Un modelo murino estandarizado con un flujo de trabajo de tres personas para estudiar el rechazo celular agudo y mediado por anticuerpos en xenotrasplantes

Resumen

Este estudio establece dos modelos estandarizados de xenotrasplante murino para replicar específicamente el rechazo celular agudo y el rechazo agudo mediado por anticuerpos. Estos modelos sirven como una plataforma fiable para investigar los mecanismos del rechazo inmune de xenoinjertos, evaluar estrategias inmunosupresoras y avanzar en la investigación preclínica en xenotrasplantes.

Resumen

A pesar de los avances recientes en la xenotrasplantación, el rechazo agudo sigue siendo una barrera importante para su aplicación clínica. El rechazo celular agudo (ACR) y el rechazo agudo mediado por anticuerpos (RAM) son las principales respuestas inmunitarias que conducen a un fallo temprano del injerto en los receptores de xenoinjertos. Aunque los modelos animales de gran tamaño, como primates no humanos y cerdos genéticamente modificados, han proporcionado valiosas perspectivas, su uso está limitado por altos costes, limitaciones éticas y una significativa variabilidad experimental. Los modelos de animales pequeños ofrecen una alternativa práctica y reproducible para estudios mecanicistas del rechazo inmunitario. En este estudio se desarrollaron dos modelos estandarizados de xenotrasplante murino para imitar específicamente la ACR y la AMR. Para garantizar la reproducibilidad y minimizar la variabilidad relacionada con el operador, se implementó un protocolo quirúrgico estructurado de tres personas con un flujo de trabajo en línea de montaje, que permitió una generación consistente de modelos con alta eficiencia y calidad. Los modelos resultantes no solo replican las características inmunopatológicas clave del rechazo clínico de xenoinjertos, sino que también ofrecen una plataforma sólida para investigar los mecanismos inmunitarios y evaluar estrategias inmunosupresoras dirigidas. Estos modelos ayudarán a acelerar el desarrollo preclínico de terapias de xenotrasplantes.

Introducción

El xenotrasplante ha surgido como una de las estrategias más prometedoras para abordar la escasez de órganos donantes para trasplantes. En los últimos años, los rápidos avances en tecnologías de edición genética, estrategias de regulación inmunitaria e ingeniería biomédica han conducido a avances significativos en este^{campo 1}. En los últimos tres años, varios equipos de investigación en todo el mundo han realizado ensayos clínicos relacionados con xenotrasplantes en humanos, incluyendo dos casos de trasplante de corazón de cerdo modificado genéticamente en la Universidad de Maryland, un ensayo de trasplante de riñón de cerdo en el Hospital General de Massachusetts y un ensayo de trasplante de timorrenal en la Universidad^{de Nueva York} 2,3,4,5 . A pesar de estos avances sin precedentes, el rechazo inmune sigue siendo el principal desafío que limita la aplicación clínica del xenotrasplante. Incluso con órganos donantes modificados genéticamente altamente optimizados y regímenes inmunosupresores combinados, el rechazo sigue siendo un obstáculo importante. Los estudios actuales indican que el rechazo agudo es un obstáculo crítico en el xenotrasplante, clasificado principalmente en rechazo celular agudo (ACR) y rechazo agudo mediado por anticuerpos (RAM). La ACR está mediada principalmente por células T, caracterizadas por una infiltración extensa de células T en el injerto, lo que conduce a daños tisulares y deterioro funcional. Sus mecanismos subyacentes implican la presentación de antígenos xenogénicos, la activación de células T y la liberación de citocinas^{inflamatorias 6,7}. En cambio, la RAM está impulsada por anticuerpos específicos del donante ya formados o recién generados. Estos anticuerpos se unen a las células endoteliales dentro del injerto, desencadenando la activación del complemento y una respuesta inmunitaria robusta, lo que finalmente resulta en lesión microvascular, trombosis y fallo del^{injerto 8,9,10}. Por lo tanto, una comprensión más profunda de estos mecanismos de rechazo y el desarrollo de estrategias inmunoregulatorias más precisas son esenciales para avanzar el xenotrasplante de la investigación preclínica a la aplicación clínica a largo plazo.

