Artículo de método

Preacondicionamiento térmico durante la perfusión pulmonar ex vivo para la rehabilitación de injertos pulmonares dañados antes del trasplante

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DOI:

10.3791/69084

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31 de octubre de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un modelo de perfusión pulmonar ex-vivo en ratas que incorpora una exposición transitoria a un estrés térmico calibrado, promoviendo mecanismos protectores endógenos para el reacondicionamiento terapéutico de injertos pulmonares dañados. El enfoque es escalable y reproducible y apoya el desarrollo de terapias no farmacológicas para mejorar el éxito del trasplante de pulmón.

Resumen

La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) ha surgido como un gran avance en el trasplante de pulmón, permitiendo tanto la evaluación funcional de los pulmones del donante como las intervenciones terapéuticas para rehabilitar los injertos marginales. Las estrategias de reacondicionamiento incluyen enfoques farmacológicos y no farmacológicos. Entre estos últimos, demostramos que el estrés térmico transitorio y controlado ("Preacondicionamiento Térmico", TP) es un medio eficaz para restaurar los pulmones dañados al inducir una respuesta de choque térmico protectora endógena. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para un modelo EVLP de rata que incorpora TP para reacondicionar pulmones sometidos a isquemia caliente, simulando la donación después de la muerte circulatoria (DCD). El protocolo detalla la preparación pulmonar, la canulación, la perfusión y la inducción de la respuesta al choque térmico. La TP consiste en un aumento de 30 minutos en la temperatura de perfusión a 41,5 °C al principio de EVLP, seguido de un rápido retorno a 37 °C durante el resto de la perfusión. En un modelo EVLP de 6 h, los pulmones tratados con TP (n = 30) mostraron un aumento de la expresión de la proteína de choque térmico 70, una mejor distensibilidad pulmonar estática, una reducción del edema, una menor liberación del factor von Willebrand (un biomarcador de lesión endotelial) y un daño histológico atenuado en comparación con los controles (n = 30). El protocolo permite el monitoreo en tiempo real de la resistencia vascular, las presiones de las vías respiratorias, la distensibilidad pulmonar y la oxigenación, y admite análisis moleculares y morfológicos tanto en perfusión como en tejido. Este protocolo reproducible y escalable se adapta a sistemas EVLP animales o humanos más grandes, proporcionando una plataforma traslacional práctica para estudiar intervenciones no farmacológicas destinadas a mejorar los resultados de los trasplantes.

Introducción

La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) ha representado un gran avance en el campo del trasplante pulmonar. Su principal impacto radica en la expansión del grupo de injertos pulmonares de donantes disponibles al permitir la evaluación funcional de los pulmones marginales para permitir el uso de órganos que de otro modo se descartarían para el trasplante 1,2. Los pulmones de donantes marginales (o criterios extendidos) se refieren a uno o más de los siguientes criterios: edad del donante superior a 55 años, PaO2/FiO2 inferior a 300, tiempo de isquemia superior a 6 h, microbiología de esputo positiva, radiografía anormal3. Además de la evaluación fisiológica, EVLP puede servir como plataforma para la aplicación de diversas intervenciones terapéuticas destinadas a mejorar la calidad del injerto antes del trasplante (concepto de reacondicionamiento terapéutico)4. Como tal, EVLP brinda la oportunidad única de rehabilitar los pulmones dañados (marginales) y reducir el riesgo de disfunción primaria del injerto (DGP), una complicación importante que afecta los resultados tempranos y a largo plazo después del trasplante de pulmón 5,6. El DGP es la expresión clínica del proceso de lesión por isquemia-reperfusión (IRI), cuya fisiopatología se basa en el estrés oxidativo, la inflamación, la activación de las cascadas del complemento y la coagulación, y la inducción de procesos de muerte celular 7,8,9. En última instancia, estos mecanismos contribuyen a alterar las funciones normales del endotelio y el epitelio pulmonar, lo que conduce a un edema pulmonar no cardiogénico con capacidad de oxigenación reducida, las dos características clave del DGP 6,10,11,12.

