Artículo de método

Análisis de la red de ARN endógeno competidor en ratas con oclusión de la arteria cerebral media basada en la expresión de lncRNA, miRNA y mRNA

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DOI:

10.3791/68876

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7 de octubre de 2025

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1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

En este artículo

Resumen

Este estudio utilizó análisis bioinformáticos y validación experimental para investigar sistemáticamente las funciones reguladoras y los mecanismos subyacentes de los ARN largos no codificantes (lncRNA) que funcionan como ARN endógenos competitivos (ARNce) en el accidente cerebrovascular isquémico.

Resumen

Este estudio tiene como objetivo investigar las funciones reguladoras y los mecanismos subyacentes de los lncRNAs que actúan como ceRNAs en el ictus isquémico. Con base en la hipótesis del ARNce, los lncRNA, los miARN y los ARNm se identificaron como componentes de una red reguladora involucrada en el accidente cerebrovascular. Se seleccionaron lncRNA clave de la subred resultante para un análisis detallado. El análisis de enriquecimiento funcional utilizando la ontología genética y el mapeo de vías a través de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto reveló interacciones críticas dentro de la red de ARNce asociada a lncRNA. Las vías clave, incluida la señalización del calcio, la señalización de la unión gap y la interacción del receptor del ligando neuroactivo, se validaron aún más mediante el análisis de Western blot. La red de ARNc construida comprendía 334 lncRNA, miARN y ARNm, con análisis de enriquecimiento funcional que predecía sus funciones biológicas. Se seleccionaron tres lncRNAs con alto grado de centralidad para construir una subred representativa de ceRNA. El análisis de Western blot reveló que, en comparación con el grupo simulado, los niveles de expresión de proteínas clave: CaMKII, calmodulina, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 y NPY1R se regularon significativamente a la baja en el grupo modelo, mientras que la expresión de CaN se reguló significativamente al alza (P < 0,05). Estos hallazgos sugieren que los lncRNA están significativamente involucrados en la patogénesis del accidente cerebrovascular. En conclusión, los lncRNAs que actúan como ceRNAs cumplen funciones reguladoras críticas en la patogénesis del accidente cerebrovascular isquémico.

Introducción

El accidente cerebrovascular isquémico, un trastorno neurológico prevalente, conduce a daño cerebral permanente, discapacidad a largo plazo o muerte 1,2,3,4. Los microARN (miARN o miR), los ARN largos no codificantes (lncRNA) y los ARN mensajeros (ARNm) forman redes reguladoras mediadas por ARN 5,6,7,8. Estas moléculas regulan las funciones celulares a través de varios mecanismos complejos 9,10 son cada vez más reconocidos como contribuyentes a la fisiopatología del accidente cerebrovascular isquémico. Sin embargo, a pesar de su creciente asociación con la afección, las funciones precisas de estos ARN no codificantes siguen sin estar claras. Es esencial una mayor investigación de nuevos ARN no codificantes para aclarar los mecanismos moleculares subyacentes al accidente cerebrovascular isquémico.

Los LncRNA actúan como reguladores clave de la expresión génica durante el inicio y la progresión de diversas afecciones patológicas. Sirviendo como ARN endógenos competidores (ARNce), los lncRNA se unen a los miARN para ejercer efectos reguladores específicos11. Wei et al. informan que lncRNA AK038897 actúa como un ARNce al dirigirse a miR-26a-5p, modulando así la proteína quinasa 1 asociada a la muerte (DAPK1) para exacerbar la lesión por isquemia-reperfusión cerebral12. Los estudios muestran que el ARN largo no codificante SNHG1 (lncRNA SNHG1) funciona como un ARNce para regular las enfermedades cerebrovasculares mediante la modulación de la vía de señalización HIF-1α / VEGF a través de la interacción con miR-18a13. Estudios adicionales muestran que el gen 3 de ARN largo no codificante expresado maternalmente (lncRNA MEG3) modula la apoptosis neuronal a través de la cascada de señalización miR-21 / PDCD414. Si bien se han identificado numerosos lncRNA, miRNA y mRNA mediante secuenciación de alto rendimiento o análisis de microarrays, las funciones de estas moléculas en el accidente cerebrovascular siguen sin estar claras y se necesita urgentemente el establecimiento sistemático de redes reguladoras mediadas por ARN.

Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo construir una red integral de lncRNA-miRNA-mRNA basada en la hipótesis del ceRNA utilizando datos recopilados previamente, y analizar subredes de ceRNA seleccionadas a través del enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) para comprender mejor las funciones de lncRNA. Los resultados podrían revelar que varios lncRNAs funcionan como ceRNAs, regulando potencialmente miRNAs específicos y sus ARNm diana. El enriquecimiento de GO podría resaltar procesos biológicos clave, como el desarrollo celular, la transducción de señales y la regulación del ciclo celular, mientras que el enriquecimiento de vías podría revelar su participación en las vías relacionadas con el accidente cerebrovascular, las respuestas inmunes y el metabolismo. Estos hallazgos podrían resaltar los roles potenciales de los lncRNA en diversos procesos celulares y mecanismos de enfermedad.

Se ofrecen varias mejoras clave sobre los métodos de análisis de redes de ARNce existentes en la investigación del accidente cerebrovascular isquémico, como lo respaldan las comparaciones con estudios relacionados: primero, integrar la validación de múltiples capas combinando la construcción de redes con la verificación de vías funcionales; a diferencia de Li et al.15, que se centra principalmente en el perfil bioinformático de redes de ARNce relacionadas con el sistema inmunitario utilizando datos públicos de transcriptoma, construir una red de ARNc que comprende 334 lncRNA, miARN y ARNm y validar vías de señalización críticas (señalización de calcio, señalización de unión gap e interacción ligando-receptor neuroactivo) a través del análisis de Western blot, abordando la limitación de la dependencia excesiva de las predicciones in silico como se ve en Fan et al.16, que construye una red de ARNce asociada a circRNA pero carece de validación experimental de las vías posteriores, y confirma la relevancia funcional de la red predicha mediante la cuantificación de la expresión de proteínas (p. ej., CaMKII, CX36, GRIA3) tanto en el modelo como en el grupo simulado; centrarse en los lncRNAs centrales con alta importancia topológica, mejorando la especificidad de los hallazgos; a diferencia de Cheng et al.17, que construye una red de ARNc lncRNA-miRNA-ARNm con 3 lncRNA, 2 miRNA y 24 ARNm, pero no prioriza los reguladores clave, identifica 3 lncRNAs con alto grado de centralidad para construir una subred representativa, asegurando que los conocimientos mecanicistas estén anclados a los nodos más influyentes y mejorando la interpretabilidad en comparación con redes más amplias y menos enfocadas como las descritas en Li et al.18, que incluye 62 lncRNA pero carece de análisis de subredes dirigidas; proporcionar parámetros experimentales detallados para mejorar la reproducibilidad: utilizar 500 ng-1 μg de ARN total extraído de tejidos cerebrales (6 ratas por grupo: 20 modelos MCAO y 20 controles operados simuladamente) para la preparación de la biblioteca, con un número de integridad de ARN (RIN) > 8,0 para garantizar la calidad, un detalle no especificado en Wang et al.19, que valida los biomarcadores de circRNA pero omite las especificaciones de entrada de ARN; emplean ratas macho SPF SD (220 ± 30 g) con MCAO, un modelo ampliamente utilizado, pero señalan explícitamente sus limitaciones, no replica completamente la complejidad vascular o las respuestas inmunes del accidente cerebrovascular isquémico humano como se destaca en Li et al. -- y mitigan esto estratificando ratas por puntuaciones neurológicas (1-3) para estandarizar la gravedad del infarto; reconocer las limitaciones del estudio: es posible que la red de ARNc no capture las modificaciones postraduccionales, y el tamaño de la muestra para la validación de Western blot (n = 6 por grupo) podría ampliarse, con trabajos futuros para incluir cohortes más grandes y análisis proteómicos para abordar estas brechas.

