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Artículo de método

Integración de la farmacología de redes para investigar el efecto protector del cinnamaldehído frente a la neurotoxicidad inducida por oxaliplatina

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DOI:

10.3791/69013

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28 de noviembre de 2025

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1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

Este estudio investiga los efectos protectores del cinnamaldehído (AC) frente al daño inducido por oxaliplatino (OXA) en las células ganglionares de la raíz dorsal (DRG) de rata. El mecanismo subyacente implica la supresión de la vía de señalización JAK2/STAT3 y la activación de la vía SLC7A11-GSH-GPX4, tal como se revela mediante farmacología en redes y validación experimental.

Resumen

Este estudio investiga los efectos protectores del cinnamaldehído (AC) frente al daño inducido por oxaliplatino (OXA) en las células ganglionares de la raíz dorsal (DRG) de rata. Se analizaron las actividades farmacológicas de la AC y se identificaron sus posibles objetivos, junto con los de sus metabolitos, utilizando la Plataforma de Base de Datos y Análisis de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP), la Plataforma de Investigación Computacional en Red basada en Farmacología Integrativa de la Medicina Tradicional China (TCMIP) y las plataformas PharmMapper. El ensayo CCK-8 se utiliza para determinar las concentraciones óptimas de fármacos, mientras que los ensayos de malondialdehído (MDA) se aplican para evaluar el nivel de peroxidación lipídica. Los niveles intracelulares de Fe2+ y especies reactivas de oxígeno (ROS) se cuantificaron utilizando sondas fluorescentes. Se examinó el impacto de la CA en los niveles de expresión proteica, incluyendo p-STAT3, XCT y GPX4, en células DRG tratadas con OXA mediante inmunobloting. El análisis farmacológico de redes identificó 14 objetivos superpuestos entre la "CA-neuropática del dolor (NP)-ferroptosis". Los resultados experimentales demostraron que un tratamiento de 24 horas con 4,0 μmol/L CA produjo efectos óptimos, reduciendo significativamente los niveles de MDA, Fe2+ y ROS en células DRG (P < 0,05). Además, el tratamiento con CA reguló a la baja la expresión de JAK2, STAT3, p-STAT3, TFRC, ErbB-1 y el factor nuclear kappa B (NF-κB) (P < 0,05) mientras que regulaba al alza la expresión de XCT, GPX4 y FTH1 (P < 0,05). Estos hallazgos sugieren que la CA mitiga el daño inducido por OXA en las células DRG al inhibir la vía de señalización JAK2/STAT3 y activar el eje SLC7A11-GSH-GPX4.

Introducción

En los últimos años, se ha demostrado que la ferroptosis, como modo de muerte celular no apoptótica, está implicada en el daño tisular inducido por diversos fármacos quimioterapéuticos. El mecanismo central de la ferroptosis es la acumulación de productos de peroxidación lipídica dependientes delhierro. La investigación sobre los mecanismos de la neurotoxicidad por cisplatino revela que este fármaco induce la ferroptosis neuronal a través de múltiples vías, estando este proceso directamente vinculado al desarrollo de neurotoxicidad. Específicamente, el cisplatino inhibe la actividad de la peroxidasa de glutatión 4 (GPX4). Como una "molécula de freno" crítica en la ferroptosis, la inactivación de GPX4 impide la eliminación de hidroperóxidos lipídicos (L-OOH), causando así daños oxidativos a las membranas celularesneuronales 2. Mientras tanto, el oxaliplatino puede promover la liberación de ferroptosis en las células nerviosas y agravar la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de la reacción de Fenton, amplificando aún más la cascadade ferroptosis 3. Esta evidencia sugiere que la regulación dirigida de la neurodegeneración podría ser una estrategia potencial para aliviar la neurotoxicidad del oxaliplatino.

La oxaliplatina (OXA), un agente quimioterapéutico de tercera generación de tercera generación para el cáncer colorrectal, ofrece una eficacia antitumoral robusta pero frecuentemente se asocia con una neurotoxicidad significativa. La administración crónica suele conducir al dolor neuropático inducido por OXA (OINP), con una tasa de incidencia que alcanza el 60%4, caracterizado por alodinia mecánica, hiperalgesia térmica e hipersensibilidad alfrío5. A pesar de su prevalencia, las estrategias actuales de tratamiento para la OINP siguen siendo insuficientes, lo que disminuye sustancialmente la calidad de vida del paciente. Por lo tanto, esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes a la OINP e identificar nuevos objetivos terapéuticos siguen siendo áreas críticas de investigaciónen curso 6.

El cinnamaldehído (CA), el principal componente activo del aceite esencial de canela, es un líquido amarilloy viscoso 7,8 con diversas actividades biológicas, incluyendo efectosinsecticidas 9,antimicrobianos 10, antifúngicos11,antioxidantes 12, antidiabéticos13,anticancerígenos 14, antiinflamatorios y efectos protectoresneurovasculares15,16. La evidencia emergente sugiere que la CA podría inhibir la activación de la vía de señalizaciónJAK/STAT 17. La fórmula química de CA es C9H8O, y su estructura química se muestra en la Figura 1. Como monómero natural de la medicina tradicional china, la CA presenta una amplia gama de actividades farmacológicas. En cuanto a la neuroprotección, varios estudios han confirmado que la CA puede entrar en el sistema nervioso central a través de la barrera hematoencefálica, promover la expresión de enzimas antioxidantes (como HO-1 y NQO1) activando la vía de señalización Nrf2/AR, reducir la acumulación de ROS en las células nerviosas y, por tanto, aliviar el daño neurooxidativo en el ictus isquémico. La enfermedad de Alzheimer y otrasenfermedades 18,19. Al mismo tiempo, la CA puede inhibir la hiperactivación de la microglía, reducir la liberación de factores inflamatorios (como TNF-α, IL-1β) y disminuir la respuestaneuroinflamatoria 20. Sin embargo, no se ha informado si la AC puede aliviar la neurotoxicidad inducida por la oxaliplatina regulando la vía de la ferroptosis.