Un número creciente de estudios experimentales, tanto preclínicos como clínicos, han demostrado la eficacia de diversas estrategias terapéuticas ex vivo para aliviar la IRI durante el trasplante pulmonar. Los ejemplos incluyen agentes farmacológicos dirigidos a oxidantes y radicales libres, vías de muerte celular, mediadores inflamatorios, así como terapias celulares y génicas, por nombrar solo algunas 13,14,15,16,17,18,19,20. Más allá de estos enfoques terapéuticos, EVLP también puede servir como plataforma para la aplicación de estrés fisiológico directamente al injerto pulmonar, para provocar mecanismos de protección intrínsecos que proporcionen una tolerancia adaptativa a las agresiones fisiopatológicas posteriores. Una de estas estrategias implica la aplicación de estrés térmico transitorio y no letal al injerto pulmonar durante EVLP. De hecho, se sabe desde hace mucho tiempo que las condiciones de estrés térmico promueven una respuesta adaptativa al choque térmico, resultante de la expresión de una serie de proteínas de choque térmico (HSP) que actúan como chaperonas moleculares y confieren resistencia a una mayor exposición a diversos estímulos estresantes21. Además de la inducción de HSP, se han identificado algunas adaptaciones celulares adicionales después de la exposición al calor, que incluyen (a) la vía antioxidante y citoprotectora del factor 2 relacionado con NF-E2 (NRF2), cuya activación tras el estrés térmico regula notablemente el gen citoprotector hemo oxigenasa22,23; (b) la respuesta proteica desplegada (UPR), que se ocupa del estrés proteotóxico en el retículo endoplásmico (estrés RE), y cuya activación por calor puede ser protectora o perjudicial, dependiendo de la intensidad del estrés térmico 24,25,26; (c) autofagia, un proceso citoprotector que promueve la degradación lisosomal de orgánulos y macromoléculas dañados, que puede activarse o inhibirse por calor de una manera dependiente de la temperatura y el tiempo27,28.

Hemos demostrado que dicho "preacondicionamiento térmico" proporciona importantes beneficios en términos de reducción del estrés oxidativo, la inflamación, la muerte celular y la disfunción endotelial, lo que lleva a una protección significativa contra el IRI pulmonar. Por lo tanto, propusimos que el preacondicionamiento térmico puede representar un método novedoso y no farmacológico para la rehabilitación terapéutica ex vivo de injertos pulmonares dañados antes del trasplante 29,30,31. El preacondicionamiento térmico puede ofrecer varias ventajas sobre las estrategias farmacológicas y no farmacológicas existentes. Al provocar una respuesta endógena celular integrada, puede proporcionar simultáneamente protección contra distintas vías fisiopatológicas relacionadas con IRI, mientras que otras estrategias generalmente se dirigen a una sola vía. Además, evita el riesgo de posibles efectos secundarios asociados con el uso de compuestos farmacológicos. El objetivo del presente artículo es presentar un protocolo detallado paso a paso de preacondicionamiento térmico durante la perfusión pulmonar ex vivo de pulmones de rata dañados, que podría aplicarse en diversos entornos, especialmente a modelos animales más grandes o pulmones humanos con fines de investigación.

Utilizamos el sistema pulmonar perfundido aislado en ratas IPL-2 para EVLP. La configuración se describe en la Figura 1 e incluye lo siguiente: Depósito de perfusión (Figura 1-1); dos bombas de rodillos, para circulación de perfusión (Figura 1-2A) y muestreo de perfusión (Figura 1-2B); un baño de agua termostático (Figura 1-3) para el mantenimiento de la temperatura de perfusión; un intercambiador de gas de membrana (Figura 1-4) conectado a un tanque de gas (no mostrado) que contiene una mezcla de 6% de O2, 10% de CO2 y 84% de N2 para desoxigenar y carboxilar la perfusión de entrada; dos sensores de presión (Figura 1-5) para monitorear las presiones de la aurícula izquierda (LA) y de la arteria pulmonar (PA) (el sensor de presión de PA no es visible en la figura); una cámara calentada y sellada (Figura 1-6) que alberga el bloqueo corazón-pulmón con conexiones dedicadas para PA, LA y cánulas traqueales; un ventilador (Figura 1-7) conectado a la cánula traqueal para la ventilación pulmonar y para la medición de la presión de las vías respiratorias y la distensibilidad pulmonar estática; un termómetro electrónico (Figura 1-8) para mostrar la temperatura de perfusión al nivel del flujo de entrada de PA. Una plataforma de conexión (Figura 1-9) cuyos elementos se muestran en detalle en la Figura 2: Conexión para las cánulas PA (Figura 2-1), LA (Figura 2-2) y traqueal (Figura 2-3); conexión a un módulo de peso (Figura 2-4) para el monitoreo continuo del peso del bloqueo corazón-pulmón; Un sensor de temperatura (Figura 2-5) para el monitoreo de la temperatura de perfusión en la entrada de PA. Una descripción esquemática detallada del circuito se puede encontrar en otra parte18.