Para abordar el desafío del rechazo agudo en la xenotrasplantación, es esencial volver a la investigación fundamental y a los estudios preclínicos para esclarecer los mecanismos inmunológicos subyacentes. Los modelos animales de gran tamaño, especialmente primates no humanos (NHPs) y cerdos genéticamente modificados, se han utilizado ampliamente en la investigación de xenotrasplantes debido a sus estrechas similitudes anatómicas y fisiológicas con los humanos. Estos modelos proporcionan conocimientos fundamentales sobre los mecanismos de rechazo inmunitario y las estrategias inmunomoduladoras. Sin embargo, su aplicación está significativamente limitada por altos costes, consideraciones éticas y la complejidad de la atención postoperatoria a largo plazo. Además, la variabilidad sustancial en las respuestas inmunitarias entre los NHP individuales afecta la reproducibilidad de los resultados^{experimentales} 11,12,13. Aunque los modelos animales grandes siguen siendo indispensables para la traducción clínica, sus limitaciones en viabilidad y consistencia experimental subrayan la urgente necesidad de modelos animales pequeños más rentables, escalables y mecánicamente relevantes.

Ante estos desafíos, los modelos animales pequeños han adquirido una importancia creciente en la investigación de xenotrasplantes debido a su bajo coste, ciclos experimentales cortos y facilidad de aplicación a gran escala. Estos modelos no solo proporcionan una plataforma esencial para investigar los mecanismos de rechazo inmune, sino que también sirven como un puente fundamental entre los estudios in vitro y los experimentos con grandes animales, facilitando una exploración más precisa de las estrategias inmunoregulatorias. En este estudio se establecieron dos modelos estandarizados de xenotrasplante murino que imitan específicamente la ACR y la RAM. Para garantizar la reproducibilidad y la consistencia, se implementó un protocolo quirúrgico estandarizado para tres personas y un enfoque simplificado en línea de montaje para la generación de modelos. Este flujo de trabajo estandarizado minimiza la variabilidad dependiente del operador, resultando en modelos de trasplante cardíaco altamente uniformes. Estos refinamientos proporcionan una plataforma fiable para investigaciones mecanicistas y la evaluación de nuevas estrategias inmunosupresoras. Este protocolo es especialmente adecuado para investigadores que realicen estudios en pequeños animales sobre los mecanismos inmunitarios de xenotrasplante y para la evaluación de estrategias inmunosupresoras. Ofrece ventajas como bajo coste, alta reproducibilidad y un flujo de trabajo estandarizado, proporcionando una base experimental fiable para estudios posteriores con grandes animales y preclínicos.

Protocolo

Este protocolo puede ser realizado por un solo operador o por un equipo de tres personas, siendo cada miembro responsable de la extracción del corazón del donante, la preparación del receptor y la anastomosis del corazón del donante, respectivamente. Todo el procedimiento se completa en 10 minutos, lo que permite una generación rápida, de alto rendimiento y estandarizada del modelo.

Los experimentos con animales de este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Hospital Fuwai, Academia China de Ciencias Médicas (Aprobación nº 0108-1-70-ZX(X)-41). Todos los procedimientos se realizaron en estricta conformidad con las normativas y directrices éticas de bienestar animal para garantizar el cumplimiento de los estándares pertinentes. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación preoperatoria

1. Preparación del puño
   1. Utiliza tubos de poliimida para fabricar los manguitos para la cirugía de trasplante. Para el manguito arterial, selecciona tubos de poliimida con un diámetro interior de 0,3–0,5 mm y córtalo en segmentos de 2 mm bajo un estereomicroscopio (aumento de 10× a 20×).
   2. Corta parcialmente la sección de la abrazadera de cada segmento por la mitad de forma circunferencial para formar una extensión similar a un mango. Para el manguito venoso, selecciona tubos de poliimida con un diámetro interior de 0,4–0,7 mm y córtalo en segmentos de 3 mm. De manera similar, corta parcialmente la sección de la abrazadera por la mitad de forma circunferencial para crear una extensión similar a un asa.
      NOTA: Remojad los manguitos en etanol al 75% durante 30 minutos y luego enjuaga bien con solución salina normal.
2. Preparación para ratones: Utilizar ratas neonatales Sprague-Dawley (SD) de 10 a 12 días como donantes, y ratones C57BL/6 o Balb/c de 7 a 8 semanas como receptores. Para garantizar un cuidado adecuado y minimizar el estrés, transporta a las ratas donantes neonatales junto con la madre. Alojar a todos los animales en un entorno específico libre de patógenos (SPF).

