Establecimiento y evaluación de un modelo de rata diabética con arteriosclerosis obliterante de las extremidades inferiores

Resumen

La arteriosclerosis obliterante de la extremidad inferior es una complicación común de la diabetes mellitus. Aquí presentamos un método novedoso de modelización animal que simula la progresión de la enfermedad oclusiva aterosclerótica mediante la inyección de etanol en vasos sanguíneos para alterar la estructura vascular, proporcionando así una nueva plataforma para el tratamiento de enfermedades vasculares.

Resumen

Este estudio tenía como objetivo establecer y validar un modelo novedoso en ratas de arteriosclerosis obliterante de extremidades inferiores (ASO) en ratas diabéticas. A diferencia de la ligadura tradicional de la arteria femoral, inyectamos un 95% de etanol (0,1 mL) en la arteria ilíaca externa. En postoperatorio, se evaluaron la oclusión arterial y la isquemia de la extremidad posterior en los días 1, 3, 7 y 14 mediante ecografía Doppler, imágenes termales y medición del peso muscular húmedo. Se realizó un análisis histológico de vasos sanguíneos y tejidos musculares para evaluar la tasa de éxito y estabilidad del modelo. El etanol de alta concentración (95%) induce daño vascular en las células endoteliales, lo que conduce a la oclusión de la arteria femoral. En comparación con el grupo de control, la ecografía Doppler reveló una reducción progresiva del diámetro arterial y un aumento de la velocidad del flujo en la extremidad afectada. La termografía mostró una disminución de la temperatura de las extremidades, mientras que la medición del peso muscular mostró una reducción significativa de la masa muscular ipsilateral. El análisis histopatológico confirmó la oclusión de la luz arterial, la disminución de la densidad microvascular y la exacerbación progresiva de la lesión con el tiempo. En conclusión, la inyección de etanol al 95% en la arteria ilíaca replica eficazmente las características fisiopatológicas de la oclusión arterial de la extremidad inferior, proporcionando un modelo novedoso para estudiar la arteriosclerosis obliterante en ratas diabéticas.

Introducción

La oclusión arterial de las extremidades inferiores diabéticas (DLEAO) es una de las principales causas de discapacidad y mortalidad en pacientes diabéticos, afectando gravemente la calidad de vida y suponiendo una carga socioeconómica^{considerable 1}. La patogénesis de la enfermedad arterial diabética implica interacciones complejas entre hiperglucemia, dislipidemia, inflamación crónica y disfunción^{vascular 2}. Los modelos animales han sido fundamentales para esclarecer estos mecanismos, proporcionando conocimientos clave para el desarrollo terapéutico. Los modelos animales sirven como herramientas valiosas para simular la fisiopatología de la enfermedad arterial periférica (EAP) en pacientes diabéticos humanos. Estos modelos permiten estudios reproducibles de alto rendimiento para investigar la progresión de la enfermedad y esclarecer los mecanismos subyacentes. Además, los ensayos preclínicos que utilizan modelos animales proporcionan datos esenciales para nuevas terapias, incluyendo agentes farmacológicos, terapia génica y enfoques de medicina regenerativa (por ejemplo, terapia con células madre⁾³. Esta investigación fundamental es fundamental para informar los ensayos clínicos posteriores y avanzar en la medicina traslacional.

Actualmente, el método de ligadura de la arteria femoral (FAL) se utiliza ampliamente en laboratorios para establecer modelos en ratas de isquemia de la extremidad^{posterior 4}. Este enfoque induce rápidamente manifestaciones isquémicas en las extremidades^{inferiores 5}; sin embargo, la trombosis arterial resultante difiere de la progresión fisiopatológica observada en pacientes diabéticos con enfermedad arterial de las extremidades inferiores (LEAD), que implica lesión endotelial, acumulación de factores inflamatorios y proliferación de células musculares^{lisas 2,6}. Además, el FAL desencadena una neovascularización rápida y la formación de vasos colaterales, restaurando la perfusión de bajo flujo poco después de modelar ^5,7. Esto contrasta con la progresión crónica del LEAD diabético. Por ello, es necesario desarrollar un modelo animal que replique con mayor precisión los mecanismos fisiopatológicos de la arteriosclerosis humana.

