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Artículo de método

Avances en el perfil metabólico de esferoides tumorales cerebrales tridimensionales para la detección de fármacos

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DOI:

10.3791/68833

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5 de septiembre de 2025

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1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, establecemos una plataforma de perfiles metabólicos que integra esferoides de glioma tridimensionales (3D) y normalización basada en imágenes a través del análisis de flujo extracelular. Este enfoque permite una evaluación más precisa de las respuestas metabólicas de los tumores a los tratamientos farmacológicos y proporciona información sobre los posibles mecanismos de resistencia.

Resumen

Los tumores cerebrales, especialmente los gliomas, son difíciles de tratar debido a su naturaleza agresiva, microambiente tumoral complejo y resistencia a las terapias convencionales. Los cultivos celulares bidimensionales (2D) tradicionales a menudo no logran replicar el verdadero entorno tumoral, lo que lleva a predicciones inexactas de la eficacia del fármaco. La tecnología de análisis de flujo extracelular, que se utiliza normalmente para el análisis metabólico en tiempo real en cultivos 2D, mide parámetros metabólicos clave, como la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR), lo que proporciona información sobre el metabolismo celular. El uso de modelos 3D representa un avance significativo, ya que imitan con mayor precisión el entorno tumoral in vivo . El analizador de flujo extracelular se adaptó a modelos celulares de glioma tridimensionales (3D), lo que permitió el análisis de vías metabólicas críticas, incluida la glucólisis y la fosforilación oxidativa, en un contexto fisiológicamente más relevante.

Las células U87 se sembraron a densidades apropiadas en una placa de 96 pocillos de baja adherencia y se cultivaron durante 5 días. El día 5, se observó la formación de esferoides 3D a través de imágenes de alto contenido. Los esferoides formados con éxito se transfirieron a una placa de ensayo metabólico recubierta con poli-L-lisina para su análisis metabólico. Para mejorar la precisión de estas mediciones, los sistemas de imágenes de alto contenido evalúan el tamaño de las células en 3D, lo que permite una normalización precisa de los datos de flujo extracelular y minimiza las variaciones metabólicas debidas a las diferencias en el tamaño de las células. Este enfoque integrado proporciona un análisis más confiable de las respuestas metabólicas de las células de glioma a los tratamientos farmacológicos, revelando mecanismos potenciales de resistencia a los medicamentos. En última instancia, esta metodología ofrece información valiosa sobre la dinámica metabólica de los gliomas y apoya el desarrollo de estrategias terapéuticas novedosas y clínicamente relevantes.

Introducción

Los gliomas, una forma prevalente y agresiva de tumor cerebral, plantean desafíos clínicos significativos debido a su rápida progresión, microambiente tumoral altamente heterogéneo y marcada resistencia a las terapias convencionales1. Estas complejidades requieren modelos experimentales fisiológicamente más relevantes para mejorar la precisión de las evaluaciones terapéuticas. Los sistemas tradicionales de cultivo celular bidimensional (2D) no recapitulan la arquitectura tumoral in vivo y las interacciones célula-célula2, lo que a menudo lleva a conclusiones engañosas sobre la eficacia de los fármacos y la biología tumoral3.

Para abordar estas limitaciones, los modelos tumorales tridimensionales (3D) han surgido como una alternativa superior, que ofrece una mayor relevancia biológica al imitar las características estructurales y funcionales de los tumores in vivo 4,5. Al mismo tiempo, la reprogramación metabólica se reconoce cada vez más como un sello distintivo de la progresión del glioma y la resistencia al tratamiento 6,7,8. El análisis de flujo extracelular se ha convertido en una técnica ampliamente adoptada para la medición en tiempo real de parámetros metabólicos clave, como la tasa de acidificación extracelular (ECAR, que mide el flujo de protones principalmente de la producción de lactato glucolítico) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR, que cuantifica la utilización de oxígeno mitocondrial en la fosforilación oxidativa), proporcionando información crítica sobre las vías de fosforilación glucolítica y oxidativa 9,10,11.

En este estudio, el análisis de flujo extracelular se adaptó para analizar esferoides de glioma 3D, lo que permitió la investigación de vías metabólicas en un contexto que se asemeja mucho a las condiciones tumorales in vivo . Las células de glioma U87 se sembraron a una densidad de 1.500 células por pocillo en placas transparentes de fondo redondo de ultra baja adherencia de 96 pocillos y se cultivaron durante 5 días a 37 °C con 5% de CO2 para facilitar la formación de esferoides. Se emplearon imágenes de alto contenido para confirmar la morfología del esferoide y evaluar el tamaño de la célula. Antes del análisis metabólico, se transfirieron esferoides celulares 3D densos y circulares con un diámetro de aproximadamente 220 μm a placas de ensayo previamente recubiertas con poli-L-lisina para garantizar la adhesión y la estabilidad de la medición. Es importante destacar que la normalización de los datos metabólicos sobre la base del tamaño del esferoide se llevó a cabo mediante imágenes integradas de alto contenido, lo que redujo la variabilidad y mejoró la confiabilidad de los datos.

