Normalización de la liberación de glicerol basada en MTT para una cuantificación precisa de la lipólisis en adipocitos epididimarios primarios de rata

Summary

Los artefactos experimentales, incluidas las fluctuaciones en la viabilidad celular y la interferencia del ensayo, dificultan la cuantificación precisa de la liberación de glicerol en adipocitos primarios ricos en lípidos. Para mitigar estos desafíos, se utiliza una estrategia de normalización basada en MTT para ajustar las mediciones de glicerol para la actividad metabólica celular, mejorando así la confiabilidad de la cuantificación de la lipólisis.

Abstract

La lipólisis, una vía metabólica crítica, implica la hidrólisis de los triglicéridos almacenados en ácidos grasos libres y glicerol. Sin embargo, la cuantificación precisa de la producción de glicerol en adipocitos primarios ricos en lípidos a menudo se confunde con artefactos experimentales, como la variabilidad en la viabilidad celular y la interferencia del ensayo. Para abordar estas limitaciones, se estableció un método sencillo para normalizar las mediciones de liberación de glicerol utilizando el ensayo de viabilidad celular basado en el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Este protocolo aprovecha la diferencia de gravedad específica entre los adipocitos y las soluciones acuosas, lo que permite la cuantificación simultánea de la producción lipolítica y la viabilidad celular. En experimentos de detección de fármacos, la pravastatina y la simvastatina mejoraron significativamente la liberación de glicerol de los adipocitos abdominales, mientras que la atorvastatina y la lovastatina no alteraron significativamente la producción de glicerol. Estos hallazgos sugieren que la normalización basada en MTT ofrece un enfoque robusto y conveniente para cuantificar con precisión la lipólisis, con aplicaciones potenciales en el descubrimiento de fármacos dirigidos a la obesidad y el síndrome metabólico. Este estudio subraya la necesidad de reevaluar los ensayos de lipólisis convencionales para distinguir las respuestas metabólicas genuinas de las fugas de membrana inespecíficas.

Introduction

El tejido adiposo se puede dividir en tejido adiposo blanco (WAT) y tejido adiposo marrón (BAT)¹. WAT realiza la función de almacenamiento de energía en exceso como triglicéridos, mientras que BAT tiene la función de generación de calor para mantener la temperatura corporal, lo que convierte la energía química en energía térmica bajo la estimulación del frío¹. El tejido adiposo también tiene función endocrina². Puede secretar una variedad de hormonas, citoquinas y metabolitos (denominados colectivamente adipocinas) y controlar el equilibrio energético del cuerpo al regular el comportamiento de búsqueda de alimentos del sistema nervioso central y la actividad metabólica^de los tejidos circundantes.

La lipólisis es un proceso de hidrólisis paso a paso de lípidos intracelulares bajo la acción de una serie de enzimas lipolíticas ^3,4. En los adipocitos, los lípidos se almacenan principalmente en gotas de lípidos en forma de triglicéridos⁵. Las gotas lipídicas están cubiertas con la proteína asociada a las gotas lipídicas de la familia de las perilipinas, que previene la hidrólisis de los triglicéridos por enzimas lipolíticas ^6,7. Sin embargo, cuando se mejora la señal de lipólisis, los niveles de expresión de la familia de las perilipinas en los adipocitos disminuyen y las enzimas lipolíticas ingresan a las gotas lipídicas ^3,4. En consecuencia, los triglicéridos se descomponen en glicerol y ácidos grasos libres ^3,4,5.

La lipólisis, la descomposición de los triglicéridos almacenados en glicerol y ácidos grasos libres, es un proceso fundamental en el metabolismo de los adipocitos⁸. Si bien la medición directa de productos de lipólisis como el glicerol proporciona información valiosa, la cuantificación precisa ha sido un desafío, particularmente en adipocitos primarios suspendidos debido a errores operativos derivados de las diferencias en el número de células entre los grupos experimentales. Este estudio tuvo como objetivo abordar este desafío mediante el empleo de un ensayo de viabilidad celular para normalizar la cuantificación de la liberación de glicerol de los adipocitos abdominales primarios de rata. Al estandarizar el método de medición, se aplicó el ensayo de liberación de glicerol normalizado como una herramienta potencial para el descubrimiento de fármacos dirigidos a la obesidad y el síndrome metabólico en adipocitos.