Protocolo

NOTA: Para este estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho adulto (n = 60; edad, 8-11 semanas de edad; peso, 300-450 g). Los animales se alojaron (2 ratas / jaula) en nuestra instalación local para animales, mantenidos bajo un ciclo de 12 h de luz / 12 h de oscuridad con acceso ilimitado a comida y agua. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las "Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (Publicación NIH no. 96-23), y todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el protocolo experimental aprobado por nuestro comité local de cuidado de animales (Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud (autorizaciones 3456a y 3456x1). El tamaño y el peso de los animales se seleccionaron sobre la base de nuestros estudios previos en el modelo EVLP de rata y por conveniencia anatómica (tamaño de los pulmones y los vasos). Se eligió la cepa de Sprague-Dawley, dado que otras cepas (especialmente ratas Wistar) pueden exhibir reacciones de hipersensibilidad a la solución de dextrano presente en la solución de perfusión 1,32.

1. Descripción general del circuito EVLP

NOTA: La configuración se describe en la Figura 1 y los elementos de la plataforma de conexión (Figura 1-9) se muestran en detalle en la Figura 2. Una descripción esquemática detallada del circuito se ha descrito anteriormente18.

  1. Utilice una solución extracelular tamponada acelular para la perfusión ex vivo . Asegúrese de que el perfusato fluya desde el depósito a través del intercambiador de gases y se dirija a través de la cánula de PA para la perfusión pulmonar y luego salga a través de la cánula de LA de regreso al depósito. Monitoree continuamente las presiones de entrada (PA) y salida (LA).
  2. Conecte todos los transductores (presión PA, presión LA, peso pulmonar, velocidad de la bomba) a la caja convertidora analógica/digital (Figura 3). Abra el software básico de adquisición de datos (BDAS). Calibre las señales de presión mediante calibración de dos puntos (0; 10 cm H2O) utilizando una columna de agua. Calibre el módulo de pesas mediante calibración de dos puntos (0 g y 1 g). Calibre la velocidad de la bomba utilizando un muestreo de perfusión de 1 min a 10 ml/min. Controle la calidad de las señales aplicando presiones y velocidades de bomba conocidas y evaluando la idoneidad de los resultados (el protocolo detallado y el video para la calibración de señales se pueden encontrar en materiales complementarios).
  3. Registre todos los parámetros clave (PA, presiones de LA, peso pulmonar y flujo) en tiempo real mediante el software del sistema y observe su visualización en una computadora personal.
    NOTA: Las señales fisiológicas registradas por el BDAS se exportan a un archivo de texto utilizando el comando Exportación de archivos en la barra de menú. Los datos extraídos en puntos de tiempo seleccionados (cada 60 minutos) se transfieren a una hoja de cálculo y luego se copian y pegan en el software para su análisis estadístico.
  4. Calcule la resistencia vascular pulmonar (RVP) usando la ecuación (1):
    figure-protocol-1(1)
  5. Obtenga muestras (1-2 ml) del perfusato en puntos de tiempo dedicados para las mediciones de varios marcadores biológicos.