La vía de señalización JAK2/STAT3 es un importante mecanismo de transducción intracelular de señales que transmite las señales recibidas en la membrana celular al núcleo celular, y está estrechamente relacionada con procesos biológicos clave como la proliferación celular, diferenciación, apoptosis, estrés oxidativo y respuestasinflamatorias 21. Como vía estrechamente relacionada con las respuestas inflamatorias, la vía de señalización JAK3/STAT3 puede desencadenar respuestas inflamatorias en un estado activado, lo que puede provocar daño inflamatorio en los tejidos. Los estudios indican que inhibir la vía de señalización JAK3/STAT3 puede reducir la respuesta inflamatoria y el daño oxidativo en ratas con demencia vascular, mejorando así la función cognitiva de lasratas. Además, inhibir la vía de señalización JAK3/STAT3 también puede aliviar la respuesta inflamatoria en ratas epilépticas, reducir la tasa de apoptosis neuronal y mitigar la lesióncerebral 23. Aunque el ácido cafeico (AC) tiene un cierto efecto protector sobre el sistema nervioso, no está claro si su efecto de mejora está relacionado con la regulación de la vía de señalización JAK3/STAT3.

Este estudio tiene como objetivo validar si la inhibición in vitro de la señalización JAK2/STAT3 y la activación del eje LC7A11-GSH-GPX4 pueden mitigar el daño inducido por OXA en las células DRG de rata. Además, explora los posibles efectos antiferroptóticos de la AC y examina el papel de los objetivos clave identificados mediante la farmacología en redes en la modulación de la inflamación en las células DRG.

Los enfoques terapéuticos actuales para la neurotoxicidad inducida por oxaliplatino se centran principalmente en quelar iones de platino libres para mitigar el daño nervioso, como el uso de complejos de calciomagnesio, con el objetivo principal de aliviar neuropatías periféricas agudas (por ejemplo, entumecimiento y hormigueo en manos y pies)24. Sin embargo, los mecanismos exactos siguen sin estar claros. Estos tratamientos carecen de capacidad para revertir enfermedades crónicas como la degeneración axonal y el deterioro de las fibras nerviosas causadas por la oxaliplatina, y demuestran una eficacia limitada para prevenir la neurotoxicidad acumulada. En este experimento, se exploró el efecto neuroprotector de 4 μM de CA bajo tratamiento con 5 μM de OXA combinando mecanismos antiinflamatorios y antiferroptosis. Los hallazgos confirman que la activación de este mecanismo es un paso inicial crítico en la OINP. El descubrimiento de inhibidores específicos podría reemplazar los enfoques inespecíficos existentes, mejorando así tanto la precisión como la eficacia de las intervenciones terapéuticas.

El modelo in vitro utilizado en este experimento implica neuronas ganglionares dorsales (DRG) aisladas de rata para estudiar la OINP. Sin embargo, este modelo difiere significativamente de las células primarias humanas en el fondo genético, las características metabólicas y la sensibilidad a la toxicidad, lo que puede dificultar la aplicación clínica directa de las conclusiones de investigación. Además, el mantenimiento funcional de los tejidos neuronales in vivo depende de la regulación precisa de la coordinación multicelular y los microambientes dinámicos, factores complejos que resultan difíciles de replicar completamente los modelos in vitro .

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Protocolo

NOTA: La línea celular se derivó de líneas celulares de rata.

1. Análisis de farmacología de redes

NOTA: Los enlaces pueden encontrarse en la Tabla de Materiales.

  1. Encontrar posibles objetivos de CA
    1. Recupera información estructural de la base de datos PubChem y explora los posibles mecanismos biológicos de la AC. Posteriormente, realiza el análisis de predicción de objetivos utilizando SwissTargetPrediction, aprovechando sus avanzadas capacidades computacionales.
    2. Para mejorar la precisión y exhaustividad del análisis, cruza los objetivos previstos con bases de datos específicas de la Medicina Tradicional China, incluyendo TCMSP y TCMIP.
    3. Revisa la literatura relevante para identificar posibles objetivos adicionales. Duplicar la lista consolidada de objetivos para crear un conjunto de datos completo, que sirva como referencia clave para futuros estudios de actividad biológica y desarrollo de fármacos relacionados con la AC.
  2. Identificación de posibles objetivos del dolor neuropático (NP)
    1. Utilizando la base de datos GeneCards y la base de datos TTD, realiza una búsqueda exhaustiva utilizando las palabras clave "dolor neuropático" y "ferroptosis". Prioriza los genes objetivos de la base de datos GeneCards con una "puntuación de Relevancia" superior a la mediana, ya que estos genes demuestran mayor pertinencia al enfoque de investigación.
    2. Integrar los objetivos génicos previamente seleccionados con los datos obtenidos de la TTD (Base de Datos de Objetivos Terapéuticos). Asegurar una identificación completa de posibles objetivos durante el proceso de integración cruzando todas las metas genéticas seleccionadas con las entradas de la base de datos TTD. Eliminar sistemáticamente las entradas duplicadas del conjunto de datos integrado de genes objetivos. Verifica que el conjunto de datos resultante contenga una lista única de posibles objetivos.
  3. Identificación de los objetivos de intersección de la "CA-NP- Ferroptosis"
    1. Determina la intersección de objetivos para CA, NP y ferroptosis usando un diagrama de Venn generado en línea.
    2. Estos objetivos de intersección fueron designados como posibles candidatos para la "vía NP-ferroptosis regulada por CA."
  4. Construcción de la red de Interacción Proteína-Proteína (IBP)
    1. Para investigar más a fondo, enviar los objetivos comunes para "CA-NP-ferroptosis", "CA-NP" y "CA-ferroptosis" a la base de datos STRING.
    2. Fija el umbral de puntuación de interacción en "máxima confianza > 0,4" y restringe el número máximo de interactores a 10 tanto para la primera como para la segunda capa de interacción. Aplicar los ajustes predeterminados para todos los demás parámetros y construir una red de 4,5 PPI para la "CA-NP-ferroptosis".
  5. Análisis de enriquecimiento GO y KEGG
    1. Sube los objetivos de intersección para "CA-NP-ferroptosis" a la plataforma DAVID con los siguientes parámetros: "seleccionar identificador: símbolo oficial del gen", "tipo de lista: genelista" y "especie: Homo sapiens." El análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) se realizó en tres categorías: Proceso Biológico (BP), Componente Celular (CC) y Función Molecular (MF).
    2. Realiza el análisis de enriquecimiento de vías KEGG y visualiza los datos resultantes usando gráficos de barras creados en la plataforma Hiplot.

