Identificación bioinformática de biomarcadores candidatos asociados a periodontitis en células madre del ligamento periodontal tratadas con citocinas

Resumen

El estudio actual tiene como objetivo explorar genes desregulados mediante análisis bioinformático en células madre periodontales tratadas con citocinas. Se identificaron ERC2-IT1 con aumento y EPB41L4A-AS1 con regulación a la baja como moléculas clave en estas células, que podrían servir como biomarcadores candidatos potencialmente asociados con la periodontitis.

Resumen

El objetivo principal del presente estudio fue investigar el posible mecanismo molecular subyacente a las células madre periodontales del ligamento (PDLSC) inducidas por citocinas. Los datos de microarrays del conjunto de datos GSE260558 se recuperaron de la base de datos omnibus de expresión génica (GEO). Tras la normalización, se identificaron los genes desregulados. Luego, los diferentes ARNm expresados (ARNm DE) fueron sometidos a análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) y de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG). Posteriormente, los genes hub fueron cribados basándose en la red de interacción proteína-proteína (PPI). Finalmente, las redes reguladoras competitivas de ARN endógeno (ceRNA) que contienen genes hub se establecieron utilizando la página web ENCORI. Se identificaron un total de 739 lncRNAs (DE-lncRNAs) expresados de diferentes maneras y 809 ARNm expresados de diferentes formas (ARNm) utilizando el paquete limma en el lenguaje de programación R. Después, los análisis GO y KEGG demostraron que los ARNm DE estaban estrechamente asociados con la inflamación y la formación de la matriz extracelular en los PDLSC tratados con citocinas. Se construyó una red de interacción proteína-proteína (IBP) para ARNm DE, y se obtuvieron genes hub evaluando el grado. Se examinaron un total de 12 genes hub regulados al alza y 12 genes hub regulados a la baja. Estos genes hub regulados al alza y a la baja se utilizaron para construir una red reguladora de ceRNA, respectivamente. En estas redes, el ERC2-IT1 con regulación al alza y el EPB41L4A-AS1 con regulación a la baja fueron considerados como ARNlnc clave en la periodontitis. En conclusión, el análisis bioinformático reveló varios genes clave y una red reguladora de ceRNA que participaron en la progresión de PDLSC inducidos por citocinas. Aunque este estudio identificó varios biomarcadores candidatos relacionados con la periodontitis, es necesaria una validación experimental adicional en modelos animales o muestras clínicas.

Introducción

Según la Organización Mundial de la Salud, la periodontitis es reconocida como la sexta enfermedad inflamatoria crónica más prevalente, ubicua e irreversible entre los humanos ^1,2. En la era actual, afecta a casi el 15% de la población^{mundial 1,2,3}. Se ha informado que la periodontitis está fuertemente correlacionada con diversos factores como la edad, el género, las prácticas de higiene bucal, el estado de tabaquismo, la etnia, el bajo nivel socioeconómico y una variedad de enfermedades^sistémicas 2,3,4,5. La periodontitis, que tiene una prevalencia notablemente alta entre adultos mayores, está patológicamente provocada por alteraciones disbióticas en la microbiota subgingival que se adhiere a los dientes ^6,7. Si no se trata, esta condición acaba provocando destrucción ósea, movimiento dental y la desafortunada pérdida de dientes^. Por ello, es urgente una comprensión exhaustiva de los mecanismos moleculares subyacentes a la periodontitis y la identificación de marcadores diagnósticos para la enfermedad.

La complejidad estructural e interactiva del tejido periodontal es ampliamente considerada como uno de los factores significativos que contribuyen a la considerable dificultad que se encuentra en el proceso de regeneración^{periodontal 9,10}. Entre la amplia gama de células madre mesenquimales (MSC) utilizadas para la regeneración periodontal, se ha demostrado de forma contundente que las células madre del ligamento periodontal (PDLSCs) son una fuente altamente fiable para la formación de nuevas estructuras similares al cemento en el entorno in ^{vivo 11,12}. En los recientes estudios preclínicos realizados, el tratamiento basado en PDLSC ha mostrado resultados extremadamente prometedores en el campo de la regeneración^{tisular 13,14}. En comparación con el tejido gingival del paciente, el análisis transcriptómico de las PDLSC mostró una mayor orientación funcional y potencial de transformación^{terapéutica 13,14}.