2. Extracción de corazón por donante

1. Fijación y anestesia
   1. Anestesiar ratas neonatales mediante inyección intraperitoneal de 30 μL/g de tribromoetanol (Jitianbio, JT0781) (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados).
   2. Una vez completamente anestesiado, coloca a la rata en posición supina y asegúrala bajo un estereomicroscopio. Desinfecta la zona toracoabdominal usando algodón empapados en povidona y yodo.
      NOTA: Manipular el tribromoetanol con guantes y protección ocular en un área ventilada; Evita el contacto con la piel e inhalación.
2. Heparinización
   1. Desinfecta la zona toracoabdominal usando algodón empapados en povidona y yodo. Mueve suavemente los intestinos a un lado usando un hisopo de algodón para exponer la vena cava inferior.
   2. Inyectar solución fisiológica heparinizada (0,2–0,5 mL) en la vena cava inferior usando una jeringuilla de insulina, seguida de una compresión suave del lugar de la inyección con una bola de algodón para evitar el sangrado.
      NOTA: Llevar guantes y protección ocular al preparar o inyectar solución salina heparinizada; Desecha las jeringuillas como residuo punzante. Prepara solución salina heparinizada disolviendo un vial de heparina sodiosa de grado médico (125 mg) en 100 mL de solución salina normal.
3. Paro cardíaco
   1. Incisa el diafragma, corta la pared torácica bilateralmente y retraésala para exponer completamente el corazón. Quita el timo. Seccionar la vena cava superior para aliviar la presión y perfundir 1 mL de solución de la Universidad de Wisconsin (UW) en la aorta para inducir un paro cardíaco.
   2. Continúa con la perfusión hasta que el corazón cambie de rojo a pálido. Simultáneamente, coloca una gasa empapada en solución salina helada sobre el corazón para bajar su temperatura y evitar la deshidratación.
      NOTA: Corta gasas estériles en trozos de 1 cm × 1 cm y predéjalos en suero liso bien frío antes de usarlos.
4. Extracción del corazón donante
   1. Liga la vena cava superior e inferior con una sutura de seda 8–0, y luego transectalas. Corta la aorta en el arco aórtico y secciona la arteria pulmonar en su bifurcación.
   2. Finalmente, liga todas las venas pulmonares con un 8-0 sutura de seda y extirpa el corazón del donante. Almacena temporalmente el corazón cosechado en solución salina helada para su conservación.

3. Preparación para el destinatario

1. Anestesia
   1. Anestesiar al ratón receptor usando el mismo método y colocarlo en posición supina para estabilizarlo.
2. Desinfección
   1. Elimina el vello de la zona del cuello usando una crema depilatoria, seguida de una desinfección cutánea con povidona-yodo.
3. Incisión cutánea
   1. Realiza una incisión longitudinal de 2 cm aproximadamente a 1 cm a la derecha de la línea media del cuello usando tijeras oftálmicas. Realizar una disección contundente para eliminar gradualmente la grasa subcutánea y las capas musculares, y extirpar la glándula submandibular.
      NOTA: Al extirpar la glándula submandibular, los vasos sanguíneos basales deben ligarse con una sutura de seda 8–0 o cauterizarse con un bolígrafo electrocauterizado para evitar sangrados.
4. Preparación de la vena yugular externa
   1. Tras exponer la vena yugular externa, cauterizar individualmente las ramas usando un corral electrocauterizado en modo de baja coagulación (5–10 W). Puesto dos 8-0 suturas de seda cerca del extremo distal de la vena para la ligadura.
   2. Utiliza tijeras microquirúrgicas para seccionar la vena yugular externa entre las dos ligaduras. Introduce la vena yugular externa a través del manguito venoso, empuja el manguito hacia la base de la vena y fíjalo con una pinza vascular.
   3. Retira las ligaduras con tijeras microquirúrgicas y elimina la sangre residual dentro de la vena usando solución salina heparinizada. Everte la vena yugular externa sobre el manguito usando pinzas microquirúrgicas y arréglala con un 8-0 sutura de seda.
      NOTA: Maneja cuidadosamente el bolígrafo de electrocauterización y ten cuidado de evitar quemaduras. La vena yugular externa tiene múltiples afluentes que deben aislarse y sellarse cuidadosamente para minimizar el sangrado.
5. Preparación de la arteria carótida
   1. Realizar una disección roma posterior al músculo esternocleidomastoideo para localizar la vaina carótida. Abrir la vaina carótida y separar cuidadosamente la arteria carótida común de la vena yugular interna y el nervio vago.
   2. Liga y corta la arteria de la misma manera que la vena. Inserta el extremo inferior de la arteria seccionada a través del manguito arterial, evírala y fijala en su lugar.
      NOTA: La arteria carótida, la vena yugular interna y el nervio vago están encerrados dentro de la vaina carótida. Al abrir la vaina, hay que tener cuidado para no dañar el nervio vago. La arteria carótida tiene un diámetro menor que la vena yugular externa, pero es más elástica, lo que dificulta la aversión que la vena.