Esta plataforma integrada, que combina cultivo 3D, tecnología de análisis de flujo extracelular y normalización basada en imágenes, permite una evaluación más precisa de las respuestas metabólicas del glioma a las intervenciones terapéuticas. Este estudio proporciona un marco sólido para estudiar los fundamentos metabólicos de la resistencia a los medicamentos y contribuye al desarrollo de estrategias de tratamiento más efectivas y clínicamente traducibles para los gliomas.

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Protocolo

NOTA: Las especificaciones completas de todos los reactivos y consumibles se detallan en la Tabla de materiales.

1. Cultivo celular 2D

  1. Mantener las células U87 en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (v/v) en condiciones estériles. Realice procedimientos de paso estándar una vez que las células alcancen el 80% de confluencia.
    NOTA: A lo largo del proceso de cultivo, controle de cerca el estado celular y excluya las células que exhiban un crecimiento anormal o cambios morfológicos de los experimentos posteriores.
  2. Siembra las células U87 en placas de cultivo celular de 10 cm e incuba en una incubadora de cultivo celular estéril a 37 °C con 5% (v/v) de CO2 y 90-95% de humedad relativa.
    NOTA: El medio debe reemplazarse regularmente para mantener condiciones óptimas de crecimiento.

2. 3D formación de esferoides celulares

  1. Preparación experimental
    1. Revise todo el flujo de trabajo de la Figura 1 antes de comenzar los procedimientos experimentales.
      PRECAUCIÓN: Siga estrictamente las técnicas asépticas durante todo el experimento para garantizar la salud celular y evitar la contaminación.
  2. Disociación y recuento celular
    1. Retire el medio gastado de la placa de cultivo celular y lave las células U87 tres veces con 9 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (3 ml por lavado). Deseche los reactivos usados en una solución de lejía al 20-25% (v/v) para inactivar todos los materiales bioactivos.
    2. Añadir 1 ml de solución de tripsina a la placa e incubar a 37 °C durante 2-3 min. Neutralice la tripsina con 2 ml de DMEM que contenga un 10% de FBS precalentado a 37 °C una vez que todas las células se desprendan bajo observación microscópica.
    3. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugue a 200 × g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de DMEM suplementado con FBS al 10%. Pipetear las células suavemente para asegurar una suspensión celular uniforme. Luego cuente a través de un hemocitómetro o contador de células automatizado y registre el recuento inicial de células.
      NOTA: Manipule las celdas con cuidado durante el lavado y la adición de medios para evitar daños mecánicos. La fuerza de pipeteo se puede controlar para evitar la formación de burbujas, lo que puede afectar a la viabilidad celular y a la precisión del recuento.
  3. Dilución de suspensión celular
    1. Precalentar el medio no utilizado a 37 °C. Mantener las suspensiones celulares a temperatura ambiente (RT; 25 ± 2 °C) durante 30 min.
    2. Sobre la base del recuento inicial de células, diluya la suspensión celular con DMEM que contenga 10% de FBS hasta un volumen final de 20 ml, asegurando aproximadamente 200.000 células.
      NOTA: Antes de la dilución final, pipetee suavemente la suspensión celular para evitar la sedimentación. El medio no utilizado se mantuvo a 37 °C y las suspensiones celulares se incubaron a temperatura ambiente. Si se sembraron 96 pocillos con 1.500 células por pocillo, se preparó un volumen total de 22 mL para compensar el exceso. La suspensión de células diluidas se transfirió a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml y se mezcló bien.
  4. Siembra de células en placas de 96 pocillos de fijación ultrabaja
    1. Mezcle bien la suspensión celular final con una pipeta de 200 μl. Agregue 200 μL de la suspensión (1.500 células/pocillo) lentamente a cada pocillo de una placa transparente de fondo redondo de 96 pocillos de fijación ultrabaja a lo largo del borde.
      NOTA: Para mayor eficiencia, considere el uso de una pipeta multicanal.
    2. Deseche cualquier suspensión restante después de que se llenen todos los pocillos para evitar la contaminación.
  5. Centrifugación
    1. Selle la placa herméticamente con parafilm para evitar fugas durante la centrifugación. Centrifugar la mezcla a 200 × g durante 2 min para granular las células del fondo de cada pocillo.
    2. Retire la placa de la centrífuga, retire con cuidado el parafilm y coloque la placa en una incubadora de 37 °C, 5% deCO2 .