2. Aplicación de preacondicionamiento térmico

  1. Conecte un baño de agua termostático (Figura 4-1) para garantizar una temperatura del agua constante, precisa y ajustable para el calentamiento por perfusión. Utilice una bomba de motor integrada dentro del baño de agua para hacer circular el agua caliente.
  2. Use un recipiente de vidrio de doble pared como depósito (Figura 4-2) para mantener la temperatura de perfusión haciendo circular agua caliente entre las paredes del recipiente.
  3. Use una bobina de calentamiento con tubo serpentino dentro de un recipiente de agua caliente (Figura 4-3) para impulsar el perfusado, lo que permite el intercambio de calor del agua al perfusado inmediatamente antes de que ingrese a la preparación pulmonar ex vivo.
  4. Aloje el bloque corazón-pulmón en la cámara del órgano (Figura 4-4), un recipiente de doble pared lleno de agua que circula desde el baño de agua termostático para mantener un ambiente cálido.
  5. Para el sensor de temperatura y el termómetro (Figura 2-5 y Figura 4-5), aplique de forma segura y firme un sensor de aire/superficie de perlas tipo K contra la cánula de entrada para un monitoreo continuo de la temperatura real de perfusión que ingresa a la arteria pulmonar (PA). La temperatura se muestra en un termómetro digital.
  6. Para mantener la temperatura de la entrada a 37 °C, ajuste el baño de agua a 38-38,5 °C.
    NOTA: Para compensar las pérdidas de calor del perfundido a lo largo de su curso en la tubería, determinamos en nuestras condiciones que la temperatura del baño de agua tenía que ajustarse a 38-38,5 °C para mantener 37 °C en la entrada. Dependiendo de las pérdidas de calor del perfundido, es posible que estos ajustes deban adaptarse para garantizar la temperatura deseada en la entrada.
  7. Inicie el protocolo de calentamiento ex-vivo después de 60 min de EVLP aumentando la temperatura del baño de agua hasta 43 °C para alcanzar una temperatura de entrada de 41,5 °C, que se obtiene durante 5 min y se mantiene durante 30 min.
    NOTA: En nuestro trabajo anterior29, determinamos la temperatura óptima para el preacondicionamiento térmico (TP), utilizando un rango de temperaturas de 40 °C a 43,5 °C y un protocolo EVLP de 3 h, como se muestra en la Figura 5. Se encontró que la temperatura de calentamiento que proporciona una protección óptima sin efectos nocivos (como se resume en la Figura 5B) es de 41,5 °C. Por lo tanto, esta temperatura se utilizó en todos nuestros experimentos posteriores, con duraciones de EVLP de hasta 6 h29,30,31.
  8. Después de este calentamiento transitorio, agregue hielo al baño de agua para reducir rápidamente (en 5 min) la temperatura del baño de agua a 38 ° C para que la temperatura de perfusión en la cánula de entrada vuelva a 37 ° C y mantenga esta temperatura hasta el final del protocolo EVLP.
  9. Determinar variables fisiológicas (distensibilidad pulmonar), formación de edema y criterios de valoración moleculares (expresión de proteínas de choque térmico, enzimas antioxidantes, citocinas inflamatorias y biomarcadores de apoptosis, autofagia, estrés del retículo endoplásmico y daño de las células endoteliales).