2. Acoplamiento molecular

  1. Para esclarecer la interacción entre compuestos activos y sus objetivos asociados a enfermedades, obtener información estructural de sustancias activas de la base de datos PubChem como pequeñas moléculas, mientras que recuperar las estructuras 3D de proteínas objetivo del Banco de Datos de Proteínas (PDB) como modelos proteicos.
  2. Utiliza PyMOL para preprocesar las estructuras de los receptores proteicos eliminando moléculas de agua y ligandos no esenciales. Posteriormente, preparar las proteínas objetivo y sustancias activas para acoplamiento usando AutoDock Tools 1.5.7, y ejecutar acoplamiento molecular semi-flexible usando AutoDock Vina.
  3. Analiza las energías de unión y los sitios activos de unión de sustancias en las proteínas receptoras. Para la proteína JAK2, su estructura (ID PDB: 3e64) fue seleccionada de la base de datos PDB basándose en datos de cristalografía de rayos X y resolución óptima.
  4. Utiliza el software PyMOL para preparar la estructura JAK2 eliminando ligandos, eliminando moléculas de agua y añadiendo hidrógenos. Las estructuras de pequeñas moléculas de los compuestos activos se obtuvieron de PubChem.
  5. Carga tanto las estructuras de proteínas como las composiciones en AutoDock Tools 1.5.7, define las cajas de acoplamiento y realiza el acoplamiento molecular con AutoDock Vina.

3. Cultivo celular

NOTA: Los siguientes pasos se usarán repetidamente en el experimento de validación. Sigue estrictas técnicas asépticas. Esta parte del experimento utilizaba una centrífuga de rotor horizontal de baja velocidad.

