Procedimiento sencillo y eficaz para la hemostasis en arterias de ratón

Resumen

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un método eficaz para lograr la hemostasia en las arterias del ratón.

Resumen

Durante la punción arterial o canulación en ratones, a menudo es necesaria una ligadura permanente de la arteria debido a la dificultad para lograr la hemostasia tras la extracción de la aguja. Esto conduce a una lesión isquémica permanente en la región tisular suministrada. Esta isquemia localizada induce frecuentemente complicaciones secundarias, comprometiendo los resultados experimentales en modelos animales. El método actual busca sellar el lugar de la punción tras el procedimiento manteniendo el flujo sanguíneo normal, evitando así la isquemia postoperatoria. Este método consiste en extraer un fragmento de tejido adiposo del propio animal experimental, realizar una punción arterial utilizando técnicas estándar y luego envolver el lugar de la punción con la almohadilla grasa para lograr la hemostasia manteniendo el flujo sanguíneo. En este estudio, se realizó una punción bilateral de la arteria carótida común en ratones, seguida de una hemostasia mediante una técnica de vendaje de grasa. La imagen con contraste de moteado láser (LSCI) no reveló diferencias en los cambios en el flujo sanguíneo cerebral entre los grupos simulados y operados, y no se observaron cambios significativos en las mediciones preoperatorias frente a postoperatorias del flujo sanguíneo cerebral en el grupo operado. La evaluación histológica realizada a los 7, 14 y 28 días después de la cirugía reveló que: (1) la arquitectura cerebral preservada (tinción H&E), (2) morfología neuronal intacta sin cambios degenerativos (tinción de Nissl) y (3) ausencia de alteraciones patológicas en las secciones cerebrales. Esta técnica de hemostasia arterial aprovecha la flexibilidad del tejido adiposo y los mecanismos fisiológicos de coagulación. El procedimiento implica: (1) envolver grasa autóloga alrededor del lugar de la punción, (2) asegurarla con suturas para asegurar un contacto óptimo con la adventitia arterial, y (3) permitir que la sangre que escapa permee la interfaz grasa-arteria donde sufre coagulación. Este mecanismo de triple acción logra una hemostasia fiable mientras preserva la permeabilidad arterial y previene complicaciones isquémicas postoperatorias. El método demuestra una notable simplicidad procedimental, eficacia clínica y excelente potencial traslacional.

Introducción

En modelos animales, crear lesión arterial es un enfoque experimental ampliamente utilizado para modelar diversas condiciones patológicas, incluyendo modelos de isquemia-reperfusión cerebral, modelos de aterosclerosis carotídea (CCA) o aórtica (AO), y modelos de isquemia medular.

Tomando como ejemplo el modelo de isquería-reperfusión cerebral (MCAO) en ratones, el enfoque estándar actual de modelado ^1,2,3 implica: aislar la arteria carótida externa (ECA), ligar su extremo distal, sujetar la ECA proximal con un clip arterial mientras se coloca una sutura de estay, crear un agujero de perforación entre estos puntos, insertar un filamento retrogradamente a través del CCA, asegurar el vaso y el filamento con la sutura de estay, transectar la ECA entre el lugar de la punción y la ligadura distal, liberar el clip arterial, redirigir el filamento hacia la arteria carótida interna (ICA) para ocluir la arteria cerebral media y, tras la retirada del filamento, ligar la ECA proximal.

Aunque este procedimiento logra reperfusión, solo restaura el flujo sanguíneo entre el común y el ACI, dejando el ECA permanentemente desconectado. Esta sección ECA causa daño isquémico en las regiones faciales ipsilaterales, una lesión no intencionada que no solo complica el procedimiento quirúrgico, sino que también introduce un trauma confuso en animales de experimento, comprometiendo potencialmente los resultados del estudio. Más preocupante aún, en algunos protocolos experimentales ^4,5, los investigadores realizan una punción CCA directa, se inserta una sutura para establecer el MCAO y luego se retira inmediatamente, seguida de una ligadura permanente en ambos extremos del lugar de la punción para la hemostasis. Sin embargo, este método aumenta directamente la presión vascular, elevando así la carga posterior cardíaca y potencialmente conduciendo a insuficiencia cardíaca⁶.

Utilizando el modelo de lesión endotelial CCA o AO del ratón con una dieta alta en grasas para establecer la aterosclerosis como ejemplo, la metodología^convencional 7,8,9,10 consiste en realizar una punción arterial en la ACC, aorta abdominal (AA) o arteria femoral (CFA), la inserción de un catéter con balón para inducir la denudación endotelial y lograr la hemostasis ligando permanentemente ambos extremos del sitio de la punción. Este enfoque estándar presenta varias limitaciones críticas: la ligadura obligatoria crea isquemia localizada distal al sitio de oclusión. Más perjudicial aún, la acumulación de lípidos ocurre en los sitios de ligadura. La validez del modelo de compromiso se ve alterada por la afectación de la hemodinámica local, lo que interfiere con la administración del fármaco a las lesiones objetivo y distorsiona los resultados de la evaluación farmacológica.