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Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Experimental de la Universidad de Medicina China de Anhui (número de licencia: AHUCM-rats-2024006) y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas institucionales y los estándares de uso animal de JoVE. En este estudio se utilizaron cuarenta ratas SD macho de grado SPF (220 g ± 30 g). Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Animales de experimentación

  1. Aloja a los animales en el Centro Experimental Animal en condiciones experimentales estándar. Mantenga un ciclo de luz / oscuridad de 12 h, cambie la ropa de cama diariamente y proporcione acceso gratuito a alimentos y agua.
  2. Eutanasia a los animales al final del experimento administrando 150 mg/kg de pentobarbital sódico mediante inyección intraperitoneal para inducir un estado anestésico profundo (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Confirme la anestesia profunda por la ausencia de respuesta refleja al pellizco de la pata, controle la respiración para asegurar la pérdida completa de los signos vitales y luego proceda con la decapitación.

2. Inducción del modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) en ratas

  1. Inducir la anestesia administrando una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 40 mg/kg20 (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Evalúe la profundidad anestésica utilizando el pellizco del dedo del pie y los reflejos corneales.
    1. Controle continuamente la frecuencia respiratoria y cardíaca durante todo el procedimiento. Aplique ungüento ocular estéril a base de aceite mineral inmediatamente después de la inducción de la anestesia para proteger los ojos21.
  2. Una vez que esté completamente anestesiado, haga una incisión en la línea media del cuello y exponga cuidadosamente la arteria carótida común derecha (CCA), la arteria carótida interna (ICA) y la arteria carótida externa (ECA). Bajo visualización directa, use instrumentos microquirúrgicos apropiados (p. ej., fórceps y tijeras) para separar suavemente el tejido conectivo circundante y exponer completamente cada arteria.
    1. Después de exponer las arterias, ligar el ECA y el CCA con suturas quirúrgicas. Ate nudos quirúrgicos seguros para ocluir el flujo sanguíneo y minimizar el sangrado durante los procedimientos posteriores. Asegure la tensión adecuada para crear un campo estable para la inserción de suturas.
    2. Haga una pequeña incisión en la bifurcación del ECA y el ICA con unas tijeras oftálmicas para prepararse para la inserción de la sutura. Seleccione una sutura de nailon con un diámetro de 0,25 mm y una longitud de 18 mm desde la punta del extremo redondeado (en forma de bola). Inserte la sutura a través del sitio de la incisión en la unión ECA-ICA y avance suavemente a lo largo de la ICA a una profundidad de aproximadamente 18,5 mm ± 0,5 mm para ocluir la arteria cerebral media e inducir isquemia cerebral focal.
    3. Asegure la sutura de nailon insertada al tejido o vasos sanguíneos circundantes con suturas quirúrgicas para evitar el desplazamiento. Después de mantener MCAO durante 2 h, inducir una lesión por isquemia/reperfusión. Use pinzas quirúrgicas finas para agarrar suavemente la sutura de nailon y retírela lentamente aproximadamente 5 mm para restaurar parcialmente el flujo sanguíneo cerebral e inducir una lesión por reperfusión. En el grupo simulado, ligar solo la arteria carótida sin insertar un émbolo de hilo22.
  3. Una semana después del establecimiento exitoso del modelo MCAO, anestesiar profundamente a las ratas. Una vez que no haya respuesta al pellizco de la pata, decapita rápidamente y cosecha los cerebros. Enjuague los tejidos cerebrales con solución salina normal, luego guárdelos en un refrigerador a -80 ° C para su criopreservación23.
  4. Puntuación de la función neurológica
    1. Evaluar la función neurológica utilizando el método de puntuación de Longa para determinar el éxito del modelo MCAO24. A las 24 h después de la reperfusión, evaluar la función neurológica en cada rata y asignar una puntuación basada en los siguientes criterios: Puntuación 0: sin déficit neurológico observable; Puntuación 1: flexión de la extremidad anterior izquierda durante la suspensión de la cola, extremidad anterior no completamente extendida; Puntuación 2: flexión de la extremidad anterior izquierda durante la suspensión de la cola con una resistencia notablemente reducida en el lado afectado (izquierdo) cuando se coloca sobre una superficie plana; Puntuación 3: igual que la puntuación 2, con movimientos adicionales de giro involuntario o en círculos mientras gatea; Puntuación 4: pérdida del conocimiento o muerte en 24 h.
      NOTA: Una puntuación más alta indica un trastorno de conducta más grave y un mayor deterioro neurológico.
  5. Cálculo del volumen de infarto cerebral mediante tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)
    1. Seccionar cada cerebro de rata ex vivo a lo largo del plano coronal en cinco cortes de igual grosor. Asegúrese de que cada rebanada tenga un grosor preciso de 2,0 mm ± 0,1 mm. Sumerja completamente las secciones en una solución de tinción TTC al 2% (p/v) recién preparada.
      1. Envuelva el recipiente de tinción en papel de aluminio para proteger la solución de la luz e incube las muestras en una incubadora a temperatura constante a 37 °C ± 0,5 °C durante 30 min. Después de la tinción, observe la tinción de color rojo rosa en el tejido cerebral normal, mientras que las áreas infartadas isquémicas permanecen sin teñir (blancas) debido a la pérdida de actividad de la deshidrogenasa.
    2. Transfiera cortes de cerebro teñidos con TTC a una solución de paraformaldehído al 4% (p / v) y fíjelos a 4 ° C durante 24 h para preservar la morfología del tejido. Después de la fijación, capture imágenes digitales de los cortes utilizando un sistema de imágenes de alta resolución. Registre y archive los datos 24 h después de la fijación.
    3. Utilice el software ImageJ para cuantificar el volumen del infarto y el volumen total de tejido cerebral para cada grupo de ratas después de la tinción TTC. Calcule el porcentaje de volumen de infarto corregido utilizando la siguiente fórmula25:
      Volumen de infarto corregido (%) = {[volumen total de la lesión − (volumen del hemisferio izquierdo − volumen del hemisferio derecho)] / volumen del hemisferio derecho} × 100%.
    4. Utilice el software GraphPad Prism para visualizar y analizar estadísticamente los volúmenes de infarto corregidos a través de una prueba t no pareada. Defina la significación estadística como P < 0,05.