  1. Desinfecta el embalaje exterior y los frascos de cultivo de células estériles compradas con un 75% de alcohol, y luego transfiere a recipientes de cultivo en un banco de trabajo súper limpio para subcultivar hasta que las células estén distribuidas sobre cinco placas de Petri de 10 cm de diámetro para asegurar un stock celular suficiente.
  2. Criopreservar las células a -80 °C para experimentos posteriores.
    1. Prepara DMEM, DMSO de grado cultivo celular, suero fetal bovino (FBS), tubos centrífugos de 15 mL, pipetas, crioviales y un baño de hielo. Mezcla 1 mL de DMSO, 1 mL de FBS y 8 mL de DMEM para lograr un volumen total de 10 mL. Enfría el DMSO sobre hielo durante 15 minutos. Primero, transfiere el medio base al tubo de la centrífuga y luego añade lentamente el DMSO preenfriado mientras se gira. Mezcla bien con una pipeta, luego añade suavemente FBS y vuelve a mezclar. Guarda la mezcla en el baño de hielo para usarla más adelante.
      NOTA: Una concentración del 20%-50% de DMSO resultó en un aumento significativo en la liberación de LDH, lo que indica que las altas concentraciones de DMSO son citotóxicas, mientras que el 10% de DMSO es relativamente seguro. Esto no afectó a nuestroexperimento 25.
    2. Toma células que crecen logarítmicamente, lávalas 3 veces con PBS y luego añade tripsina al 0,25% en 400 μL/10 cm de plato.
      NOTA: Una vez que ocurre la retracción citoplasmática, las conexiones se aflojas o si hay signos de flotación a gran escala, el proceso digestivo se detiene inmediatamente.
    3. Preparación previa a la digestión: Precalentar los reactivos clave (solución de tripsina-EDTA al 0,25% y medio completo DRG) a 37 °C. Retira el matraz de cultivo celular de la incubadora y descarta el medio antiguo usando una pipeta estéril para evitar que el medio residual afecte la eficiencia digestiva. Enjuaga suavemente las células cultivadas de una sola capa dos veces con 5 mL de PBS estéril para eliminar el suero residual evitando la elusión celular.
    4. Añade 2 mL de solución precalentada de tripsina-EDTA al 0,25% al recipiente de cultivo, asegurando que cubra completamente la capa de célula individual. Incuba a temperatura ambiente durante 1-3 minutos. Durante este periodo, observa las células bajo un microscopio invertido cada 30 segundos. Detener inmediatamente la digestión cuando la mayoría de las células empiecen a contraerse, a volverse redondas y a mostrar espacios intercelulares distintos (para evitar la sobredigestión y el daño celular).
    5. Añade rápidamente 4 mL de medio completamente precalentado al recipiente de cultivo. Pipetee suavemente la mezcla 5 veces con una pipeta estéril para dispersar el grupo celular en una suspensión de célula única. Transfiere toda la suspensión de celda única a tubos centrífugos estériles de 15 mL y recoge el pellet de celda mediante centrifugación a 300 x g 5 min utilizando una centrífuga de rotor horizontal de baja velocidad a 25 °C.
    6. Descarta el sobrenadante y añade 5 mL del medio de criopreservación preparado. Sopla suavemente con una pipeta para mezclar las células de forma uniforme. Repartíralos de forma uniforme en 5 viales.
    7. Etiqueta el criovial con el nombre de la celda, la fecha de congelación y el operador; Colócalo en un recipiente congelante y guárdalo en un congelador a -80 °C, luego transfiere a nitrógeno líquido tras almacenarlo durante la noche.
  3. Reanimación celular
    1. Ponte guantes, saca el vial del recipiente de nitrógeno líquido y sumérgelo inmediatamente en agua tibia a 37 °C agitándolo de vez en cuando para asegurar un descongelamiento rápido (en menos de 1 minuto).
    2. Retirar el frasco del baño maria a 37 °C, abrir la tapa, aspirar la suspensión de la celda con una pipeta, transferirla a un tubo de centrífuga, añadir 10 veces el volumen del medio de cultivo, mezclar bien y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos (25 °C).
    3. Descarta el sobrenadante, añade 5 mL de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal al 10% (el medio completo para esta condición de cultivo celular), inocúla el plato de cultivo e incuba estáticamente en una incubadora de 37 °C, 95% de humedad y 5% deCO-2 .
    4. Sustituye el medio de cultivo al día siguiente (para eliminar DMSO residual y células muertas) y continúa observando el cultivo para detectar las condiciones de crecimiento. Si la densidad celular es alta, realiza la subcultura rápidamente para experimentos posteriores.
  4. Recuento de células
    NOTA: Esta parte del experimento utilizó una centrífuga de rotor horizontal de baja velocidad.
    1. Prepara alcohol al 75% de antemano para limpiar la cámara de conteo y tapar la barbilla, y luego sécalos para usarlos después.
    2. Resuspende las células digeridas y centrifugadas en 1 mL de medio, y diluye 50 μL de la suspensión celular con 150 μL de medio en un tubo EP de 1,5 mL para realizar una dilución de cuatro veces.
    3. Oscila de forma uniforme, toma 10 μL e inyecta entre el deslizamiento de cobertura y la cámara de conteo para llenar completamente la cámara evitando burbujas. Coloca bajo el microscopio para observación y contar. Principios de conteo: No omitir ni volver a contar; Cuenta las celdas que tocan los bordes superior e izquierdo, pero excluye las que tocan los bordes inferior y derecho.
    4. Según los requisitos experimentales, calcular el volumen celular en función del recuento celular deseado para el emplatado o la siembra de platos y los resultados del conteo, y luego complementar el volumen total del medio con medio completo.

4. Protocolo de ensayo de viabilidad celular

NOTA: La duloxetina fue seleccionada como agente de control de la medicina occidental porque es un fármaco ampliamente utilizado y clínicamente validado para el tratamiento del dolor neuropático periférico. Su eficacia establecida en esta indicación (respaldada por guías de práctica clínica y ensayos controlados aleatorizados) garantiza que el grupo de control pueda proporcionar una referencia fiable para evaluar la efectividad relativa de la intervención de prueba.

  1. Primero, descarta el medio de cultivo antiguo del vaso de cultivo y enjuaga la superficie celular con 5 mL de PBS para eliminar el suero residual. Luego, añade 2 mL de solución de tripsina-EDTA al 0,25% e incuba a temperatura ambiente durante 1-3 minutos. Cuando la observación microscópica revela contracción celular, redondeo y desprendimiento, se añade inmediatamente 4 mL de Medio Completo DRG para terminar la digestión y resuspender las células mediante pipeteo.
  2. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga y recoge el pellet de la celda centrifugando a 300 x g durante 5 minutos usando una centrifugadora de rotor horizontal de baja velocidad a 25 °C. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet de celda en un tubo centrífugo de 15 mL, luego resuspende completamente y mezcla la suspensión.
  3. Toma un tubo EP de 1,5 mL y primero añade 150 μL de medio de cultivo, seguido de 50 μL de suspensión celular. Mezcla bien para conseguir una dilución de cuatro veces.
  4. Luego usa alcohol al 75% para limpiar la cámara de conteo y tapar el cristal, sécarlos y agitar el tubo EP de forma uniforme otra vez.
  5. Retira 10 μL de suspensión de celda e inyecta entre el vidrio de la tapa y la cámara de conteo, asegurando que el líquido llene la cámara sin generar burbujas.
  6. Observa bajo el microscopio y cuenta el número de células según el principio de conteo, evitando omisiones o duplicados.
    NOTA: Si el número contado de celdas es n, entonces la concentración de celda en el tubo centrífuga es n/mL.
  7. Según los requisitos experimentales, se siembran las células en una placa de 96 pozos con una densidad de 2.000 células por pozo según sea necesario.
  8. Primero, inyectar 200 μL de PBS en cada pozo del círculo periférico de una placa de 96 pozos, y luego añadir un medio de cultivo que contiene células según el agrupamiento.
  9. Tras incubar en una incubadora de 37 °C, 95% de humedad y 5% deCO 2 durante 24 horas, aspirar el medio viejo y lavar dos veces con 200 μL de PBS. Según la configuración experimental, se diluye la CA paso a paso (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) y se añaden 200 μL a una placa de 96 pozos.
  10. Pretrata las células con OXA (5 μM) durante 24 horas, luego trata las células DRG con diferentes concentraciones de CA (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) durante 24 horas, respectivamente.
    NOTA: Esta sección del experimento tiene como objetivo determinar la concentración óptima de fármacos para la AC.
  11. Lava la placa de 96 pozos tres veces con buffer PBS y luego añade 200 μL de solución de trabajo CCK-8 recién preparada a cada pozo. Este paso se realiza en la oscuridad y el tiempo del experimento se controla para completarse en 10 minutos. Incubar la solución durante 4 horas en una incubadora a 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2 . Por último, mide los valores de absorbancia usando un lector de microplacas. Repite todos los experimentos al menos tres veces bajo condiciones idénticas.