3. Protocolo EVLP detallado para el preacondicionamiento térmico

  1. Preparación animal
    1. Prepare los materiales necesarios, incluidas las cánulas y los instrumentos quirúrgicos (Figura 6A, B y Tabla de materiales).
    2. Pesar al animal para calcular las dosis adecuadas para todas las sustancias administradas, el flujo de perfusión y los parámetros de ventilación.
    3. Preparar la mezcla anestésica: 80 mg/kg de ketamina y 8 mg/kg de xilacina en la misma jeringa.
      NOTA: Los agentes anestésicos deben almacenarse en un gabinete seguro.
    4. Preparar heparina, 1,7 U/g de peso corporal en solución salina isotónica (jeringa de 1 ml).
    5. Anestesiar al animal, usando isoflurano al 5% (vaporizado en una cámara de inducción dedicada), seguido de una inyección intraperitoneal de la mezcla anestésica preparada. Mantenga la anestesia con isoflurano al 1-2% a través de una mascarilla.
      NOTA: Es importante mantener anestesia profunda para evitar jadeos durante la exanguinación.
      Utilice una configuración con un sistema de extracción de isoflurano para proteger al operador.
      Deseche todas las agujas y jeringas en contenedores apropiados para desechos afilados y de riesgo biológico. Los contenedores sellados de objetos afilados y de riesgo biológico se eliminan a través de flujos de desechos designados.
    6. Afeite al animal desde la garganta hasta el área del pene y retire cualquier resto de pelo con papel húmedo y tibio.
    7. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando la pata trasera; Aumente la concentración de isoflurano si hay reflejos.
    8. Coloque al animal en posición supina y asegure las cuatro extremidades con cinta adhesiva.
  2. Extracción del bloqueo corazón-pulmón para EVLP
    NOTA: El procedimiento requiere un entrenamiento intensivo para realizar los diferentes pasos de manera oportuna, atraumática y altamente reproducible. El paso más delicado es la canulación de la arteria pulmonar, que debe realizarse con aumento utilizando un microscopio quirúrgico especular para obtener los mejores resultados. El procedimiento completo puede ser realizado por un solo investigador bien capacitado. Para lograr dicha independencia experimental, se requiere un mínimo de 15 procedimientos completos bajo la supervisión de un investigador experimentado.
    1. Levante suavemente la piel en la línea media de la garganta y haga una incisión longitudinal de 5 cm a lo largo del eje caudal a cefálico con unas tijeras pequeñas.
    2. Separe los lóbulos de las glándulas salivales y diseccione cuidadosamente la fascia sobre los músculos esternohioides con fórceps curvos hasta que la laringe y la tráquea estén claramente expuestas.
    3. Pase una sutura de seda 4-0 debajo de la tráquea y prepare un nudo preatado, dejando las pinzas en su lugar debajo de la tráquea.
    4. Calcule el volumen corriente (Vt) para la ventilación in vivo y la obtención pulmonar utilizando la fórmula de Stahl33:
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. Ajuste el ventilador dedicado a la ventilación in vivo y la obtención pulmonar (consulte la Tabla de materiales) al volumen corriente calculado con una frecuencia respiratoria de 70 respiraciones / min, una fracción inspirada de oxígeno (FiO2) de 0,5 y una presión positiva al final de la espiración (PEEP) de 3 cm H2O.
      NOTA: Para ajustar la PEEP a 3 cm H2O, conecte el brazo espiratorio del ventilador a un tubo de silicona curado con platino insertado 3 cm debajo de la superficie de un recipiente lleno de agua.
    6. Cree una incisión transversal entre dos anillos cartilaginosos, inserte una cánula de 2 mm de diámetro exterior (14 mm de longitud, cánula de ventilación EVLP, Figura 6B) para ventilación y asegúrela apretando la sutura.
    7. Conecte la cánula al ventilador y confirme la ventilación efectiva mediante la presencia de burbujas en el recipiente lleno de agua conectado al brazo espiratorio del ventilador.
    8. Con unas tijeras de punta roma, haga una incisión en la piel a lo largo del abdomen y entre en la cavidad peritoneal, continúe haciendo una incisión en los músculos de la pared abdominal de la línea media hasta el diafragma.
    9. Mueva suavemente los intestinos a un lado con hisopos de algodón para exponer la vena cava inferior.
    10. Inyecte la solución de heparina preparada en la vena y déjela circular durante 5 min. Luego, secciona la vena cava y la aorta para desangrar.
    11. Una vez que el animal esté completamente desangrado y se confirme su muerte, detenga la ventilación y desconecte el ventilador de la cánula traqueal para permitir que los pulmones se desinfle, marcando el inicio de la isquemia caliente. Mantenga el tiempo isquémico caliente total (WIT) en 1 h.
      NOTA: Aunque la mediana de WIT informada en la donación clínica de pulmón DCD es de 33 min, no se han informado efectos perjudiciales de duraciones de WIT de hasta 60 min en la supervivencia a 1 año. Por lo tanto, la mayoría de los centros actualmente están de acuerdo en 60-90 min como un límite superior aceptable de WIT34. Como se detalló anteriormente, el uso de 1 h de WIT en nuestro modelo de rata es, por lo tanto, relevante para el escenario clínico35.
    12. Quince minutos antes del final del tiempo isquémico caliente total de 1 h (es decir, después de 45 min de isquemia tibia), llene una jeringa de 60 ml (fijada en un soporte) con solución de conservación fría (4 °C, almacenada en el refrigerador) (ver composición en la Tabla 1).