3. Secuenciación de ARN de alto rendimiento

  1. Seleccione tejidos cerebrales de tres ratas en cada grupo. Elimine el ARN ribosómico (ARNr) de las muestras de ARN total utilizando el kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    1. Construya bibliotecas de ADN complementario (ADNc) utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN TruSeq siguiendo el protocolo estándar. Utilice bibliotecas de ADNc purificadas para la generación y secuenciación de clústeres.
  2. Utilice los datos básicos generados anteriormente26, que proporcionaron todas las bibliotecas de secuenciación y conjuntos de datos para este estudio, sin depender de bibliotecas recién construidas. Centrar el trabajo actual en el análisis de fusión integrado de estos conjuntos de datos existentes sin generar nuevas bibliotecas de secuenciación de ARN o datos de secuenciación.
    1. Confirmar la aprobación de los comités de ética institucionales pertinentes para el estudio anterior. Realizar secuenciación de alto rendimiento para evaluar sistemáticamente el perfil de expresión de miARN en ratas con MAMC, adhiriéndose a protocolos estandarizados como se describió anteriormente27.
      NOTA: Los datos de control de calidad para la biblioteca de secuenciación de ARN se proporcionan en el Archivo complementario 1.

4. Análisis de expresión diferencial de ARN largos no codificantes, microARN y ARN mensajeros

  1. Obtenga anotaciones para genes codificadores de proteínas, miARN y lncRNA de Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), miRBasa (https://www.mirbase.org/) y NONCODE (http://www.noncode.org/), según corresponda 28,29,30. Cuantifique la expresión génica utilizando StringTie31 (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/).
    1. Ensamble las lecturas alineadas de cada muestra en transcriptomas usando el ensamblador StringTie. Utilice el módulo de combinación StringTie para integrar los ensamblajes de transcriptoma de todas las muestras, generando un conjunto unificado de transcripciones coherentes en toda la cohorte. Utilice este transcriptoma combinado para estimar la abundancia de transcripciones32.
    2. Realice la cuantificación de genes codificantes de proteínas y lncRNA aplicando la normalización de la media recortada de valores M (TMM) y calculando fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas (FPKM) para cada transcripción 33,34.
  2. Realice análisis de expresión diferencial utilizando el paquete edgeR (https://bioconductor.org/) para identificar lncRNA (DEL), miRNA (DEMis) y mRNA (DEM) expresados diferencialmente entre los grupos MCAO y de control. Convierta la matriz de recuento sin procesar filtrada en un objeto edgeR DGEList. Estimar la dispersión común y asignar el mismo valor de dispersión a cada gen o miARN.
    1. Realice una prueba exacta para comparar la expresión génica entre grupos. Recupere el cambio de log2 veces (log2FC), los recuentos logarítmicos por millón (logCPM), los valores P y los valores P ajustados a la tasa de descubrimiento falso (FDR) para cada gen expresado diferencialmente35. Defina la significación estadística como P < 0.05 con un umbral de cambio de pliegue de |log2(FC)| > 1.