5. MDA

  1. Siembra 10 ×10 6 células DRG en un plato de 15 cm y cultiva durante la noche en una incubadora a 37 °C, 95% de humedad y 5% deCO-2 . Retira el medio de cultivo, añade fármacos e incuba durante 24 horas en una incubadora de 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2 .
  2. Retira el medio de cultivo y lávao una vez con 5 mL de PBS. Tras la digestión, se recogen las células en un tubo cónico utilizando un medio DMEM.
  3. Añadir las células DRG tratadas a microtubos de 5 mL, respectivamente. Centrifuga a 300 x g durante 5 minutos con una centrifugadora de rotor horizontal de baja velocidad y retira el sobrenadante. Luego, añade 1 mL de PBS, mezcla pipeteando y transfiere a un nuevo microtubo de 1,5 mL. Centrifuga a 300 x g durante 5 minutos con una centrifugadora de rotor horizontal de baja velocidad y retira el sobrenadante.
  4. Añade 100 μL de solución antioxidante PBS, pipetea para mezclar y prepara la suspensión celular. Prepara la solución estándar MDA.
    NOTA: Véase la preparación de la solución estándar de MDA usando el método de fluorescencia; consulte la sección "Componentes del kit" para procedimientos detallados.
  5. Añade 100 μL de Buffer de Lisis al tubo de muestra y al tubo estándar, respectivamente, y mezcla a fondo usando un oscilador de vórtice. Déjalo reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  6. Añade 250 μL de la solución de trabajo preparada a cada tubo y mezcla bien usando un mezclador de vórtice. Calienta el baño maría a 95 °C en un ambiente con luz natural durante 15 minutos y luego mételo en el baño de hielo durante 5 minutos para que se enfríe. Centrífuga de rotor angular de alta velocidad a 10.000 x g durante 10 minutos (4 °C).
  7. Toma 100 μL de sobrenadante y añádelo a una placa negra de 96 pozos. Mide la intensidad de la fluorescencia usando un lector de microplacas de fluorescencia (Ej: 540 nm, Em: 590 nm). Calcula la concentración de MDA en la muestra basándose en la curva estándar.

6. Contenido de Fe2+ en celdas medido mediante unkit de detección de Fe2+

  1. Precalienta el baño maria con antelación y sube la temperatura a 37 °C. Ponte guantes, saca las células DRG del nitrógeno líquido, envuélvelas en una capa de bolsa de plástico y luego sumergidas en agua tibia a 37 °C mientras agitas suavemente de forma intermitente para asegurar el descongelamiento completo en 1 minuto.
  2. Tras descongelar, retira el vial del baño maria de 37 °C, abre la tapa, aspira la suspensión de la celda, transfiere a un tubo centrífugo de 15 mL y añade 10 mL de medio de cultivo gota a gota, mezclando bien. Centrifugadora horizontal de rotor a baja velocidad a 300 x g durante 5 minutos (25 °C).
  3. Tras la centrifugación, descarta el sobrenadante, añade 10 mL de medio fresco de cultivo, pipetea para mezclar bien y centrifuga de nuevo. Repite este procedimiento 3 veces antes de vacunar en nuevos platos de cultivo.
  4. Cultivar las células de forma estática en una incubadora de 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2 . Reemplaza el medio al día siguiente para eliminar el DMSO residual y las células muertas, y luego continúa el cultivo. Si la densidad celular es alta, subcultiva a tiempo. Posteriormente, se recogen las células en fase de crecimiento logarítmico, se digieren, se centrifugan y se vuelven a suspender. Siembra las células resuspendidas en placas de 12 pozos con una densidad del 70%-80%, y luego coloca las placas de nuevo en la incubadora de 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2 para su posterior cultivo.
  5. Observar el estado celular al día siguiente, proporcionar tratamientos correspondientes según el montaje experimental y luego volver a colocarlos en la incubadora de 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2 para continuar el cultivo.
  6. Tras 24 horas de administración del medicamento, descarta el medio de cultivo original y lava las células una vez con PBS. Añadir 300 μL/pozo de sonda FerroOrange (1 μM) diluida en HBSS, e incubar a 37 °C, 95% de humedad y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos.
  7. Luego añade la solución de tinción de células vivas Hoechst 33342 (100x) a la placa celular en una proporción de 1:100, incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5 minutos para teñir los núcleos celulares.
  8. Observa el efecto de tinción bajo un microscopio de fluorescencia y toma fotografías para documentación. Posteriormente, se utiliza ImageJ para calcular la intensidad media de fluorescencia, repitiendo el experimento tres veces para análisis estadístico.