      NOTA: La parte inferior de la jeringa se coloca a 20 cm por encima del animal. Conecte la jeringa a la cánula de PA, utilizando un tubo de silicona sumergido en agua helada (Figura 6C).
    13. Realice una esternotomía mediana con tijeras Lister de punta roma para evitar dañar el tejido y retraiga cuidadosamente la pared torácica con retractores romos unidos a bandas elásticas y un hemostático de micromosquito unido al diafragma para exponer los pulmones. Evite cualquier contacto directo con el parénquima pulmonar.
      NOTA: A partir de este paso, para evitar el secado del tejido, aplique una pequeña cantidad de solución salina fisiológica en la superficie del pulmón cuando sea necesario.
    14. Haga una incisión en "X" en el vértice del ventrículo izquierdo del corazón y deslice las tijeras dentro del corazón hasta la aurícula izquierda para facilitar la inserción posterior de la cánula LA.
    15. Pase una sutura de seda 5-0 debajo del PA principal y prepare un nudo doble preatado y sostenga la sutura en un lado con un soporte casero (Figura 6D y Figura 7A).
    16. Prepare una sutura adicional alrededor del corazón para asegurar posteriormente la cánula LA (Figura 7B).
    17. Haga una pequeña incisión en el PA principal e inserte la cánula de PA, asegurándose de que no se introduzca ninguna burbuja de aire.
    18. Perfundir inmediatamente los pulmones con 25 mL de la solución de conservación en frío a través de la cánula PA, iniciando el tiempo de isquemia por frío.
      NOTA: Utilice presión pasiva desde la altura de la jeringa sobre el soporte descrito anteriormente para esta perfusión.
    19. Asegure la cánula en su lugar con la sutura preatada.
    20. Inmediatamente después de la canulación de PA, vuelva a conectar la cánula traqueal al ventilador y reanude la ventilación con los ajustes iniciales, reduciendo la frecuencia respiratoria a 25 respiraciones/min.
    21. Inserte la cánula LA a través de la incisión en el ventrículo izquierdo hacia la aurícula izquierda.
    22. Asegure la cánula con la segunda sutura preatada (alrededor del corazón), teniendo cuidado de evitar que se impida el flujo desde la aurícula izquierda y deje pasar todo el volumen de 25 ml de solución de conservación en frío (tarda ~ 15 min).
    23. Al final de la perfusión de la solución de conservación, sujete la cánula de PA con una pinza bulldog (Figura 7C, círculo azul) y desconéctela del tubo.
    24. Diseccionar cuidadosamente la tráquea y los tejidos circundantes para movilizar los pulmones.
    25. Sujete la tráquea con un clip para aneurisma (Figura 7C, círculo rojo), mientras los pulmones están completamente inflados (un volumen corriente).
    26. Diseccionar la aorta descendente y otros vasos de soporte para liberar el bloqueo corazón-pulmón, levantándolo agarrando suavemente la tráquea.
    27. Colocar el bloque corazón-pulmón en un plato que contenga solución de conservación en decúbito prono y almacenar a 4 °C durante un tiempo total de isquemia fría de 1 h.
      NOTA: Al final de la cirugía, coloque los restos biológicos en bolsas de eliminación de desechos para que el servicio dedicado los elimine aún más.
  3. Ex-vivo Perfusión pulmonar y preacondicionamiento térmico
    NOTA: Consulte el diagrama de flujo que describe los pasos principales para guiar la progresión a través de las diferentes etapas del protocolo (Figura 8).
    1. Coloque un cubo de hielo en el baño de agua termostático para reducir la temperatura de perfusión a 15 °C.
    2. Llene el depósito con 100 ml de perfusión y deje que circule por el sistema. Utilice la solución de perfusión a base de albúmina humana (consulte la composición en la Tabla 1) como solución extracelular tamponada acelular para la perfusión ex vivo .
    3. Mida el pH del perfusado y manténgalo en un nivel fisiológico (7,35-7,45), agregue tampón de tris(hidroximetil)aminometano (THAM) en consecuencia.
    4. Pese el bloqueo corazón-pulmón y móntelo en el sistema EVLP, comenzando con la cánula de ventilación mientras mantiene el clip del aneurisma en su lugar en la tráquea.
    5. Conecte la cánula de PA, evitando cuidadosamente la introducción de burbujas de aire en la vasculatura pulmonar (asegúrese de que la trampa de burbujas esté llena).
    6. Deje salir unas gotas de solución de perfusión y conecte la cánula LA.
    7. Ajuste la presión de la aurícula izquierda a 3 mm Hg ajustando la altura de la línea de salida conectada al circuito de drenaje.
    8. Ponga a cero el módulo de peso y controle el cambio de peso del bloqueo cardíaco y pulmonar durante EVLP.
    9. Calcule el gasto cardíaco teórico (GC) utilizando la fórmula desarrollada por Lindstedt y Schaeffer:
      figure-protocol-4
    10. Iniciar la perfusión (2% del CO teórico) y aumentar gradualmente el flujo de perfusión (7,5% del CO teórico) y la temperatura de acuerdo con los parámetros especificados, como se describe en la Tabla 2.
      NOTA: Durante EVLP, el flujo de perfusión se establece entre el 2% y el 7,5% del CO teórico calculado. Este bajo flujo de perfusión permite mantener la presión arterial pulmonar dentro de los rangos normales y reducir el riesgo de edema pulmonar temprano, especialmente en pulmones calientes con daño isquémico. Esto permite a los usuarios mantener la preparación durante largos períodos de tiempo. Otros investigadores utilizaron flujos comparables para EVLP de rata, mientras que otros utilizaron flujos de hasta el 20% del CO38 teórico.