En el modelo de isquemia de la médula espinal murina, el procedimiento implica una punción arterial (mediante acceso a CCA, AA o CFA) seguida de la inserción de un catéter con balón para inducir isquemia en las ubicaciones^{objetivo 11}. Tras la retirada del balón, la hemostasia convencional se consigue ligando permanentemente el lugar de la punción bilateralmente.

En los tres modelos mencionados, la hemostasia postpunción se logra uniformemente mediante ligadura bilateral del sitio de la punción. Aunque eficaz para el control del sangrado, este enfoque inevitablemente induce isquemia localizada, lo que conduce a complicaciones secundarias que en última instancia comprometen la validez del modelo. Por tanto, el mantenimiento de la permeabilidad vascular durante los procedimientos hemostáticos es fundamental tanto fisiológica como experimentalmente. Por ello, este artículo presenta un método innovador, sencillo y eficaz de hemostasia arterial para experimentos con ratones. El procedimiento consiste primero en pinzar ambos extremos del lugar de la punción con clips vasculares arteriales, y luego envolver la arteria con una almohadilla grasa de 3 mm × 3 mm × 1 mm para cubrir la punción. La almohadilla grasa se asegura en su lugar con una sutura de ligadura alrededor de la arteria. Los clips arteriales se liberan gradualmente y la tensión de la ligadura se ajusta según el sangrado hasta alcanzar la hemostasia completa. Este enfoque restaura el flujo sanguíneo, mantiene la hemodinámica normal y previene el daño isquémico en los tejidos circundantes causado por la ligadura permanente de los vasos. Es especialmente ventajosa para la observación a largo plazo de enfermedades muriñas y para evaluar intervenciones farmacológicas, aumentando así significativamente el rigor experimental de los estudios preclínicos.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Número de Aprobación del Protocolo SNLL25040501; Licencia de uso de animales nº SYXK(Liao) 2021 - 0010) establecido por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Agrícola de Shenyang. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación experimental

1. Detalles y documentación animal: Documentar todos los datos de investigación animal siguiendo las directrices de ARRIVE (Investigación con animales: informes de experimentos in vivo). Utiliza ratones Balb/C machos de 6 a 8 semanas, que pesan 22 g ± 4 g. Mantener las condiciones de vivienda en 24 ± 2 °C con 55% ± 5% de humedad relativa bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas.
2. Preparación animal
   1. Anestesiar a los ratones usando un vaporizador de isoflurano (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados). Induce anestesia con un 4% de isoflurano y luego mantén con un 2% de isoflurano.
   2. Tras la anestesia, se depilan las regiones cervical y craneal y se desinfecta la piel expuesta con povidona-yodo, seguido de un 75% de etanol para eliminar los residuos.
   3. Coloca los ratones sobre una almohadilla térmica de 37 °C para todos los procedimientos experimentales posteriores.
3. Medición del flujo sanguíneo cerebral basal en ratones
   1. Coloca a los ratones en postura tendida. Haz una incisión en la línea media del cuero cabelludo para exponer los huesos parietales. Disecciona cuidadosamente y elimina la capa fascial superior de la superficie del cráneo.
   2. Ajustar el sistema LSCI para escanear el hueso parietal expuesto del ratón con una ampliación 10 veces y registrar los datos basales del flujo sanguíneo cerebral.
4. Extraer la almohadilla grasa y realizar la punción arterial
   1. Recoloca a los ratones en posición supina. Haz una incisión cervical en la línea media. Extraer un injerto de tejido adiposo subcutáneo de 3 mm × 3 mm × 1 mm para su uso posterior.
   2. Realizar una disección roma de la glándula submandibular, el músculo esternohioideo y el músculo esternocleidomastoideo. Expone ambos CCA.
   3. Liberar al CCA para exponer el ICA y el ECA.
   4. Aplica la pinza vascular 1 en el extremo distal de la CCA y coloca la pinza vascular 2 en el extremo proximal.
   5. Pincha el CCA entre las dos pinzas con una aguja de 23 G.
5. Aplicación de la almohadilla grasa
   1. Tras la extracción de la aguja, envuelva el CCA en el lugar de la perforación con la superficie cortada (lado no serosa) de la almohadilla grasa.
   2. Coloca una sutura 4-0 debajo de la zona envuelto en grasa; luego ata un solo movimiento suavemente sobre la superficie grasa para aplicar presión y asegurar un contacto seguro entre la almohadilla grasa y la pared del recipiente; Finalmente, ajusta la ligadura gradualmente para lograr un equilibrio de presión en la hemostasia.
   3. Eleva el CCA distal con un hisopo de algodón húmedo. Libera la pinza vascular 1 y retira lentamente el hisopo para permitir un flujo sanguíneo gradual hacia el lugar de la punción.
   4. Revisa el flujo sanguíneo; si se observó sangrado activo, se retira el CCA distal con pinza vascular 1.
   5. Esperar 1 minuto, luego soltar lentamente la pinza vascular 1; Si se produce sangrado, reposicionar la almohadilla grasa o apretar ligeramente el único paso de la ligadura para aumentar la presión; Continúa estos ajustes hasta que se alcance la hemostasia completa.
   6. Eleva el CCA proximal con un hisopo de algodón humedecido. Liberar la pinza vascular 2 y retirar gradualmente el hisopo para permitir un flujo sanguíneo controlado hacia el lugar de la punción.
   7. Si se produce sangrado, recuperar el CCA distal con una pinza vascular 2.
   8. Aprieta ligeramente el paso único de la sutura para aumentar la presión; esperar 1 minuto, luego elevar el CCA proximal y soltar la pinza vascular 2; Enrollando lentamente el hisopo de algodón húmedo hacia el lugar de la punción.
   9. Si el sangrado persiste, repite los dos pasos anteriores hasta alcanzar la hemostasia completa.
   10. Coloca un lanzamiento adicional con la sutura para formar un doble nudo sobre el inicial, asegurando mejor la almohadilla grasa a la pared del vaso y logrando la hemostasia mediante presiones intravasculares y externas equilibradas.
   11. Confirmar que las arterias carótidas comunes a ambos lados de la almohadilla de grasa estaban llenas y que presentan un diámetro constante del vaso; Considera esto como una restauración exitosa del flujo sanguíneo y hemostasia.
   12. Repita el mismo procedimiento para realizar la hemostasia por punción en la arteria carótida común contralateral.
   13. Exponer las arterias carótidas comunes bilaterales en ratones simulados sin realizar punción arterial ni vendaje de almohadillas grasas, manteniendo todos los demás procedimientos idénticos al grupo operado.
   14. Sutura la incisión quirúrgica cervical y aplica un antiséptico.
6. Realización de la evaluación postoperatoria del flujo sanguíneo cerebral
   1. Tras completar la hemostasis bilateral por punción CCA en ratones, ajustar el sistema LSCI para escanear el hueso parietal expuesto y adquirir imágenes ampliadas 10x; Luego anota los cambios en el flujo sanguíneo cerebral.
   2. Sutura la incisión del cuero cabelludo y aplica antiséptico, deja que los ratones se recuperen con una almohadilla térmica a 37 °C antes de devolverlos a la jaula para su cuidado continuo.
7. Realización de monitorización postoperatoria y recogida de tejidos
   1. Monitorizar y registrar diariamente el estado de supervivencia, la actividad motora y cualquier signo de sangrado en la región cervicomandibular de los ratones durante el periodo postoperatorio.
   2. En los días postoperatorios, 7, 14 y 28, se sacrifica a los ratones con dióxido de carbono (siguiendo los protocolos aprobados por la institución) y se coloca los tejidos cerebrales con un 4% de paraformaldehído.

