Este estudio se realizó según los criterios de clasificación EULAR/ACR de 2019. Este estudio fue aprobado por el Hospital Popular de Shenzhen (Número de aprobación del Comité de Ética LL-KY-2019514).
Análisis de aleatorización mendeliana (RM)
Fuentes de datos GWAS
Los datos de asociación genética para el LES y 565 metabolitos se obtuvieron de la base de datos OpenGWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/). Los conjuntos de datos GWAS de enfermedades se resumen en la Tabla 1, mientras que las fuentes y los tamaños de muestra para los datos GWAS de metabolitos se detallan en la Tabla 2. Estos conjuntos de datos proporcionaron la base para el análisis de RM para explorar las relaciones causales entre los metabolitos y el LES 13,14,15,16.
Selección de variables instrumentales
Las variantes genéticas asociadas con metabolitos sanguíneos y LES se seleccionaron como variables instrumentales (IV) para el análisis de RM. Los IV se eligieron en función de los tres supuestos centrales de la RM: relevancia, independencia y restricción de exclusión17. Específicamente, se seleccionaron polimorfismos de nucleótido único (SNP) asociados con metabolitos en un umbral de significación de todo el genoma de P < 5 × 10-8 18. Para garantizar la independencia entre los IV, se realizó la aglutinación del desequilibrio de ligamiento (LD) con un umbral de r2 < 0,001 y una distancia física de 10.000 kb utilizando la población europea como panel de referencia19. Este proceso minimizó la redundancia y aseguró que cada IV proporcionara información única para el análisis de RM.
Análisis estadísticos
El enfoque estadístico principal para el análisis de RM fue el método ponderado por varianza inversa (IVW), que combina los efectos de múltiples IV para estimar el efecto causal de los metabolitos en el LES20. Para tener en cuenta la posible pleiotropía, se realizaron análisis de sensibilidad mediante regresión de MR-Egger21. La fuerza de cada IV se evaluó mediante estadísticas F, y solo los SNP que exhibían F > 10 se conservaron para garantizar una fuerza robusta del instrumento22. Se excluyeron los SNP con estadísticas F más bajas para evitar un sesgo débil del instrumento. Los análisis finales de RM se realizaron solo cuando no se detectó heterogeneidad o pleiotropía significativa, lo que garantiza la confiabilidad de las estimaciones causales23.
Análisis de sensibilidad
Se emplearon varios análisis de sensibilidad para evaluar la solidez de los hallazgos de MR. La heterogeneidad entre los IV se evaluó mediante la prueba Q de Cochran, mientras que la pleiotropía se evaluó mediante la regresión MR-Egger24. Además, se realizó un análisis de exclusión para determinar si los resultados de MR estaban influenciados de manera desproporcionada por un solo SNP25. Se generaron diagramas de bosque para visualizar los efectos individuales y combinados de los IV. Estos análisis aseguraron colectivamente que los resultados de la RM no estuvieran sesgados por efectos pleiotrópicos o SNP atípicos.
Fuente de datos Metabolómica
Los datos metabolómicos utilizados en este estudio se derivaron de un estudio publicado previamente por nuestro grupo de investigación10. En ese estudio, realizamos análisis metabolómicos en muestras de suero de 121 pacientes con LES y 106 individuos sanos. El perfil metabolómico no dirigido se realizó mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución junto con espectrometría de masas (UHPLC-MS). Los datos se procesaron utilizando flujos de trabajo metabolómicos estándar, incluida la detección, alineación y normalización de picos, para identificar metabolitos significativamente asociados con el LES. Estos metabolitos se cruzaron con los resultados del análisis de RM para identificar metabolitos superpuestos. Se puede encontrar información más detallada en la publicación anterior10. Los metabolitos significativamente asociados en el análisis metabolómico y aquellos con asociaciones causales significativas en el análisis de RM se asignaron a sus respectivos ID de HMDB utilizando la plataforma MetaboAnalyst. Luego, los metabolitos comunes se identificaron cruzando los dos conjuntos de ID de HMDB.
Mediciones de citocinas y ensayo de apoptosis
Se inscribieron un total de 3 pacientes con LES (Tabla 3), de acuerdo con los criterios de clasificación EULAR/ACR de 2019.
Recogida de muestras de sangre periférica y aislamiento de linfocitos
Se recogieron muestras de sangre periférica (3-6 ml) de los participantes utilizando tubos de vacío que contenían heparina sódica como anticoagulante. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque (400-800 × g durante 20-30 min). Las células aisladas se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, HyClone) mediante centrifugación a baja velocidad (250 × g durante 10 min) y se resuspendieron en medio RPMI-1640 completo suplementado con suero fetal bovino al 10%. La densidad celular se ajustó a 1 × 106 células/ml, según lo verificado por un contador automático de células. La suspensión celular se sembró en placas de cultivo y se preincubó durante 2 horas a 37 ° C en una atmósfera deCO2 al 5% para promover la adherencia. Después de la preincubación, las células no adherentes en el sobrenadante de cultivo se recolectaron cuidadosamente y se sometieron a aislamiento linfocítico. La suspensión recogida se colocó suavemente sobre Ficoll-Paque y se centrifugó de nuevo a 400 × g durante 20 min sin freno. La capa de células mononucleares en la interfaz plasma-Ficoll se aspiró cuidadosamente, se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendió en medio RPMI-1640 que contenía un 10% de suero bovino fetal. La viabilidad y la concentración celular se evaluaron utilizando el contador automático de células, y los linfocitos se utilizaron posteriormente para aplicaciones posteriores.