    11. Ajuste la temperatura del perfundido aumentando progresivamente la temperatura del baño de agua.
      NOTA: Tenga cuidado de mantener las manos alejadas de todo el equipo de calefacción para evitar posibles lesiones.
    12. Una vez que la temperatura de perfusión alcance los 35 °C, inicie la ventilación mecánica retirando el clip del aneurisma de la tráquea y poniendo en marcha el ventilador dedicado a la ventilación ex vivo (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La calibración de presión se realiza cada 14 días mediante calibración de dos puntos (0 y 30 cm H2O). La calibración del tubo se realiza en cada utilización de acuerdo con un protocolo programado, para corregir los factores externos relacionados con la resistencia de los tubos y la cánula.
      1. Utilice el software de referencia para la configuración del ventilador y la adquisición de datos, ya que proporciona registros continuos de las señales respiratorias y la distensibilidad pulmonar en puntos de tiempo dedicados (consulte el diagrama de flujo, Figura 8), de acuerdo con un protocolo programado de aumento gradual del volumen pulmonar con medición concomitante de la presión de las vías respiratorias.
      2. Luego, el cumplimiento se calcula automáticamente mediante una ecuación ajustada a la rama de desinflado del circuito de volumen de presión (ecuación de Salazar-Knowles).
      3. Muestre todos los datos ventilatorios, guárdelos en una computadora personal dedicada y expórtelos a una hoja de cálculo. Extraiga datos en puntos de tiempo seleccionados, transfiéralos a otra hoja de cálculo y luego cópielos/péguelos en el software de análisis estadístico.
    13. Ajuste la frecuencia respiratoria y el volumen corriente a 7 brazadas/min y 3 ml/kg, respectivamente, durante 10 min, y luego aumente a 15 brazadas/min y 6 mL/kg durante 10 min y, finalmente, 30 brazadas/min y 6 mL/kg hasta el final de EVLP. Ajuste la presión positiva al final de la espiración (PEEP) a 3 cm H2O durante toda la EVLP (Tabla 2).
    14. Aplicar una maniobra de reclutamiento cada 30 min de EVLP para prevenir la atelectasia ajustando la presión de las vías respiratorias a 15 cm H2O durante 6 s.
    15. A las 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h y 6 h EVLP, aplique una inflación pulmonar escalonada hasta un volumen pulmonar total de 10 ml / kg de peso corporal para determinar la distensibilidad pulmonar y la presión inspiratoria máxima (Pmax).
      NOTA: Las mediciones de cumplimiento se realizan después de una maniobra de reclutamiento descrita anteriormente.
    16. Aumente la temperatura de perfusión para alcanzar los 37 °C en la cánula de PA de entrada después de 60 min de EVLP.
    17. Inicie el protocolo de calentamiento ex-vivo después de 60 min de EVLP.
    18. Aumente la temperatura del baño de agua hasta 43 °C para alcanzar los 41,5 °C en la cánula de PA de entrada (esto tarda ~ 5 min), como se muestra en la Figura 2, Figura 3 y Figura 4-5.
    19. Mantenga esta temperatura de 60 min a 90 min EVLP (total de 30 min).
      NOTA: En nuestro trabajo anterior, demostramos que 41,5 °C durante 30 min no promovieron la lesión térmica a nivel de todo el pulmón29. No realizamos ensayos específicos de viabilidad celular in vitro para probar la lesión térmica en tales condiciones.
    20. Después de 30 min de calentamiento, agregue hielo al baño de agua para ajustar rápidamente (5 min) la temperatura en la cánula de entrada a 37 °C.
      NOTA: En el grupo de control, la temperatura de perfusión se mantiene a 37 °C durante todo el EVLP, sin aplicación de preacondicionamiento térmico (ver Tabla 2). No incorporamos un grupo de "calentamiento simulado" (por ejemplo, mediante el ajuste del calor del baño de agua sin aumento de temperatura).
    21. Mantenga la temperatura de perfusión a 37 °C en la cánula de PA de entrada hasta el final del EVLP.
    22. Recoja muestras de solución de perfusión a 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h (1-2 ml en cada punto de tiempo) y 6 h (10 ml) de EVLP, de uno de los puertos de muestreo conectados al circuito (aguas arriba o aguas abajo de la preparación pulmonar), como se muestra en la Figura 1-2B. Utilice las muestras inmediatamente para análisis de gases (medición de pH, PCO2 y PO2, utilizando el cartucho CG4+). Para realizar más mediciones bioquímicas, centrifugar las muestras (500 × g, 10 min a 4 °C) y mantener el sobrenadante transparente a -80 °C hasta su uso.
    23. Después de 6 h de EVLP, vuelva a aplicar el clip del aneurisma en la tráquea (una vez que el pulmón esté completamente inflado) y sujete la cánula de megafonía con una pinza bulldog.
    24. Pesar el bloqueo corazón-pulmón para obtener su peso final.
      NOTA: el aumento de peso durante EVLP se puede evaluar como la diferencia entre los pesos final e inicial o se puede monitorear continuamente durante EVLP con el módulo de peso descrito anteriormente.
    25. Diseccionar cuidadosamente los pulmones, separando los lóbulos individuales.
    26. Conserve el tejido para aplicaciones posteriores: congele rápidamente en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C para análisis bioquímicos o fíjelo en paraformaldehído (PFA) para evaluación histológica. El pulmón izquierdo se puede conservar y preparar para el trasplante de pulmón.