7. Kit de detección ROS

  1. Toma las células en fase de crecimiento logarítmico, las digire, centrifugarlas y resuspenderlas, luego siembras las células en una placa de 12 pozos a una densidad (70%-80%). Tras mezclar bien las células, colócalas en la incubadora de 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2 para continuar su cultivo.
    NOTA: Para los pasos de digestión, centrifugación y resuspensión, consulte el paso 4.1.
  2. Observar el estado celular al día siguiente, administrar los tratamientos correspondientes según el montaje experimental y luego colocar las células de nuevo en la incubadora de 37 °C, 95% de humedad y 5% deCO-2 para continuar el cultivo. Tras 24 horas de administración del medicamento, descarte el medio de cultivo original y lave las células dos veces con HBSS.
  3. Añade 200 μL de solución de trabajo con tinte DCFH-DA de alta sensibilidad, luego incuba a 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2 durante 30 minutos.
  4. Descarta el sobrenadante, lávate dos veces con HBSS y teñe con 2 μL de solución de tinción de células vivas Hoechst 33342 (100 veces) durante 5 minutos, luego examina bajo un microscopio de fluorescencia. Repite el experimento tres veces con análisis estadístico.

8. Morfología mitocondrial de las células observadas usando TEM

  1. Desechar el medio de cultivo de las células bien cultivadas, añadir 1 mL de solución fijadora de glutaraldehído al 2,5% a temperatura ambiente y fijar las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos. Raspa suavemente las celdas en una dirección usando un raspador de celdas.
  2. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga y centrífuga a 25 °C, 600 x g durante 3 minutos usando una centrifugadora de rotor horizontal de baja velocidad.
  3. Después de descartar el sobrenadante de la solución fijadora, añade un nuevo fijador de microscopía electrónica (utilice 1 mL por pozo para una placa de 12 pozos), fijen a temperatura ambiente alejados de la luz durante 30 minutos, luego transfieran a 4 °C para su almacenamiento.
  4. Infiltración por deshidratación: Inserta la muestra en la placa de incrustación y colócala en un horno a 37 °C durante la noche.
  5. Polimeriza el medio de incrustación en un horno a 60 °C durante 48 segundos. Corta secciones ultrafinas de 60-80 nm usando un ultramicrotomo.
  6. Tiñe las secciones con una solución alcohólica saturada de acetato de uranilo al 2% durante 15 minutos, luego con citrato de plomo durante otros 15 minutos. Seca las zonas teñidas durante la noche a temperatura ambiente. Observa y fotografía las secciones bajo un microscopio electrónico de transmisión.