5. Predicción de objetivos largos de ARN no codificante y ARN mensajero de microARN expresados diferencialmente

  1. Recupere las secuencias de DEMis y DEL de las bases de datos adecuadas. Utilice las herramientas de predicción de interacción miRNA-lncRNA miRanda36 y RNAhybrid37 para identificar posibles interacciones entre DEMis y DEL. Obtener pares de interacción miRNA-mRNA de la base de datos miRWalk 3.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38

6. Construcción de la red reguladora larga de ARN no codificante - microARN - ARN mensajero

  1. Construir la red reguladora lncRNA-miRNA-mRNA basada en la hipótesis de ceRNA39,40.
    1. Calcule el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) entre DEL y DEM. Seleccione pares de lncRNA-mRNA para un análisis más detallado si PCC > 0,99 y P < 0,01.
    2. Para cada par lncRNA-mRNA coexpresado, identifique los miRNA compartidos dirigidos a ambas transcripciones. Utilice estos miARN compartidos para construir la red de coexpresión miARN-ARNm-lncRNA.
    3. Utilice Cytoscape (https://cytoscape.org/) para construir y visualizar la red de interacción lncRNA-miRNA-mRNA41,42. Siga estos pasos:
      1. Utilice el complemento CytoNCA para calcular la centralidad de intermediación (BC), la centralidad de cercanía (CC) y la centralidad de grado (DC) para cada nodo.
      2. Seleccione genes con puntajes de centralidad que excedan los valores medianos de las tres métricas para construir la subred clave final.
      3. Utilice el complemento CytoHubba para identificar los 10 principales genes centrales en la red de interacción proteína-proteína y extraer los nodos clave identificados en el Paso 2.
      4. Calcule el grado de nodo para cada componente de la red de ARNce.

7. Análisis de enriquecimiento funcional

  1. Realice análisis de enriquecimiento de las vías GO y KEGG para investigar más a fondo la función del ARN43. Utilice el paquete clusterProfiler (https://bioconductor.org/) para visualizar los resultados del enriquecimiento44.

8. Análisis de Western blot para detectar los niveles de expresión de proteínas clave involucradas en las vías relacionadas con lncRNA - ceRNA