En modelos animales diabéticos, la lesión mecánica de la arteria íntima femoral mediante catéter con balón o inducción química (por ejemplo, estimulación con cloruro férrico) desencadena efectivamente cambios patológicos, incluyendo la denudación endotelial, la infiltración de células inflamatorias y la migración/proliferación de células del músculo^{liso 8}. Este enfoque replica mejor las características patológicas características de la aterosclerosis humana. En comparación con el modelo FAL tradicional, la principal ventaja del método inducido por etanol radica en su capacidad para simular con mayor precisión el complejo proceso fisiopatológico del LEAD diabético. El etanol altera directamente el endotelio vascular, activando la agregación plaquetaria y la trombosis, imitando así el evento inicial en el LEAD⁹ diabético. Más importante aún, al destruir gradualmente la microestructura vascular, el etanol evita eficazmente la rápida compensación de la circulación colateral comúnmente observada en el modelo FAL, replicando así con éxito el estado típico de hipoperfusión crónica del LEAD¹⁰ diabético. En contraste, el modelo de isquemia inducida por ligadura de la arteria femoral presenta limitaciones notables: los roedores (por ejemplo, ratones, ratas) compensan rápidamente la isquemia aguda debido a su circulación colateral bien desarrollada, lo que conduce a una severidad isquémica inconsistente y a una mala recapitulación de la isquemia crítica de la extremidad humana (CLI^)11,12. Además, la enfermedad arterial periférica humana (EAP) proviene principalmente de la progresión crónica de la aterosclerosis, mientras que el modelo de ligadura de la arteria femoral representa un evento isquémico agudo con mecanismos fisiopatológicos fundamentalmente^{distintos 13}. El objetivo principal de este estudio fue establecer y caracterizar un modelo experimental estable y a largo plazo de la arteriosclerosis obliterante de la extremidad inferior diabética (LEAOD) que imite con precisión la progresión de la enfermedad en los pacientes. La oclusión inducida por etanol es operativamente sencilla, requiriendo solo una inyección mínimamente invasiva, lo que reduce la barrera técnica y la mortalidad animal. Sus parámetros clave son fácilmente estandarizables, garantizando una alta reproducibilidad. Además, el método es rentable, elimina la necesidad de equipos especializados y es fácilmente transferible entre laboratorios. Actualmente, sigue habiendo escasez de modelos animales duraderos para validar intervenciones terapéuticas novedosas.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo bajo un protocolo aprobado por el Comité de Ética Animal del Hospital Yantai Yuhuangding. Este estudio utilizó 40 ratas Sprague-Dawley macho (peso: 250-300 g, edad: 6 semanas) alojadas bajo un ciclo claro/oscuro de 12 horas. A partir de las 7 semanas de edad, se les alimentó con una dieta alta en grasas y sacarosa¹⁴^,¹⁵ ad libitum, con acceso gratuito al agua durante 8 semanas. A las 4 semanas de dieta, la diabetes fue inducida mediante inyección de estreptozotocina (STZ)¹⁶. Tras 8 semanas, se confirmó el establecimiento exitoso del modelo diabético antes de los experimentos posteriores. Se realizó una cirugía de oclusión arterial de la extremidad posterior en ratas de 14 semanas como se describe a continuación.

1. Inducción quirúrgica de la arteriosclerosis obliterante de la extremidad posterior en ratas diabéticas

1. Preparar todos los instrumentos y materiales quirúrgicos según la lista de la Tabla de Materiales e ilustrados en la Figura 1.
2. Anestesiar a la rata usando una máquina anestesica que administra isoflurano (1,5-2,5%) y oxígeno (O₂, 1-2 L/min). Mantén una respiración espontánea durante todo el proceso. Evalúa la profundidad de la anestesia mediante el reflejo de pinzamiento del dedo para asegurar un plano quirúrgico de anestesia.
3. Coloca a la rata en posición supina sobre una plataforma de contención. Elimina el vello desde el abdomen hasta las extremidades inferiores usando crema depilatoria y una cuchilla de afeitar.
4. Asegura las extremidades. Desinfecta la piel de las extremidades posteriores con alcohol. Haz una incisión de 2-3 cm en el muslo medial derecho usando pinzas y tijeras curvadas.
   NOTA: Todos los procedimientos quirúrgicos fueron realizados por un cirujano experimentado para garantizar la consistencia y reproducibilidad de los modelos animales.
5. Bajo un microscopio, disecciona los tejidos circundantes para exponer la arteria/vena ilíaca externa y el nervio femoral. Aísla los vasos y el nervio. Rastrear la arteria ilíaca externa hasta su bifurcación en arterias femorales superficiales y profundas.
6. Pinza el segmento medio de la arteria femoral y la arteria femoral profunda con clips vasculares. Inyectar lentamente 0,1 mL de etanol al 95% en la arteria ilíaca externa distal. Después de 60 s, quitar los clips; lograr la hemostasia mediante compresión. Cierra la herida capa por capa.
   NOTA: Durante la inyección se observó un blanqueamiento inmediato de la arteria y un temblor transitorio del pie ipsilateral, confirmando la administración intravascular exitosa de etanol.
7. No inmovilices la extremidad afectada tras la operación. Administrar inyección intramuscular de penicilina sódica (400.000 UI) para prevenir infecciones.
   NOTA: En este modelo unilateral de oclusión arterial de la extremidad inferior, la extremidad contralateral actúa como control. El tiempo de oclusión se calcula a partir de las 24 horas posteriores al procedimiento.