3. Recubrimiento de poli-D-lisina de las placas de ensayo metabólico

NOTA: La microplaca de ensayo metabólico es una microplaca especializada diseñada para la adhesión de esferoides celulares durante el análisis de flujo extracelular.

  1. Prepare una solución de recubrimiento disolviendo 5 mg de poli-D-lisina en 50 ml de agua estéril. Homogeneizar.
  2. Agregue 30 μL de la solución de recubrimiento a cada pocillo de la placa de ensayo metabólico. Asegure la ausencia de burbujas agitando o aspirando suavemente el exceso de solución.
  3. Incube la placa y cúbrala durante 20 min a temperatura ambiente. Aspire la solución de recubrimiento y lave los pocillos dos veces con 200 μL de agua estéril.
  4. Seque al aire la placa durante al menos 30 min y luego caliente a 37 °C sin CO2 durante 30 min para estabilizar el recubrimiento.
  5. Agregue 175 μL de medio precalentado a cada pocillo y mantenga la placa a 37 °C en una incubadora sin CO2 hasta que esté lista para la transferencia de esferoides celulares.

4. Monitoreo del crecimiento de esferoides

  1. Transfiera las placas esferoides a un sistema de imágenes de alto contenido después de 5 días de cultivo.
  2. Configuración de los parámetros de imagen: Ajuste la temperatura a 37 °C y el CO2 al 5%, y ajuste el tipo de placa, los canales y el rango de enfoque.
  3. Adquiera imágenes esferoides a través de un microscopio confocal con objetivos de 10x y un software de imágenes.
  4. Identifique los pozos que contienen esferoides intactos (p. ej., Figura 2A-C) y registre sus posiciones para la transferencia. Excluir pocillos con esferoides irregulares (p. ej., Figura 2D)".

5. Tratamiento de esferoides

NOTA: El tratamiento farmacológico se realizó en esferoides 3D maduros para evaluar las respuestas metabólicas.

  1. Asignación de grupos de esferoides
    1. Asigne esferoides intactos a dos grupos:
      Grupo control: 6 pocillos replicados
      Grupo de tratamiento: 6 pocillos replicados (tratados con fenofibrato)
  2. Preparación de la solución farmacológica
    1. Preparar la solución de trabajo de fenofibrato en medio fresco precalentado a la concentración óptima (por ejemplo, 100 μM).
      NOTA: Los grupos de tratamiento se reconstituyeron en 100% de DMSO para crear soluciones madre, que posteriormente se diluyeron en medio fresco precalentado. A los grupos de control se les administró la misma concentración final de DMSO (0,1% v/v) que estaba presente en las muestras tratadas con fármacos. La concentración final se determinó mediante ensayos de dosis-respuesta.
  3. Reemplazo medio
    1. Aspire 100 μL de medio de cada pocillo lentamente a lo largo de la pared.
      NOTA: Evite el contacto con el fondo del pozo para evitar la perturbación de los esferoides.
    2. Agregue 100 μL de medio fresco a los pocillos de control.
    3. Agregue 100 μL de solución de trabajo de fenofibrato a los pocillos de tratamiento.
  4. Incubación posterior al tratamiento
    1. Vuelva a colocar la placa suavemente a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%. Cultura durante 72 h.
  5. Evaluación morfológica
    1. Evalúe la integridad de los esferoides siguiendo el procedimiento de imagen en el paso 4.

6. Transferencia de esferoides celulares

  1. Retire con cuidado la placa de baja adherencia que contiene esferoides del sistema de imágenes y colóquela sobre una superficie estéril dentro de un gabinete de bioseguridad. Coloque la placa de ensayo recubierta de poli-L-lisina adyacente entre sí para su transferencia.
  2. Recorte la punta de una pipeta de 20 μl para facilitar la aspiración suave de los esferoides celulares sin dañarlos.
  3. Aspire suavemente cada esferoide intacto del fondo del pocillo y transfiéralo al pocillo correspondiente de la placa celular, dejándolo reposar durante 20 s. Confirmar la adhesión por ausencia de fragmentos flotantes bajo microscopía 10×.
  4. Repita para todos los esferoides y verifique la eficiencia de transferencia a través del sistema de imágenes descrito en el paso 4.