La tecnología bioinformática y los métodos de análisis bioinformático permiten a los investigadores identificar posibles procesos biológicos y asociaciones con estadísticas proteómicas, genómicas y^{metabolómicas 15,16}. Además, la naturaleza de alto rendimiento de la tecnología bioinformática también permite a los investigadores analizar conjuntos de datos biológicos a gran escala, como los generados a partir de secuenciación de nueva generación y experimentos con^{microarrays 17,18}. Esta capacidad permite identificar posibles biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico^{de la enfermedad 19,20}. Por ejemplo, se identificaron como biomarcadores novedosos en tejidos gingivales de pacientes con periodontitis en los tejidos gingivales de pacientes con periodontitis y un dominio tipo desintegrina y metaloproteasa con motivos de trombospondina tipo I tipo 3 (ADAMTSL3). Además, varios genes relacionados con la ferroptosis, incluyendo el coactivador del receptor nuclear 4 (NCOA4), el transportador de solutos 1A5 (SLC1A5) y la proteína de choque térmico B1 (HSPB1), se informaron de un mejor valor diagnóstico en periodontitis²². Sin embargo, el mecanismo molecular de la periodontitis merece una exploración más profunda. En el presente estudio, los investigadores buscan utilizar tecnología bioinformática para investigar genes hub en PDLSC inducidos por citocinas y para discernir posibles procesos y vías biológicas vinculadas a la periodontitis. El análisis bioinformático de PDLSC tratados con citocinas recoge programas transcripcionales impulsados por inflamación relevantes para la disfunción PDLSC, que abordan la brecha entre la disfunción PDLSC y la periodontitis. Estos genes y vías centrales en los PDLSC inducidos por citocinas ofrecen valiosas perspectivas sobre los mecanismos unificados que subyacen a la periodontitis.

Protocolo

1. Conjunto de datos

Este análisis utilizó datos públicos y no involucró a sujetos humanos ni animales, en cumplimiento de las directrices éticas institucionales y JoVE. Toda la información relacionada con las plataformas utilizadas está disponible en la Tabla de Materiales.

1. Seleccione un total de 6 muestras (GSM8119437, GSM8119438, GSM8119439, GSM8119440, GSM8119441 y GSM8119442) del conjunto de datos GSE260558 (National Center of Biotechnology Information Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558) para análisis bioinformático.
2. En estas muestras, cultiva células madre periodontales de ligamentos (PDLSCs) en un medio normal o en un medio que contenga citocinas inflamatorias durante 7 días.
3. Extraer el ARN total de los PDLSC y someterlo a secuenciación de alto rendimiento²³. El proceso de análisis bioinformático se muestra en la Figura 1.

2. Identificación de DEGs

1. Analizar los perfiles de expresión de lncRNA y mRNA utilizando el software limma (versión: 3.46.0) como se describió^{anteriormente 24}.
2. Realizar comparaciones por pares entre citocinas y grupos normales.
3. Utiliza la corrección de tasa de falsos descubrimientos (FDR) con un corte estándar de < 0,05 para identificar genes expresados de manera significativamente diferencial. Utiliza los valores p ajustados (FDR) para controlar la proporción de falsos positivos entre los resultados estadísticamente significativos.
4. Utiliza un corte ajustado de valores P de < 0,05 y un umbral de cambio de multiplicación de > 1 para identificar ARNnC o ARNm significativamente desregulados.
5. Presenta la expresión diferencial de genes en gráficos volcánicos (ggplot2: versión 3.4.1), que se generaron usando el software R (versión 4.0.4).
6. Enumera los 10 ARNlcRNA y ARNm más desregulados en tablas.

3. Análisis de enriquecimiento funcional

1. Realizar el análisis de enriquecimiento GO de los ARNm de GO utilizando la base de datos en línea DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/).
   1. Envía los genes desregulados al sitio web y selecciona términos GO, incluyendo función molecular (MF), procesos biológicos (BP) y componentes celulares (CC), para realizar el análisis GO.
   2. Envía los genes desregulados al plugin Cytoscape (versión: 3.8.2) ClueGO [16]+ y a la app Cluepedia.
   3. Aplicar la corrección de Benjamini-Hochberg para comparaciones múltiples y establecer el umbral de significación en un valor P ajustado < 0,05.
   4. Descarga los resultados de Cytoscape. Ordena los enriquecimientos en orden descendente según el valor P y presenta los 5 mejores enriquecimientos en cada categoría.
2. La Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) es un recurso valioso en la base de datos para comprender las funciones e impactos de alto nivel de los sistemas biológicos (http://www.genome.jp/kegg/).
   1. Realiza el análisis KEGG de forma similar eligiendo KEGG-PATHWAY en la página web.
   2. Fija el umbral de significación en un valor P ajustado < 0,05 y presenta los 10 principales enriquecimientos en este estudio. Realizar estos análisis de enriquecimiento según los estudios ^{reportados 25,26}.

