stripette	Fisher Scientific	7200574
Tubo Falcon de 15 ml	Corning	352095
Jeringa de 1 ml	BD Biociencias	3331431
Aguja de 28 G	BD Biociencias	1298811
Línea celular de cáncer de mama 4T1	Colección de cultivos de tipo americano	CRL-2539
5 ml de stripette	Fisher Scientific	7200573
Tubo Falcon de 50 ml	Fisher Scientific	14-432-22
70% Etanol	Alcoholes comerciales	36195
Gel de aloe vera	Marca de vida	57800985495
Línea celular de melanoma B16-F10	Colección de cultivos de tipo americano	CRL-6475
Biorender	BioRender	N/A
Armario de seguridad	Nuaire	N/A
Gafas de seguridad láser de clase 4	visión láser	F22. P5P18.5000	Utilizamos un marco P22 con un filtro P5P18
Incubadora de CO2 (37 &grados; C, 5% CO2)	Nuaire	N/A
Corning 1-200 µ L Pipeta de Rack de Ajuste Universal  Consejos	Corning	4865
Pipeta filtrada Corning  Puntas, 30 µ L	Fisher Scientific	07-200-265
CT26 línea celular colorrectal murina	Colección de cultivos de tipo americano	CRL-2638
DPBS	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Tubos Eppendorf	Thermo Fisher Scientific	3451
Ratones hembra BALB/c	Laboratorios Charles River (Montreal, Canadá)	028
Hembra C57Bl/6	Laboratorios Charles River (Montreal, Canadá)	027
Suero fetal bovino	Thermo Fisher scientific invitrogen	12483020
GNR	Sona Nanotech Inc	N/A
Sonda de temperatura intratumoral	OMEGA	HYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-M	Sonda de termopar modelo HYP-1
IsoTip 1000 µ L Pipeta Filtrada Universal Consejos	Corning	4809
Láser LDX (Modelo: LDX- 3520-860-HHLFC)	Minnetronix	N/A	Corriente láser con punto de ajuste máximo a 4600 mA
Optixcare Lubricante para ojos	Aventix	N/A
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140148
Prisma 10.6.0	Teclado gráfico	N/A
RPMI 1640 Medio	Thermo Fisher Scientific	11875119
TC-08 Software de registro de datos de termopar	Tecnología Pico	PicoLog V5.25.3
Cámara térmica	HIKmicro	EA-1086922
Plato de cultivo de tejidos 100 x 20 mm	Fisher Scientific	877222
Solución de azul de tripano al 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Calibrador de medición de tumores	Giles scientificCorporación Mitutoyo	500-321