9. Western blot

  1. Extrae la proteína total de las células
    1. Trata e inocúla las células en una placa de Petri de 6 cm hasta que alcancen el 70% de densidad.
      NOTA: Consulte el paso 3.3 para las instrucciones sobre la reactivación celular y la inoculación.
    2. En el plato de cultivo, añade 3 mL de OA (5 μM) y tras 4 horas, añade CA (4 μM).
    3. Prepara una caja de hielo, PBS pre-enfriado, raspadores de celdas, tampón de lisis preparado y varios tubos EP etiquetados con antelación.
    4. Tras el tratamiento farmacológico, retira el medio de cultivo de las células y lávalas dos veces con PBS preenfriado. Realiza este proceso sobre hielo y aspira cualquier PBS residual usando una centrífuga de vacío.
    5. Etiqueta cada placa de Petri, luego añade 300 μL de tampón de lisis y déjalo reposar sobre hielo durante 5 minutos con agitación constante para evitar la lisis incompleta y la congelación.
    6. Luego se utiliza un raspador de celdas preenfriadas para desprender las celdas adherentes, recogiendo 300 μL en un tubo EP tras cada raspado. Usa un rascador de celda nuevo para cada raspado y no lo reutilices.
    7. Sujeta la parte superior del tubo EP y mezcla bien en un batidor vórtice, luego sigue colocando sobre hielo durante 25 minutos. En este momento, encienda la centrífuga de rotor angular de alta velocidad a 4 °C con antelación, ya que el enfriamiento previo requiere un tiempo determinado.
    8. Tras el final del temporizador, vuelve a poner el vórtice y luego centrifugar el rotor angular de alta velocidad a 4500 x g durante 15 minutos en una centrífuga de 4 °C.
    9. Ahora enciende el calentador del baño seco y pon la temperatura a 100 °C.
    10. Saca el kit de cuantificación de proteínas BCA, añade muestras y reactivos a la placa de 96 pozos, mezcla bien y reacciona en una incubadora de 37 °C, 95% de humedad y 5% deCO-2 durante 30 minutos. Mide el contenido proteico extraído usando un lector de microplacas multifuncional, luego ajusta con el tampón de lisis restante según los resultados para asegurar que la concentración de cada muestra sea consistente.
    11. Finalmente, en función del contenido de cada sobrenadante, se añade 1/5 de volumen de 6× Loading Buffer para preparar el sistema de carga de proteínas. Aspira cuidadosamente 150 μL de sobrenadante en un nuevo tubo EP. Añade 30 μL de buffer de carga de 6× al sobrenadante y mezcla bien (normalmente en una proporción 1:5). Guarda la mezcla en hielo.
    12. Luego calienta a 100 °C en un calentador durante 6 minutos, asegurándote de mantener bien presionada la tapa del tubo EP para evitar que se abra. Después de calentar, enfríalo en un baño de hielo.
  2. Prepara un gel de proteína con concentración del 10%.
    1. Enjuaga la placa de gel con agua pura, sécala al aire, limpia el exceso de humedad y evita manchas de agua y polvo tanto como sea posible.
    2. Saca el soporte de fundición en gel, con las placas cortas de las dos placas de cristal delante y las placas largas detrás, alineando la parte inferior para asegurar que el hueco entre las placas de vidrio encaje bien con la tira de sellado en la parte inferior del soporte para evitar fugas, y luego sujeta las placas con una pinza firme para prepararlas para el colado en gel.
    3. Preparar el gel inferior con 6 mL de agua pura, 3,75 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,15 mL de SDS al 10%, 5 mL de Acry/bis al 30%, 75 μL de APS al 10% y 7,5 μL de TEMED.
    4. Haz girar suavemente para evitar espuma, luego añade rápida y uniformemente entre las dos placas de cristal, dejando espacio para el gel superior. Después, aplana la superficie del líquido con 1 mL de isopropanol y déjala reposar aproximadamente 30 minutos.
    5. Enjuaga el peine para la preparación en gel con agua pura, seca al aire y reserva un poco. Una vez que el gel inferior se haya solidificado completamente, vierte el isopropanol, enjuaga cuidadosamente 2-3 veces con agua pura, absorbe el líquido y invierte la placa de gel para drenar el líquido restante.
    6. Prepara el gel de apilamiento superior con 6 mL de agua pura, 2,5 mL de 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 mL de SDS al 10%, 1,34 mL de Acry/bis al 30%, 50 μL de APS al 10% y 10 μL de TEMED.
    7. Rellena la capa superior e inserta cuidadosamente un peine de 15 pozos y 1,5 mm de grosor. Después de 1-2 minutos, repone los huecos, teniendo cuidado de minimizar la formación de burbujas durante este proceso. Usa un gel completamente polimerizado.
  3. Electroforesis en gel de proteínas
    1. Preconfigura el Buffer de Funcionamiento y el Buffer de Transferencia, con el Transfer Buffer preenfriado en un frigorífico de 4 °C.
    2. Enjuaga el gel de proteína con agua ultrapura, saca un tanque limpio de electroforesis, sujeta las dos placas cortas del gel proteico hacia dentro y opuesta, vierte el Running Buffer y comprueba si hay fugas.
    3. Retirar cuidadosamente el peine, cargar 10 μL por pozo con un total de 4 grupos de muestra. Carga 3 grupos de muestra por gel, separados por un marcador proteico de 4 μL entre cada grupo, sumando un total de 15 pozos.
    4. Después de cargar las muestras, vierte todo el Running Buffer restante en el tanque de electroforesis, cúbrelo con la tapa, ajusta el voltaje a 140 V y realiza electroforesis de voltaje constante durante 20 minutos.
    5. Cuando las bandas proteicas entran en el gel de separación tras la concentración, ajusta el voltaje a 120 V para electroforesis de voltaje constante. Durante este proceso, remojó la membrana NC en un Transfer Buffer. Detener la electroforesis cuando el azul de bromofenol indique que la muestra ha llegado al borde inferior del gel, y prepárate para la transferencia de membrana.
    6. Llena una caja de espuma hasta la mitad con hielo, saca la abrazadera de transferencia, el buffer de transferencia preenfriado y la membrana NC empapada. Vierte la mitad del Transfer Buffer en un recipiente plano y cuadrado.
    7. Saca el gel de proteínas, enjuágalo bien con agua ultrapura, coloca el lado negro hacia abajo y el lado transparente hacia arriba. En el centro, coloca una capa de esponja, otra capa de papel de filtro, el gel de proteínas, la membrana NC, y luego coloca otra capa de papel de filtro y esponja.
    8. Después de presionar para eliminar las burbujas de aire, sujeta el casete de transferencia y colócalo en el tanque de transferencia. Una vez que ambos geles proteicos estén completamente insertados, vierte todo el Transfer Buffer en el tanque de transferencia, luego añade dos bolsas de hielo para enfriar y cúbrelas con la tapa.
    9. Rodea el casete de transferencia con hielo y transfiere a un voltaje constante de 120 V durante 90 minutos. El proceso de transferencia genera un calor significativo, por lo que se requiere un baño de hielo para la refrigeración.
    10. Retira la membrana NC, sumérgela y tiñela con 20 mL de solución de tinción Ponceau S, marca el tamaño del marcador con un lápiz y corta la membrana con un lápiz según el tamaño de la proteína objetivo a detectar.
    11. Recupera la solución de tinción Ponceau S. Lava la solución de tinción con PBS e incuba la membrana NC con 20 mL de tampón bloqueante, luego bloquea a temperatura ambiente con un agitador a baja velocidad durante 1-2 horas.
    12. Descarta la solución bloqueante, enjuaga rápidamente la membrana dos veces con PBS en un agitador decolorante para eliminar completamente la solución bloqueante, luego añade los anticuerpos correspondientes según las proporciones de uso de Western Blot de cada anticuerpo en la caja de incubación de anticuerpos, e incuba durante la noche a 4 °C.
    13. Por separado, recupera los anticuerpos primarios y almacena a -20 °C. Las membranas se lavaron rápidamente 4 veces con TBST en un agitador decolorante, 5 minutos cada vez, para eliminar completamente los anticuerpos primarios. Luego, añade 4 mL del buffer bloqueante con anticuerpos secundarios e incuba las membranas a temperatura ambiente en un agitador lento durante 1 hora.
    14. Lava el anticuerpo secundario cuatro veces con tampón TBST durante 5 minutos cada una, luego reempóltalo con tampón PBS para humedecer completamente la membrana NC.
    15. Según el manual de instrucciones del reactivo de quimioluminiscencia ECL, preparar la solución luminiscente y dejarla caer sobre la superficie de la membrana, luego incubarla durante 1-2 minutos antes de revelar con un sistema de imagen en gel.
    16. Procesa los datos en bruto en el sistema de imagen Image J y luego transfiere al software Photoshop para la creación de figuras.

