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Artículo de método
Este protocolo describe un método paso a paso para generar organoides cardíacos humanos funcionales a partir de células madre embrionarias humanas (hESC). Incluye pasos de descongelación, diferenciación y maduración celular, proporcionando una plataforma sólida para el desarrollo cardíaco y el modelado de enfermedades.
Los organoides cardíacos derivados de células madre embrionarias humanas (hESC) son estructuras tridimensionales multicelulares (3D) que recapitulan aspectos clave del desarrollo y la función tempranos del corazón humano. Estos organoides autoorganizados exhiben contractilidad espontánea, expresión de marcadores cardiomiocitos y arquitectura similar a un tejido que recuerda al miocardio nativo. Aquí, presentamos un protocolo robusto y reproducible para generar organoides cardíacos a partir de la línea H9 hESC a través de la diferenciación de linaje por pasos. La inducción del mesodermo se inicia mediante el tratamiento de los esferoides durante 36-40 h con activina A (50 ng/mL), proteína morfogenética ósea 4 (BMP4, 10 ng/mL), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2, 30 ng/mL), laduviglusib (CHIR99021, 3 μM) y un inhibidor de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) (LY294002, 5 μM). La especificación del linaje cardíaco se dirige posteriormente mediante la exposición diaria durante cuatro días a BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL), un inhibidor de la vía Wnt (XAV-939, 5 μM) y ácido retinoico (0,5 μM). La diferenciación y maduración de los cardiomiocitos se promueven aún más a partir del día 5.5 en adelante utilizando BMP4 (10 ng / mL), FGF2 (10 ng / mL) e insulina (10 μg / mL). La validación funcional se logra a través de imágenes de lapso de tiempo y análisis de inmunofluorescencia, confirmando la generación de cardiomiocitos contráctiles marcados por la expresión de troponina T cardíaca (cTnT). Además, la inmunotinción 3D revela la presencia de α-SMA y CDH5, lo que indica la aparición de poblaciones de células similares al músculo liso y al endotelio. Estos organoides cardíacos demuestran consistentemente contracciones rítmicas; sin embargo, no se realizó la validación electrofisiológica directa del acoplamiento electromecánico. Las limitaciones conocidas incluyen la incapacidad de pasar los organoides y la posible necrosis central durante los cultivos extendidos. En resumen, este modelo proporciona una plataforma escalable y fisiológicamente relevante para estudiar la cardiogénesis humana, las respuestas a los medicamentos y las cardiopatías congénitas.
La enfermedad cardiovascular sigue siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, lo que subraya la necesidad urgente de modelos in vitro confiables que recapitulen el desarrollo y la función cardíaca humana 1,2. Los cultivos tradicionales bidimensionales (2D) monocapa de cardiomiocitos, aunque valiosos, no logran reproducir la complejidad espacial, las interacciones multicelulares y la integración electromecánica del corazón humano nativo 3,4. Los organoides cardíacos 3D derivados de células ma....
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Todos los procedimientos que involucran células madre embrionarias humanas (H9) se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética Biomédica de la Universidad Médica del Suroeste, aprobación 20241023-031. Todo el trabajo de cultivo de tejidos que se detalla a continuación debe realizarse en una campana de flujo laminar de Clase II. Asegúrese siempre de que los medios y reactivos estén a temperatura ambiente, equilibrados de forma natural antes de su uso. No use un baño de agua para calentar medios.
1. Descongelación y cultivo rutinario de HESC (H9)
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La diferenciación exitosa de hESC H9 en organoides cardíacos comienza con la reactivación y el mantenimiento robustos de las células madre pluripotentes. Tras la descongelación, las hESC demuestran una alta viabilidad y adherencia cuando se siembran en placas recubiertas de vitronectina en medio E8 suplementado con un inhibidor de ROCK. En 24-48 h, se pueden observar colonias compactas con bordes definidos y altas proporciones núcleo-citoplasma, lo que indica la recuperación de la morfología indiferenciada típica (
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La generación exitosa de organoides cardíacos a partir de hESC H9 se basa en la regulación temporal y espacial precisa de las vías de señalización clave para imitar el desarrollo cardíaco temprano. Este protocolo recapitula las etapas críticas de la inducción del mesodermo, la especificación del linaje cardíaco y la autoorganización en estructuras contráctiles 3D en un sistema químicamente definido. El método proporciona una plataforma robusta y reproducible para modelar el desarrollo de.......
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecemos a Junfeng Ji (Escuela de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Zhejiang, China) y Tao Luo (Escuela de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Zhejiang, China) por proporcionar amablemente hESC (H9). Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. U23A20398 a C.Z.), Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (Subvención No. 2022YFS0578 y 2022YFS0614 a C.Z.), Fundación de Puesta en Marcha de Investigación de la Universidad Médica del Suroeste (Subvención No. 00040155 a C.Z.), Fundación de Puesta en Marcha de Investigación de la Universidad Médica del Suro....
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,02% EDTA | Tiempo de beyo. | C0198 | |
| 6 pozos plato | CORNING | 3516 | |
| 7,5% de albúmina sérica bovina | ACMEC | AC11954 | |
| Placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos | CORNING | 7007 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG | Sí | 34106ES60 | |
| Alexa Fluor 555 Cabra anti-conejo | Invitrogen | A-21428 | |
| Monoclorhidrato CHIR-99021 | Sí | 52965ES10 | |
| DMSO | Solarbio | D8370 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) | Sí | 60152ES76 | |
| FBS | Gibco | 10099141C | |
| Proteína FGF2 Humana Recombinante | ObjetivoMol | TMPY-00749-50 μ g | |
| Mezcla de nutrientes F-12 de Ham | Tecnologías de vida | 11765054 | |
| hPSC-CDM (medio esencial 8) | Cauliscell | 400105 | |
| Proteína recombinante BMP-4 humana | Gibco | PHC9534 | |
| IMDM, Suplemento GlutaMAX | Tecnologías de vida | 31980030 | |
| Insulina-transferrina-selenio (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
| LY294002 | Selleck | S1105-50mg | |
| Monotioglicerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Anti-&alfa;AME de ratón | Abmart | MN50104 | |
| Montaje antidecoloración ProLong Diamond con DAPI | Invitrogen | P36966 | |
| Conejo anti-CDH5 | Abmart | TA6265 | |
| Conejo anti-cTNT | Invitrogen | 701620 | |
| Proteína BMP-4 humana recombinante | Sí | 92053ES20 | |
| Insulina humana recombinante | Sí | 40112ES25 | |
| Proteína A Recombinante de Activina A Humana/Ratón/Rata | Sí | 91702ES10 | |
| ReLeSR | Célula madre | 100-0483 | |
| Ácido retinoico | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Vitronectina | Gibco | Referencia A14700 | |
| XAV-939 | Selleck | S1180 | |
| Y-27632 2HCl (inhibidor de ROCK) | Selleck | S1049 |
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