7. Ensayo metabólico

  1. Desgasificación de muestras
    1. Coloque la placa de ensayo de esferoides tratada con fármaco en una cámara de hidratación preequilibrada a 37 °C sin CO2.
      NOTA: La desgasificación continua se realizó durante 1 h con un estricto control ambiental para garantizar la precisión de la medición metabólica.
  2. Preparación de reactivos y administración de medicamentos
    1. Prepare paralelamente el reactivo y cargue el fármaco durante el período de desgasificación de 1 h.
      NOTA: El objetivo principal de este experimento es evaluar el estrés mitocondrial; Todos los procedimientos deben estar meticulosamente alineados con este objetivo. Se deben seguir protocolos específicos para distintos tipos experimentales para garantizar la precisión y confiabilidad de los datos.
    2. Preparación de medicamentos: Use los siguientes compuestos:
      Oligomicina (inhibidor del complejo V mitocondrial)
      Cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP, desacoplador)
      Una mezcla de rotenona (un inhibidor del complejo I) y antimicina A (un inhibidor del complejo III)
      NOTA: Los medicamentos se obtuvieron del kit de prueba de esfuerzo mitocondrial utilizado en este estudio. Algunos compuestos son biopeligrosos; Se deben utilizar protocolos estrictos de bioseguridad (equipo de protección personal y preparación para emergencias).
    3. Formulación de medicamentos
      1. Prepare las soluciones madre de los medicamentos en polvo como se muestra en la Tabla 1.
      2. Diluir las soluciones madre hasta las concentraciones de trabajo especificadas en la tabla 2.
        NOTA: Las soluciones se agitan en vórtices o se agitan a fondo para garantizar la homogeneidad en los gradientes de concentración.
  3. Carga de compuestos en cartuchos de sonda de detección
    NOTA: El cartucho de sonda de detección es un cartucho desechable que contiene sondas biosensoras para la medición en tiempo real de oxígeno y pH.
    1. Activación del cartucho de sonda (debe preceder a la carga del compuesto):
      NOTA: Asegúrese de que el sensor se active completando estos pasos al menos 12 h antes de su uso:
      1. Añadir 200 μL de la solución calibrante a cada pocillo de la placa de hidratación.
      2. Coloque el cartucho de la sonda de detección con cuidado en la placa de hidratación, asegurando la inmersión completa de todas las sondas en la solución de calibración.
      3. Incube la unidad ensamblada en una incubadora libre deCO2 a 37 °C durante 12-24 h para activar los sensores.
        NOTA: La inmersión incompleta o la hidratación insuficiente provocan una deriva de medición (±15% de error de OCR).
    2. Utilice pipetas multicanal o electrónicas para administrar volúmenes precisos en los pocillos, evitando gotas residuales en los bordes de los pocillos.
      NOTA: Como no se necesita estimulación aguda con medicamentos, siga las secuencias de carga estándar.
    3. Coloque la placa de la sonda sobre una superficie estable después de la carga para evitar molestias durante el transporte.
      NOTA: La precisión de carga afecta significativamente los resultados.
  4. Configuración del software
    1. Inicie el software y seleccione el protocolo de ensayo de prueba de esfuerzo mitocondrial.
    2. Asigne grupos de acuerdo con la agrupación experimental predefinida.
    3. Establezca el nombre del archivo y haga clic en Iniciar ejecución.
  5. Calibración de cartuchos de sonda de detección.
    1. Inserte suavemente la placa de sonda cargada en la ranura del instrumento según las indicaciones del sistema.
    2. Iniciar la calibración (15-20 min). Mantener condiciones estables; Evite las vibraciones.
    3. Retire la placa de hidratación inmediatamente después de la calibración (siguiendo las instrucciones en pantalla).
      NOTA: Retire la tapa de la placa antes de la calibración.
  6. Perfil metabólico de esferoides 3D
    1. Transfiera la placa de ensayo esferoide 3D desgasificada a la ranura de medición del instrumento. Asegure una alineación precisa con la matriz de sondas confirmando lo siguiente: (i) Guías de ranura de coincidencia de esquinas de placa; (ii) El pozo A1 se alinea con la posición indexada; (iii) No hay espacio visible entre la placa y la superficie del instrumento
    2. Haga clic en Iniciar para iniciar ensayos de estrés mitocondrial (duración: ~1,5 h). Supervise los parámetros del instrumento en todo momento.
      NOTA: Retire las tapas de la placa de ensayo esferoide 3D antes de la medición.
  7. Análisis de datos
    1. Análisis de imágenes
      1. Transfiera placas de ensayo de esferoides 3D a un sistema de imágenes de alto contenido.
        NOTA: Las imágenes se adquirieron como se describe en el paso 4. Las imágenes revelaron que la mayoría de los esferoides permanecieron intactos, mientras que una minoría sufrió daños durante el proceso de transferencia, como se muestra en la Figura 3.
      2. Analice los datos morfológicos (por ejemplo, área, longitud, anchura) de los esferoides celulares a través de la versión 5.2 del software Harmony, siguiendo los pasos 7.7.1.3-7.7.1.7.
      3. Aplique el módulo Región de textura de forma gruesa para separar los esferoides 3D del fondo dividiendo el contenido de la imagen en tres grupos en función de las características de textura de los objetos en las imágenes.
      4. Aplique el módulo Buscar región de imagen para refinar la separación de esferoides 3D preaislados a través de características de tamaño basadas en volumen para eliminar impurezas y retener esferoides intactos.
      5. Mida los parámetros morfológicos de los esferoides 3D a través del módulo Propiedades de morfología .
      6. Aplique el módulo Seleccionar población para filtrar en última instancia los esferoides de células 3D genuinos.
      7. Exporte los resultados de los datos morfológicos, como se muestra en la Tabla 3.
    2. Procesamiento de datos
      NOTA: Normalice los datos de la celda a través de parámetros de las salidas de imágenes para minimizar los artefactos experimentales.
      1. Abra los datos metabólicos sin procesar a través del software de análisis.
      2. Seleccione la opción de normalización para acceder a la interfaz de edición del modo de normalización.
      3. Introduzca el área de la sección transversal de los esferoides contenidos en cada pocillo correspondiente de la placa de ensayo en el campo Valores de normalización .
      4. Establezca el parámetro de factor de escala en 1.000.000.
      5. Haga clic en el botón Aplicar para finalizar el proceso de normalización. Los resultados finales se muestran en la Figura 4.