  1. Bajo anestesia profunda, extirpe rápidamente todo el cerebro. Después de extirpar cuidadosamente las meninges y los vasos sanguíneos, aísle el tejido cortical en el área infartada de la rata45. Use tijeras finas para cortar el tejido en trozos pequeños, asegurándose de que cada pieza pese entre 50 mg y 100 mg. Transfiera las muestras de tejido pesadas a tubos de homogeneización preenfriados.
    1. Preparar el tampón de lisis de proteínas en una proporción de volumen de PMSF a tampón de lisis RIPA de 1:100 (concentración final 1 mM de PMSF). Agregue el tampón de lisis en una proporción de 200 μL por 20 mg de tejido. Homogeneice bien las muestras con un homogeneizador de vidrio esterilizado por calor hasta que el tejido se descomponga finamente.
    2. Incubar los homogeneizados en hielo durante 30 min, agitando suavemente cada 10 min para facilitar la lisis completa. Centrifugar las muestras a 28.656,6 × g durante 15 min a 4 °C. Aspire con cuidado el sobrenadante que contiene proteína total sin alterar el gránulo.
  2. Agregue un tampón de carga de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida al 5× (SDS-PAGE) a la muestra de proteína en una proporción de 1:4 (1 volumen de tampón de 5× por 4 volúmenes de muestra de proteína). Después de la dilución, la concentración de trabajo final del búfer de carga SDS-PAGE es de 1×.
    1. Mezclar bien y calentar en un baño de agua hirviendo durante 10 min para desnaturalizar completamente las proteínas. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente. Cargue 30 μg de cada muestra en los pocillos de gel SDS-PAGE.
    2. Realice la electroforesis en dos etapas: aplique 80 V durante 30 min para resolver las proteínas a través del gel de apilamiento, luego aumente a 120 V durante 1 h para separar las proteínas en el gel de resolución.
  3. Prepare papel de filtro precortado y membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) para que coincidan con el tamaño del gel. Remoje la membrana de PVDF en metanol durante 3 minutos para activarla. Sumerja tanto la membrana de PVDF como el papel de filtro en el tampón de transferencia durante 5 min.
    1. Ensamble el sándwich de transferencia en el siguiente orden (de arriba a abajo): placa de ánodo, tres capas de papel de filtro, membrana de PVDF, gel, tres capas de papel de filtro, placa de cátodo. Asegúrese de que las capas de gel, membrana y papel de filtro estén alineadas correctamente. Elimine todas las burbujas de aire en cada paso para garantizar una transferencia uniforme.
  4. Inmediatamente después de la transferencia de proteínas, enjuague la membrana de PVDF en tampón de lavado Western durante 5 min para eliminar el tampón de transferencia residual. Bloquee la membrana a temperatura ambiente durante 2 h agitando suavemente en un tampón de bloqueo occidental que contenga leche desnatada en polvo al 5%, o use BSA al 5% si detecta proteínas fosforiladas.
  5. Después del bloqueo, incube la membrana con el anticuerpo primario (1:1000) a 4 °C durante la noche agitando suavemente. Al día siguiente, incubar la membrana con el anticuerpo secundario (1:10.000) durante 2 h a temperatura ambiente.
  6. Realice la detección quimioluminiscente en una habitación oscura para evitar interferencias de luz. Coloque el lado de la proteína de la membrana de PVDF plano en el centro de la placa de exposición en el sistema automático de imágenes.
    1. Mezcle volúmenes iguales de reactivo ECL A y reactivo ECL B en un tubo de centrífuga limpio inmediatamente antes de su uso. Aplique la solución ECL mezclada uniformemente a la superficie de la membrana para iniciar la reacción luminiscente.
    2. Después de 1-2 minutos de incubación a temperatura ambiente, elimine suavemente el exceso de líquido sin alterar la superficie de la membrana. Ajuste los parámetros de exposición en el sistema de imágenes de acuerdo con la intensidad de la luminiscencia para optimizar la captura de señales.

9. Análisis estadístico

  1. Analice los resultados de Western blot utilizando el software ImageJ para cuantificar los valores de gris de banda. Utilice GraphPad Prism para el análisis estadístico de datos experimentales. Exprese todos los datos como media ± desviación estándar (x ± DE). Evaluar las diferencias estadísticas entre los grupos mediante una prueba t no pareada.
    1. Introduzca los datos de los dos grupos de muestras independientes en la tabla de datos del software, con cada grupo correspondiente a una columna separada y las muestras independientes entre sí. Verifique la normalidad seleccionando "Pruebas de normalidad y simetría" en la función "Analizar" y aplicando la prueba de Shapiro-Wilk a ambos grupos.
    2. Si P > 0,05 para ambos grupos, considere los datos distribuidos normalmente. Sobre esta base, seleccione Prueba t no apareada en pruebas t en la función Analizar para realizar el análisis. Defina la significación estadística como P < 0,05.

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Resultados

Los resultados experimentales de verificación de la tasa de éxito de cada grupo de modelos de ratas se muestran en la Figura 1. Después del modelado, se realizó una puntuación de la función neurológica en las ratas (Figura 1A). El grupo modelo exhibió déficits neurológicos severos, y aquellos con puntajes que oscilaban entre 1 y 3 se incluyeron en experimentos posteriores. Las figuras 1B y C muestran los resultados de la tinción TTC...

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Discusión

Para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la patogénesis del accidente cerebrovascular e identificar posibles objetivos diagnósticos y terapéuticos, se realizaron análisis de RNA-Seq y RNA-Seq pequeño (sRNA-Seq) en tejidos cerebrales de ratas después de MCAO. Este estudio tiene como objetivo principal investigar las complejas redes reguladoras que involucran lncRNA, miRNA y mRNA. Se realizó un análisis exhaustivo de los conjuntos de datos RNA-Seq y sRNA-Seq de los tejidos ...