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Resultados

Farmacología de redes y acoplamiento molecular
Identificación de posibles objetivos de AC: En la investigación exhaustiva de la actividad farmacológica de CA, se seleccionaron meticulosamente 60 posibles objetivos a partir de una extensa revisión de la literatura relevante. Para ampliar aún más el alcance del análisis, se identificaron 12 objetivos potenciales adicionales asociados con CA a través de la base de datos TCMSP. Para mejorar la precisión y exhaustividad, s...

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Discusión

La ferroptosis, un modo de muerte celular recientemente identificado, se caracteriza por una acumulación excesiva de hierro intracelular y peroxidación lipídica. Morfológicamente, la ferroptosis se manifiesta como contracción mitocondrial, pérdida o reducción de estructuras de cristas y aumento de la densidad de membrana, mientras que la membrana celular y la morfología nuclear permanecenintactas 26. Mecánicamente, la ferroptosis es impulsada por la disminución de...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés financieros que revelar

Agradecimientos

Expresamos nuestro más sincero agradecimiento por las excelentes condiciones proporcionadas por el hospital y sus departamentos, que nos han permitido alcanzar estos resultados. Al mismo tiempo, también expresamos nuestro más sincero agradecimiento a los numerosos miembros del laboratorio por sus incansables esfuerzos y valiosas contribuciones a lo largo de los años. El arduo trabajo de cada participante es una parte indispensable de nuestro éxito y, en el futuro, seguiremos trabajando juntos para avanzar en el progreso en el campo de la medicina. Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82104838), Programa Spark de la Fundación de Promoción de China (XH-D001), Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Liaoning (2024JH2/102500062) y Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Liaoning (2025-MSLH-490).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  GlicinaBiofroxx1275KG001
  Tris-baseBiofrooxx1115KG001
0,5  M  Búfer Tris-HCl (pH  6,8)Biorad1610799
1 M Tris-Hcl (PH 7,5)BeyotimeST775
1.5  M  Búfer Tris-HCl (pH  8,8)Biorad1610798
APSBeyotimeST005
Fuente básica de alimentación por electroforesisBIO-RAD PowerPac Básico
Kit de cuantificación de proteínas BCABeyotimeP0012
Anticuerpo recombinante beta-actinaHuabio81115-1-RR
Incubadora de dióxido de carbonoTermodinámica150L
Kit de ensayo CCK-8ApexbioK1018
Kit de ensayo de actividad celular y citotoxicidadBeyotimeC2015M
Cinnamaldehído (CA)MacklinC805134pureza 98%
Agitador descoloranteKylin-BellTS-100
DMEM (Eagle Medium modificado de Dulbecco)BasalMediaL110KJ
DMSOSigmaD2650
Ganglio de la raíz dorsal (DRG)Biografía de FuhengFH165Número de serie: 20211227-1
Medio completo DRGBiografía de FuhengFH-DRG
Solución luminiscente ECLTermodinámica34580
ErbB-1Proteintech06-8471:2000
Fetal  Bovina   SueroMacklinFO193
Sonda de detección de iones ferrosos - FerroOrangeDojindoF374
FTH1Tecnología de señalización celular4393S1:1000
Sistema de imagen en gelBIO-RAD ChemiDoc Touch
Solución salina balanceada de Hanks (HBSS)SolarbioH1025
Centrífuga refrigerada de alta velocidadEppendorf5804R
Hoechst 33342 Solución de tinción de células vivasBeyotimeC1028
Kit de inmunohistoquímicaBiosharpBS-24-PB
Sistema de microscopio de fluorescencia invertidaLeicaLeica Dmi 8
Anticuerpo monoclonal recombinante de conejo JAK2 [SY0245]HuabioET1607-351:2000
Microscopio de contraste de fase invertido de laboratorioLeicaLeica DMI 1
Centrífuga de baja velocidadEppendorf5804
Kit de detección de contenido MDASangonD799762
Lector de microplacasAMANECER TECAN
Lector de microplacas multifuncionalBMGLABTECH PHERAstar FS
NF-κ Anticuerpo policlonal B p65Proteintech10745-1-AP1:1000
ParaformaldehídoMacklinP804536
Solución de tinción PonceauBeyotimeP0022
Marcador de proteínasTermodinámica26617
P-STAT3 (Ser727)Tecnología de señalización celular9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)Tecnología de señalización celular9145S1:2000
Anticuerpo recombinante antiglutatión peroxidasa 4[EPNCIR144]ABCAMab1250661:1000
Anticuerpo recombinante anti-XCT[EPR27115-64]ABCAMAB3076011:1000
Kit de ensayo ROSDojindoR252
Buffer de carga de proteínas SDS-PAGE (6X)BeyotimeP0289
Leche en polvo desnatadaBiosharpBS102-500g
SDS de dodecilo sulfato de sodioBiofrooxx3250GR500
STAT3 (F-2)Santa CruzSC-80191:200
TEMEDSolarbio    T8090   
TFRCInvitrogen13-68000,5 & micro; g/mL
Tween80SelleckS6702
Banco de trabajo ultralimpioHDLDL-CJ-2NDI
Microscopio verticalOlimpoCX 31
Electroforesis verticalBIO-RAD Mini tetra proteico
Tanque de transferencia húmedoBIO-RAD Mini Trans Blot
&alfa;-Tubulina&alfa;-TubulinaER130905
GraphPad PrismAnálisis estadístico
Software ImageJObtén el valor gris de la mancha proteica

Referencias

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