8. Eliminación de residuos

  1. Deseche todos los desechos experimentales (medios, reactivos, consumibles y suspensiones celulares) de acuerdo con los protocolos de gestión de desechos de laboratorio y riesgos biológicos. Autoclave o desinfecte químicamente los residuos bioactivos antes de su eliminación para evitar la contaminación ambiental.

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Resultados

Los tres pasos más críticos en el proceso de detección del metabolismo energético de los esferoides celulares 3D son el cultivo de esferoides celulares 3D, el proceso de transferencia de esferoides y la obtención de imágenes y cuantificación de esferoides después de la detección (Figura 1). Además, observar el estado de los esferoides celulares es muy importante. Cuando los experimentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos experimentales mencionados anteriormente, los esferoides s...

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Discusión

La adaptación del análisis del flujo extracelular a los modelos de glioma 3D representa un avance metodológico crítico en el estudio del metabolismo de las células tumorales. Si bien los cultivos 2D tradicionales han servido durante mucho tiempo como base para la experimentación in vitro , no logran capturar la arquitectura espacial, las interacciones célula-célula y célula-matriz, y los gradientes de oxígeno y nutrientes característicos de los tumores in vivo

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, con los números de subvención 82471329 y 82001248.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Plato de 10 cmCorning430167
Tubo de centrífuga de 15 mlCorning430791
Tubo de centrífuga de 50 mlCorning430828
Calceína, AMInvitrogenC1430
Condesa 3Termo FisherContador automático de células
Suero fetal bovinoGibcoA5669701
Armonía 5.2PerkinElmerSoftware de imágenes
Hoechst 33342SolarbioC0031
MEM EBSS MedioHyCloneSH30024.01
Opereta CLSPerkinElmerSistema de análisis de imágenes de alto contenido
PBSHyCloneSH30256.01
Bromhidrato de lisina poli-DSigma P7280
Placas de 96 pocillos de fijación ultrabaja de fondo redondoCorning4515
Software de escritorio Seahorse WaveAgilent
Caballito de mar XFe96AgilentMáquina de pruebas metabólicas extracorpóreas
Sorvall ST8RTermo FisherCentrífuga
TRIPSINA 0,25% EDTAGibco25200072
Línea celular U87MGInfraestructura nacional de recursos celulares
Solución de glucosa XF 1.0 M, 50 mlAgilent103577-100
Solución de piruvato XF 100 mM, 50 mlAgilent103578-100
Solución de glutamina XF 200 mM, 50 mlAgilent103579-100
Solución calibrante XF 500 mL Agilent100840-000
Kit de prueba de esfuerzo XF Cell MitoAgilent103015-100
Medio XF DMEM, pH 7,4, 500 mlAgilent103575-100
XFe96/XF Pro Matriz de sondas de detección de flujoAgilent103792-100
Placas de ensayo metabólicas XFe96/XF Pro FluxpakAgilent103792-100

Referencias

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