Protocol

Este protocolo aprovecha la diferencia de gravedad específica entre los adipocitos y las soluciones acuosas para permitir la medición simultánea de la liberación de glicerol (como indicador de lipólisis) y la viabilidad celular del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) en los mismos pocillos de una placa de 96 pocillos, lo que agiliza el flujo de trabajo experimental y mejora la eficiencia.

Todos los procedimientos con animales cumplieron con las pautas de ARRIVE y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación de los NIH No. 8023, revisada en 1978). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (aprobación número 202112, aprobada el 5 de mayo de 2021). Las ratas Wistar macho utilizadas en este estudio tenían al menos 8 semanas de edad con pesos corporales de ≥200 g en condiciones de alojamiento estándar. Se recolectó tejido adiposo blanco epididimario con rendimientos típicos de 0,6-0,8 g por rata. En particular, las ratas más viejas o las alimentadas con dietas altas en grasas exhibieron un aumento significativo de la masa de tejido adiposo blanco (a menudo 1,5-3 g), lo que requirió un ajuste proporcional de las concentraciones de enzimas digestivas (por ejemplo, colagenasa) para mantener una eficiencia constante de disociación tisular. El uso exclusivo de ratas macho evitó los posibles efectos de confusión de las fluctuaciones hormonales del ciclo estral de las hembras. La selección de cepas (por ejemplo, Sprague-Dawley, Wistar o Long-Evans) se mantuvo de manera consistente dentro de los experimentos para garantizar la uniformidad genética en las respuestas del tejido adiposo. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de adipocitos abdominales primarios de rata

1. Anestesiar a una rata Wistar adulta macho con una inyección intraperitoneal de hidrato de cloral al 7% (disuelto en H₂O destilado) (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
2. Confirme la anestesia completa verificando la ausencia de respuestas reflejas, luego haga una incisión abdominal en la línea media con tijeras quirúrgicas estériles.
3. Retire con cuidado el tejido graso visceral de los lados izquierdo y derecho de la almohadilla de grasa del epidídimo.
   NOTA: Los adipocitos del epidídimo son relativamente grandes y flotantes, lo que facilita la separación y el análisis.
4. Transfiera el tejido recolectado a solución salina tamponada con fosfato (PBS; Figura 1A).
5. Lave el tejido dos veces con PBS para eliminar las impurezas, incluidos los vasos sanguíneos adheridos y los coágulos de sangre.
6. Corta el pañuelo lavado en trozos pequeños.

2. Purificación de los adipocitos abdominales primarios de rata

1. Incubar el tejido adiposo disecado con tripsina y colagenasa tipo II (10 mg en 10 ml de solución de tripsina) a 37 °C durante 2 h bajo agitación.
2. Filtrar el tejido adiposo digerido a través de un colador celular (Figura 1A).
3. Centrifugar el filtrado a 120 × g durante 3 min a temperatura ambiente para eliminar la actividad enzimática residual.
4. Transfiera los adipocitos suspendidos (la capa blanca superior) a un tubo limpio y lávelos con PBS.
5. Centrifugar el filtrado a 120 × g durante 3 min a temperatura ambiente para eliminar el PBS.
6. Incube los adipocitos filtrados (la capa blanca superior) en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y solución de penicilina-estreptomicina al 1% durante no más de 30 min.

3. Análisis de la liberación de glicerol

1. Sembrar los adipocitos filtrados (10^{4-10 5} células por pocillo; 200 μL) en una placa de cultivo celular de 96 pocillos.
   NOTA: Los adipocitos se cuantificaron utilizando un hemocitómetro estándar. Debido a la gran variación en el tamaño de los adipocitos, algunas células más grandes no se pudieron contar con precisión. Por lo tanto, es posible que el recuento de células no refleje con precisión el número real de adipocitos. El objetivo principal era lograr una distribución uniforme de las células en los pocillos en lugar de una cuantificación exacta.
2. Tratar los adipocitos con dimetilsulfóxido (DMSO) al 0,05% y 50 μM de atorvastatina, pravastatina, lovastatina y simvastatina durante 4 h a 37 °C bajo agitación suave.
   NOTA: Estas condiciones de tratamiento se proporcionan como referencia y pueden ajustarse según sea necesario en función de los objetivos específicos y el diseño del experimento.
3. Recoger el medio de cultivo celular (la capa roja inferior) para analizar la liberación de glicerol, que indica el inicio de la lipólisis (Figura 1B).
4. Utilice un kit comercial de ensayo de liberación de glicerol para evaluar la lipólisis de adipocitos en respuesta a diferentes tratamientos.
5. Mida la absorbancia a 570 nm con un lector de microplacas.