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Divulgaciones

Los autores afirman que no hay intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este manuscrito fue apoyado por el Proyecto de Financiación de Candidatos a Candidatos de Reserva de Líderes Académicos de la Provincia de Anhui (No.2022H287), el Proyecto Clave de Investigación en Salud Provincial de Anhui (Referencia: AHWJ2022a013), el Proyecto Clave de Investigación en Ciencias Naturales del Colegio Provincial de Anhui (NO.2023AH050745) y el Proyecto de Talentos Sobresalientes de Higiene y Salud Provincial de Anhui (NO. ahsjhmypygc20230074).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de tinción TTC al 2% (p/v)Beijing Kangle Clone Biotechnology Co., Ltd.20230805Tinción TTC
Solución de paraformaldehído al 4% (p/v)Tiempo de beyo.P0099Tejido cerebral fijo
40 ratas SD macho de grado SPFHagzhou Ziyuan Laboratorio de cría de animales Co., LtdSCXK [zhe] 2024-0004animal de laboratorio
5% de leche desnatada en polvoPhygene científicoPH1519WB
Sistema de electroforesis de agarosaBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYCP-44PWB
instrumento de exposición automáticaTecnología de Shanghai Peiqing Co., Ltd.JS-M6PWB
Exposímetro automáticoShanghai Peiqing Technology Co., LTDJS-M6PWB
Máquina de hielo automáticaElectrodomésticos Xueke de la ciudad de Changshu Co., LTDIMS-20WB
CalmodulinaAfinidad49B2443WB
CamKIIAfinidad14G0796WB
centrífugaHaimen Qilinbeier Fabricación de instrumentos Co., Ltd.LX 300WB
Paquete clusterProfilerBioconductorclusterProfiler_4.17Análisis de enriquecimiento
CX36ZENBION24AP24WB
CX43ZENBIOM08NO01WB
Kit de quimioluminiscencia ultrasensible ECLBiosharpBL520BWB
Horno de secado de aire termostático eléctricoShanghai Sanfa Scientific Instrument Co., LTDDHG-9070WB
Aparato de electroforesisShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)EPS300WB
aparato de electroforesisShanghai Tanon Ciencia y Tecnología Co., Ltd.EPS300WB
tanque de electroforesisShanghai Tanon Ciencia y Tecnología Co., Ltd.VE-180WB
GABRA6Afinidad46V5371WB
IgG anti-ratón de cabraZs-BIO142637WB
Cabra Anti-Conejo IgGZs-BIO139931WB
GRIA3AfinidadModelo 0C33051WB
Centrífuga refrigerada de alta velocidadAnhui Jiawen equipo de instrumentos Co., LTDJW-3021HRWB
Sistema HiSeq 2500ilumina/Secuenciación de ARN de alto rendimiento
Software ImageJInstitutos Nacionales de SaludImagenJ 1.54kTinción TTC
Agitador de calefacción magnéticoCiudad de Changzhou y fábrica de instrumentosJJ-79-1WB
MicropipetaAlemania Eppendorf/WB
Microcentrífuga de temperatura normalHaimen Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WB
NPY1RAfinidad2D38248WB
pipetaeppendorf0.5-10ulWB
PKCAfinidad17E3745WB
marcador de proteína preteñidoBiosharpBL712CWB
Membrana de PVDFMilliporeIPVH00010WB
Kit de eliminación de ARNr Ribo-ZeroIllumina, San Diego, California, Estados Unidos/Extracción de ARN
Lisado de RIPABiosharpBL504AWB
Pentobarbital sódicoBeijing Think-Far Technology Co., Ltd.MERCKanestésico
instrumento de membrana de transferenciaShanghai Tanon Ciencia y Tecnología Co., Ltd.VE-186WB
Aparato transmembranaShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)VE-186WB
β-actinaZs-BIOModelo 19AW0505WB

Referencias

  1. Marquez-Ortiz, R. A., et al. Neuroimmune support of neuronal regeneration and neuroplasticity following cerebral ischemia in juvenile mice. Brain Sci. 13 (9), 1337(2023).
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