4. Anastomosis cardíaca de donante

1. Anastomosis de la arteria aorta-carótida
   1. Después de recortar el corazón donante, colócalo inmediatamente en el cuello del ratón receptor. Usa un 8-0 sutura de seda con un nudo suelto para crear un lazo alrededor de la aorta donante.
   2. Desliza la aorta donante sobre el manguito arterial en la arteria carótida del receptor y asegura con un 8-0 Ligadura de seda.
      NOTA: Al asegurar la aorta, la sutura debe atarse por encima de la línea de ligadura de la arteria carótida para evitar el contacto directo entre el sitio de la ligadura y la sangre del receptor.
2. Anastomosis de la arteria pulmonar a la vena yugular externa
   1. Usa un 8-0 Sutura de seda con un nudo suelto para crear un lazo alrededor de la arteria pulmonar donante. Desliza la arteria pulmonar sobre el manguito venoso en la vena yugular externa del receptor y asegura con un 8-0 Ligadura de seda.
3. Reanudación cardíaca
   1. Libera las pinzas vasculares de la arteria carótida y la vena yugular externa del receptor para restablecer el flujo sanguíneo. Observa que el corazón del donante vuelve a tener contracciones fuertes y se vuelve rojo rápidamente en menos de 10 segundos.
4. Cierre de la incisión
   1. Una vez que el corazón del donante recupere un ritmo estable, ajusta su posición y cierra la incisión cutánea en el cuello del receptor con suturas 4-0. Desinfecta el sitio quirúrgico con povidona-yodo.

5. Cuidados postoperatorios

1. Analgesia postoperatoria
   1. Aplica gel de lidocaína tópicamente para aliviar el dolor tras cerrar la piel. Si el ratón muestra signos significativos de dolor, administre meloxicam (2 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.
      NOTA: El meloxicam se disuelve en un 10% de DMSO y un 90% de aceite de maíz, y el volumen de inyección se calcula en función de la dosis requerida.
2. Recuperación
   1. Coloca el ratón sobre una almohadilla tibia y suave mantenida a 37–38 °C para preservar la temperatura corporal y vigílalo hasta que recupere la conciencia. Una vez completamente despierto, guarda al ratón individualmente en una jaula con acceso adecuado a comida y agua.
3. Monitorización
   1. Monitoriza diariamente el corazón trasplantado mediante inspección visual y palpación para evaluar su latido y la viabilidad general del injerto.
      NOTA: Realizar todos los procedimientos utilizando el EPP adecuado y seguir las normativas institucionales de bioseguridad y cuidado animal. Todos los residuos químicos, perfusados y tejidos animales generados durante el experimento deben ser recogidos y eliminados conforme a la normativa institucional. Las soluciones que contienen tribromoetanol o heparina deben tratarse como residuos químicos peligrosos, mientras que los tejidos animales y los materiales derivados de la sangre deben manipularse como residuos biológicos y esterilizarse mediante autoclave o ser eliminados a través de instalaciones certificadas.

Resultados

La Figura 1 muestra el flujo de trabajo colaborativo estandarizado de tres personas para generar un modelo de xenotrasplante murino. En este sistema, tres operadores trabajan en paralelo, cada uno realizando una tarea designada repetidamente: preparación del receptor, obtención de corazón por donante o anastomosis cardíaca por donante. Esta división del trabajo permite terminar un modelo completo de trasplante cada 10 minutos. Mientras que un solo operador p...

Discusión

El xenotrasplante murino es un procedimiento altamente invasivo que exige un alto nivel de competencia técnica y consistencia por parte del operador. Durante el establecimiento del modelo, el operador tiene un impacto significativo en los resultados^{experimentales 14,15}. En un flujo de trabajo de una sola persona, la complejidad y duración del procedimiento resultan en un tiempo de operación aproximado de 30 minutos por modelo, lo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-CD3 antibody	Abcam	ab16669
Anti-CD68 antibody	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
Depilatory cream	Veet	-
Electrocautery pen	Yuyan Instrument	-
Fluorescent secondary antibodies	Thermofisher	A-11008
HE staining kit	Beyotime	C0105S
Ice maker	Shjingmi	IMS-20
Insulin syringes	KDL	U-40
Lidocaine gel	Tide Pharm
Meloxicam	Sigma-Aldrich	444800
Microsurgical forceps	ZHENHAO	FS217
Microsurgical needle holders	BIOFIVEN	HH01231
Microsurgical scissors	ZHENHAO	FS237
Normal saline	Kelun Pharmaceutical	-
Polyimide tubing	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Diámetro interior: 0.3-0.5 mm
Polyimide tubing	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Diámetro interior: 0.4-0.7 mm
Povidone-iodine solution	INOHV	-
Sodium heparin	Qianhong bio-pharma	-
Stereomicroscope	Murzider	MSD204
Surgical sutures	Jinhuan Medical	Suturas de seda 8-0 y 4-0
Surgical warming pad	Hani Pet	-
Tribromoethanol	Jitianbio	JT0781
University of Wisconsin solution	Belzer	-
Vascular clamps	RWD Life	R31005-10