4. Red PPI

1. Predecir y construir la red de interacciones proteína-proteína (PPI) utilizando la herramienta de búsqueda para la recuperación de genes interactuantes (STRING, versión 12.0).
2. Envía 318 ARNm regulados al alza o 465 ARNm regulados a la baja en la web de STRING para construir la red de IBP.
3. Exporta los datos de interacción de la red PPI y envía los datos al software Cytoscape.
4. Oculta el nodo individual en la red PPI. Descarga la red de IBP presente en este estudio.
5. Calcula las propiedades topológicas de la red, incluida la distribución de grados, usando la aplicación CentiScaPe, un complemento de Cytoscape.
6. Cuantifica la topología local de cada gen sumando el número de sus genes adyacentes y cuenta las interacciones para un nodo dado.
7. Ordena todos los genes de la red PPI en orden descendente según su grado de conectividad.
8. Selecciona los 12 genes con mayor regulación alza y los 12 genes con mayor regulación a la baja de esta lista clasificada como genes centrales.

5. Red reguladora miARN-mRNA

NOTA: La base de datos ENCORI (versión 12.0, https://rnasysu.com/encori/) se utilizó para predecir asociaciones regulatorias entre microARNs (miARN) y DE-INCRNAs (o genes centrales).

1. Enviar los genes hub con aumento o a la baja a ENCORI, y establecer el criterio de corte del programa ≥5 en total seis programas, incluyendo PITA, RNA22, miRmap, miRanda, PicTar y TargetScan, para el análisis de predicción en ENCORI.
2. Descarga los miARN predichos y envíalos a ENCORI para obtener posibles ARNnc.
3. Descargue las ARNCs predichas e identifique los ARNlcRNA superpuestos entre el paso 5.2 y la Figura 2.
4. Enviar los genes centrales, miARNs obtenidos en la sección 5.1 y los lncRNA obtenidos en el paso 5.3 al software Cytoscape (versión 3.4.0) para construir la red de ceRNA.

Resultados

Identificación de DEGs
El software limma R se utilizó para analizar los perfiles diferenciales de expresión de lncARN y ARNm. Las diferencias entre ambos grupos se determinaron mediante una prueba t no emparejada. Como se muestra en el diagrama del volcán (Figura 2), se identificaron un total de 739 lncRNAs expresados diferentes (DE-lncRNAs, valor p<0,05, |log2FC|>1). Entre estos DE-INCRNAs, se identificaron 340 ARNnc regulados a...

Discusión

Las células madre del ligamento periodontal (PDLSCs) se consideran células clave que desempeñan un papel crucial en la supresión del daño periodontal tanto en la etapa de progresión como de recuperación de la periodontitis^32,33. Una cantidad considerable de evidencia ha demostrado claramente que la incubación bajo una condición inflamatoria tiene el potencial de acelerar significativamente la senescencia de los PDLSC

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
R	Fundación R para la Computación Estadística	4.0.4	Entorno básico de código abierto para computación estadística. Sirve como base para todos los análisis posteriores. Normalmente se usa con RStudio.
Limma	Comunidad Bioconductora (Desarrollador principal: Walter & Instituto Eliza Hall)	3.46.0	Paquete especializado para el análisis diferencial de expresión de microarrays y RNA-seq.
Cytoscape	Consorcio Cytoscape	3.8.2	Plataforma de código abierto para visualización de red. Requiere instalación separada; soporta plugins como ClueGO y cytoHubba a través de la App Store.
STRING	Laboratorio Europeo de Biología Molecular	12	La mayor base de datos mundial para interacciones proteína-proteína (PPI) predichas y conocidas. Accedido a través de la web o del plugin Cytoscape; proporciona puntuaciones de confianza.
ENCORI	Universidad Sun Yat-sen	3	Base de datos pública centrada en redes de ceRNA (miARN-mARN-lncRNA).