4. Análisis de viabilidad celular

1. Disuelva el polvo de MTT a una concentración de 5 mg/ml en H₂O destilado y esterilice a través de un filtro de 0,22 μm antes de su uso.
2. Después del análisis de liberación de glicerol, agregue una solución de MTT (hasta un final de 0,5 mg / ml) a las células e incube a 37 ° C durante 2 h.
3. Transfiera los adipocitos suspendidos (la capa púrpura superior) a un tubo limpio que contenga DMSO para el análisis de la viabilidad celular (Figura 1B).
4. Vórtice brevemente para solubilizar los cristales de formazán púrpura formados.
5. Mida la absorbancia a 570 nm con un lector de microplacas.

5. Cálculo de normalización

1. Realice todos los experimentos por triplicado y repita cuatro veces (n = 4).
   NOTA: Para cada experimento independiente (n = 4), se aislaron adipocitos de tres ratas y cada condición de tratamiento se realizó por triplicado.
2. Para cada grupo de tratamiento, divida el valor de absorbancia de liberación de glicerol por el valor de absorbancia de viabilidad celular correspondiente.
3. Presente los datos como media ± desviación estándar (DE).
   NOTA: La media y la desviación estándar se calcularon utilizando Microsoft Excel con las funciones =PROMEDIO(rango) y =STDEV. S (rango). Para las comparaciones de grupos, se realizaron pruebas t de dos colas no apareadas utilizando GraphPad Prism 6 con la función t-test de Comparar medias.
4. Determinar la significación estadística de las diferencias entre los grupos mediante la prueba t de Student, con un valor de p inferior a 0,05 considerado estadísticamente significativo.

Results

Después de la detección preliminar de fármacos, se utilizaron estatinas antihiperlipidémicas para investigar los efectos lipolíticos en adipocitos mediante el método de liberación de glicerol normalizado⁹.

El impacto de las estatinas en la liberación de glicerol de los adipocitos abdominales primarios de rata
El efecto de las estatinas sobre la lipólisis en adipocitos abdominales primarios de rata se evaluó mediante el tratamiento de las células con ...

Discussion

Este estudio proporciona un método más preciso para medir la lipólisis en adipocitos primarios cargados de lípidos. Se encontró que la pravastatina y la simvastatina inducen la liberación de glicerol y reducen la viabilidad en los adipocitos del epidídimo de rata, mientras que la atorvastatina y la lovastatina no mostraron efectos significativos. La administración de simvastatina resultó en un aumento mínimo en la liberación de glicerol de los adipocitos. Para abordar este problema, se e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-µ Filtro M	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513165-0001	filtro de jeringa, sistema Aquo, estéril
Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio	Sangon Biotech Co. Ltd.	A600799-0001	1 gramo
Placas de cultivo celular de 96 pocillos	Sangon Biotech Co. Ltd.	F603204-0001	estéril
Sal de calcio de atorvastatina	Químico de las Islas Caimán	10493-5	5 miligramos
Filtro de celdas	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513450-0001	Malla de pantalla 80
Hidrato de cloral	Sangon Biotech Co. Ltd.	A500288-0250	250 gramos
Dimetilsulfóxido	Sangon Biotech Co. Ltd.	A460700-0100	100 ml
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600003	500 ml, glucosa alta, estéril
Suero fetal bovino	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600001	100 ml, estéril
Kit de ensayo colorimétrico de glicerol	Químico de las Islas Caimán	10010755-96	96 pozos
Lovastatina	Químico de las Islas Caimán	10010338-5	5 miligramos
Ratas adultas macho	Universidad de Putian	Wistar	aproximadamente 10-12 semanas
Solución de penicilina-estreptomicina	Sangon Biotech Co. Ltd.	B540732-0010	10 ml, estéril
Solución salina tamponada con fosfato	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607009-0500	500 ml, estéril, sin calcio ni magnesio
Sal sódica de pravastatina	Químico de las Islas Caimán	10010343-5	5 miligramos
Simvastatina	Químico de las Islas Caimán	10010344-5	5 miligramos
Solución de tripsina	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607003-0100	100 ml, sin EDTA y rojo de fenol, estéril
Colgenasa tipo II	Sangon Biotech Co. Ltd.	A004174-0100	100 miligramos