2. Determinación de la temperatura de la extremidad inferior

1. Anestesiar a la rata y colocarla en posición supina sobre la plataforma quirúrgica.
2. Afeita ambas extremidades traseras y colócalas simétricamente.
3. Mide la temperatura de ambas extremidades posteriores usando un sistema de termografía infrarroja.

3. Diámetro arterial y velocidad del flujo sanguíneo

1. Anestesiar a la rata.
2. Prepara el sistema de ecografía y la sonda.
   1. Enciende la máquina de ultrasonidos pulsando el botón de encendido en el panel frontal.
   2. Selecciona la sonda de matriz lineal de alta frecuencia (por ejemplo, 40 MHz) y conéctala al sistema.
   3. Aplica una cantidad generosa de gel acústico de acoplamiento sobre la superficie de la sonda.
3. Localiza la arteria femoral superficial.
   1. Coloca a la rata en posición supina sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal.
   2. Afeita el pelaje de la zona medial del muslo bilateralmente, aproximadamente a 1-2 cm por encima de la articulación de la rodilla, usando una máquina de cortar eléctrica.
   3. Coloca suavemente la sonda perpendicular a la superficie de la piel sobre la zona afeitada.
   4. Ajusta la posición de la sonda en modo B para visualizar la arteria femoral como una estructura tubular anecoica pulsátil.
4. Mide el diámetro arterial.
   1. Congela la imagen en modo B pulsando el botón de congelación en la máquina o en la interfaz de software.
   2. Selecciona la herramienta Medición en el menú de pantalla.
   3. Utiliza la función de pinza para medir el diámetro interno desde la pared cercana hasta la opuesta de la arteria.
   4. Repite la medición tres veces en el mismo lugar y registra el valor medio.
5. Mide la velocidad del flujo sanguíneo.
   1. Cambia al modo Doppler de onda pulsada haciendo clic en el icono Doppler de PW .
   2. Coloca la compuerta de muestra sobre el centro del lumen de la arteria.
   3. Ajusta el ángulo Doppler a ≤ 60° usando la herramienta de corrección de ángulo.
   4. Pulse Actualizar o Capturar para registrar la forma de onda de velocidad durante al menos tres ciclos cardíacos.
   5. Utiliza la función de trazado automatizado del software para calcular la velocidad sistólica máxima (PSV) y la velocidad post-diastólica (EDV).
   6. Guarda los datos haciendo clic en Guardar y exportando los resultados a una hoja de cálculo (por ejemplo, CSV, Excel).

4. Pesaje muscular

1. Tras una anestesia profunda, eutanasiar a la rata mediante una luxación cervical.
2. Diseccionar los músculos gastrocnemios de ambas extremidades traseras, preservando los tendones de Aquiles (Figura 2).
3. Coloca inmediatamente los músculos sobre una balanza electrónica para medir el peso húmedo.
4. Utiliza los músculos contralaterales como controles.
5. Compara mediciones de cuatro puntos temporales y preséntalas en un gráfico de curvas.

5. Análisis histopatológico

1. En cada uno de los cuatro puntos temporales, eutanasia rápidamente a un grupo de ratas.
2. Extrae inmediatamente las arterias femorales superficiales bilaterales.
3. Corregir los tejidos arteriales con un 4% de paraformaldehído.
4. Incrusta los tejidos en parafina y secciona los 5 μm de grosor.
5. Realizar tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) para examinar los cambios histopatológicos.

6. Análisis estadístico

1. Expresa todos los datos como media ± desviación estándar (DS). Consideremos diferencias estadísticamente significativas en un valor p de <0,05.

Resultados

Este estudio utilizó la inyección intraarterial de etanol para establecer un modelo en ratas diabéticas SD (n = 40). El modelo se caracterizó por una tasa de éxito del 85% (33/40), basada en la confirmación ultrasónica de la reducción del diámetro arterial contralateral y la velocidad del flujo sanguíneo en los 14 días posteriores a la inyección. Se registró una tasa de mortalidad relacionada con el modelo del 8% (5/40), predominantemente durante el periodo inicial. Aunque la citotoxicidad del etanol supone un riesgo de ...

Discusión

En resumen, hemos establecido con éxito un modelo en ratas de oclusión arterial progresiva que imita de cerca las manifestaciones clínicas observadas en pacientes diabéticos. Se lograron evaluaciones consistentes de la hipoperfusión de la extremidad posterior mediante mediciones ultrasongráficas y evaluaciones de peso húmedo muscular durante periodos superiores a dos semanas. La ligadura de la arteria femoral indujo oclusión vascular superficial, permitiendo la recirculación sanguínea a ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
GraphPad versión 8.0.1			RRID:SCR_002798
Termómetro infrarrojo basado en teléfono	HIKMICRO		HM-TJP10B-3AMF
Rata Sprague-Dawley	Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.		250 g
Máquina de ultrasonidos	Vevo 2100