2. Examen patológico

1. Tras una fijación de 24 horas, deshidrata los tejidos cerebrales mediante un gradiente de etanol, limpia con xileno e insugirítelo en parafina para la sección.
2. Realizar tinciones H&E en secciones del hipocampo y examinar la morfología del tejido cerebral al microscopio.
3. Realizar tinción de Nissl en secciones del hipocampo y examinar la arquitectura neuronal bajo un microscopio.

Resultados

El análisis de los datos de contraste con láser preoperatorio y postoperatorio y de mediciones de perfusión relativa tanto en el grupo simulado como en el operado no revelaron cambios significativos, demostrando que esta técnica de hemostasia arterial selló con éxito el sitio común de punción de la arteria carótida sin comprometer el flujo sanguíneo cerebral (Figura 1).

Los ratones del grupo operado fueron monitorizados de forma c...

Discusión

En los modelos MCAO, preservar la ECA recapitula mejor la patología clínica al prevenir el daño isquémico facial asociado a la ligadura y transección de ECA. Aunque el enfoque convencional de inserción de filamento mediante punción CCA ofrece simplicidad técnica, requiere una ligadura bilateral del sitio de la punción, lo que resulta en una perfusión cerebral que depende de la circulación colateral del Círculo de Willis, una representación subóptima de la verdadera fisiopatologí...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4-0 con aguja de coser de hilo	Suministros Médicos Jinhuan de Shanghái Pudong Jinhuan Co., Ltd
Ratón Balb/C	Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd		6-8 mujeres, hombre
Horno de calefacción y secado de la serie DHG	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd	DHG-9123A
Hematoxilina y eosina (H&; E) Kit de tinte en alta definición	Servicebio	G1076-500ML
Isoflurano	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd	R510-22
Analizador láser de speckles	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd	RFLSI ZW
Solución de tinte Nissl	Servicebio	G1036-100ML
Máquina de incrustación organizacional	Leica	HistoCore Arcadia H
Sistema de imagen por escaneo de diapositivas	Shenzhen Shengqiang Technology Co., Ltd	SQS-40R
Máquina de anestesia para animales pequeños	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd	R500
Deshidratador de tejidos	Leica	Perla HistoCore
Sistema de agua ultrapura	Termodinámica	50132370
Microtomo semiautomático ultrafino	Leica	HistoCore MULTICUT