Tratamiento y cultivo celular
Las células se dividieron en cinco grupos para el tratamiento: Grupo de control: tratado con un volumen igual de DMSO. Grupo de tratamiento del colesterol: tratado con colesterol a una concentración de 1,5 mmol/L. La concentración de 1,5 mmol/L de colesterol libre utilizada en este estudio se seleccionó para simular un microambiente rico en lípidos más allá de los niveles fisiológicos. El colesterol libre circulante en individuos sanos generalmente oscila entre 0.9 y 1.3 mmol / L. La concentración ligeramente elevada utilizada en estos experimentos tenía la intención de imitar la acumulación patológica de lípidos que puede ocurrir en tejidos inflamados o metabólicamente alterados en el LES. Grupos de tratamiento con estearamida: tratados con estearamida en concentraciones de 5 μmol/L y 10 μmol/L. Las concentraciones de estearamida (5 y 10 μmol/L) se seleccionaron sobre la base de un informe anterior26, que sugería que los niveles de estearamida en el rango de 5-10 μmol/L pueden imitar una acumulación elevada de lípidos en condiciones patológicas. La intención aquí era explorar los efectos proapoptóticos e inmunomoduladores de la exposición a lípidos de alta concentración en los linfocitos de LES, simulando estados inflamatorios o metabólicamente desregulados. El colesterol y la estearamida se disolvieron primero en DMSO para preparar soluciones madre de alta concentración, que luego se diluyeron en medio de cultivo para alcanzar las concentraciones objetivo. La concentración final de DMSO en todos los grupos no superó el 0,1% (v/v). Después de agregar los tratamientos respectivos, las placas se agitaron suavemente para asegurar una distribución uniforme y se incubaron durante 48 h a 37 °C en un ambiente de 5% deCO2.
Ensayo de apoptosis
Para los experimentos de apoptosis, se recolectaron 1 × 106 a 3 × 106 células y se lavaron dos veces con PBS preenfriado. Se preparó un grupo de control positivo resuspendiendo las células en 500 μL de solución de control positivo para apoptosis preenfriada e incubando en hielo durante 30 minutos, seguido de otro lavado con PBS. Los grupos experimentales fueron tratados como se describe en la sección 1.7, con tratamientos de control, colesterol (1,5 mmol/L) y estearamida (10 μmol/L). Después del tratamiento, se recogieron 1-10 × 105 células (incluidas las del sobrenadante de cultivo) y se resuspendieron en 500 μL de tampón aglutinante 1× (preparado diluyendo la solución madre al 5× con agua bidestilada). Cada muestra se mezcló con un número igual de células vivas no tratadas y el volumen se ajustó a 1,5 ml con tampón de unión 1× preenfriado. A continuación, la suspensión se dividió en tres tubos: uno para el control del blanco y dos para la compensación de una sola mancha (anexina V-FITC y PI). A cada tubo experimental, se agregaron 5 μL de anexina V-FITC y 10 μL de solución de tinción PI, seguidos de vórtice e incubación a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5 minutos. La citometría de flujo se realizó utilizando un láser de excitación de 488 nm para detectar anexina V-FITC (emisión a 530 nm) y PI (emisión a 615 nm). El tubo de control en blanco se utilizó para establecer los voltajes de dispersión directa (FSC), dispersión lateral (SSC) y canal de fluorescencia, mientras que los tubos de tinción única se utilizaron para la compensación de fluorescencia. La apoptosis se analizó utilizando diagramas de dispersión de doble parámetro para evaluar la proporción de células apoptóticas27,28.
Detección de factores inmunitarios
Después de la incubación de 48 h, las suspensiones celulares se centrifugaron (250 × g durante 5 min) para recolectar los sobrenadantes de cultivo, que se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. La cuantificación de citoquinas se realizó utilizando un panel comercial de respuesta inmune esencial humana, siguiendo las instrucciones del fabricante con optimizaciones para el instrumento. Brevemente, se agregaron 25 μL de tampón de ensayo y 25 μL de estándares (que van de 2.4 a 10,000 pg / mL) o muestras a cada pocillo de una microplaca. La mezcla de perlas se agitó en vórtice durante 30 s y se agregó a los pocillos, lo que elevó el volumen total de reacción a 75 μL. La placa se incubó agitando (800 rpm) a temperatura ambiente durante 2 h en la oscuridad. Después de dos lavados automatizados (tampón de lavado 1×, 250 × g durante 5 min), se agregaron 25 μL de anticuerpo de detección biotinilado a cada pocillo y se incubaron durante 1 h. Posteriormente, se agregaron 25 μL de estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) durante 30 min para amplificar la señal.
La adquisición de datos se realizó utilizando un citómetro de flujo equipado con un láser de excitación de 488 nm y un filtro de 575/26 nm para la detección de PE. Antes de cada experimento, se utilizaron perlas de calibración para optimizar los voltajes del tubo fotomultiplicador y la compensación espectral. Los datos se analizaron utilizando el software LEGENDplex v8.0, con concentraciones de citoquinas determinadas mediante ajuste de curva logística de cinco parámetros (5PL). Los límites de detección para cada citocina oscilaron entre 0,68 pg/ml y 1,97 pg/ml, y los experimentos se realizaron por duplicado para garantizar la precisión (coeficiente de variación entre pocillos <10%). Los resultados se expresaron como media ±± desviación estándar, y las diferencias estadísticas entre los grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc de Tukey en un software de análisis estadístico apropiado. El período de incubación de 48 h se seleccionó en función de los cambios dinámicos en la secreción de citoquinas para capturar la respuesta inmune de manera integral. La calibración diaria del instrumento y el control de la concentración de DMSO (≤0,1%) aseguraron la confiabilidad y reproducibilidad de los resultados 29,30,31.