4. Estadísticas

  1. Asigne a los animales a grupos de tratamiento específicos (control versus preacondicionamiento térmico, n = 5 / grupo para cada criterio de valoración experimental).
    NOTA: No asignamos animales al azar a uno u otro grupo, sino que los grupos se alternan cada día. El protocolo (calor vs control) no se puede realizar de manera ciega, debido a la necesidad de conocer estrictamente la temperatura del perfusado durante los experimentos. Por el contrario, los análisis biológicos e histológicos se realizan de forma ciega, sin identificar el grupo de tratamiento asignado.
  2. Analice los datos.
  3. Expresar los resultados como medios ± SEM.
  4. Verifique la distribución normal de los datos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov.
  5. Para experimentos de puntos de tiempo, evalúe los efectos de la asignación de tiempo y grupo utilizando ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post-hoc de Sidak para efectos de grupo y corrección de Bonferroni para efectos de tiempo, utilizando 1 h como referencia. Considere un valor de p < 0.05 como estadísticamente significativo. Considere la transformación logarítmica de los datos en caso de distribución no normal antes de aplicar ANOVA.
  6. Para los análisis histológicos, determine (de forma ciega) la puntuación de lesión pulmonar de cada muestra, cuantificando el edema perivascular en 10 campos/sección.
    1. Utilice el número relativo de vasos con edema perivascular (A): 0: ausente; 1: leve (<25%); 2: moderado (25-50%); 3: grave (>50%).
    2. Utilice el grosor del edema perivascular (B), calculado como un porcentaje de los diámetros de los vasos internos (0: sin edema; 1: <25%; 2: 25-50%; 3: >50%).
    3. Utilice la suma de A + B en las 10 secciones examinadas para calcular la puntuación31.
    4. Realizar comparaciones estadísticas mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney (debido a una distribución no normal de los datos), con significación asignada a p < 0,05.

Resultados

Las variables fisiológicas pulmonares se monitorean continuamente durante todo el procedimiento, incluida la presión de la arteria pulmonar (PAP), la resistencia vascular pulmonar calculada y los parámetros ventilatorios, incluida la distensibilidad pulmonar estática (SPC) y la presión máxima de las vías respiratorias (Pmax). Además, el módulo de peso permite la evaluación de la formación de edema al proporcionar una medida indirecta de la acumulación de líquido en el pulmón. Los beneficios del preacondicionamiento térmico (TP) con respecto a los pulmones de control (Ctrl) incluyen una mejora de la SPC (Figura 9A, expresada como la relación de SPC en cada punto de tiempo con el valor inicial de SPC, n = 5 / grupo) y una reducción del aumento de peso pulmonar (Figura 9B, n = 5 / grupo) durante EVLP. Los datos se presentan como medios ± SEM.

El líquido de perfusión se puede analizar para varios biomarcadores. Por ejemplo, el preacondicionamiento térmico se asocia con una liberación significativamente reducida de von Willebrand (vWF), un biomarcador de células endoteliales al final de EVLP (Figura 9C, n = 5 / grupo, significa ± SEM).

Los análisis morfológicos del tejido pulmonar obtenidos al final de EVLP incluyen histología e inmunohistoquímica. En la Figura 9D se muestran ejemplos de secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H y E), que muestran un daño histológico reducido en los pulmones expuestos al preacondicionamiento térmico, expresado como una puntuación de lesión pulmonar (Figura 9E, n = 5 / grupo). La puntuación se estableció cuantificando el edema perivascular en 10 campos/sección (ver pasos del protocolo 4.6.1 y 4.6.2). La suma de A + B en las 10 secciones examinadas se utilizó para calcular la puntuación31.

Los análisis moleculares en el tejido pulmonar al final de EVLP incluyen perfiles de expresión de ARN o proteínas. Como ejemplo, los niveles de expresión de proteínas de la proteína de choque térmico inducible HSP70 se pueden medir mediante ELISA, para mostrar el desarrollo de la respuesta al choque térmico en pulmones expuestos al preacondicionamiento térmico (Figura 9F, que muestra un experimento de curso de tiempo con diferentes duraciones de EVLP, n = 5 / grupo en cada punto de tiempo). La expresión de HSP70 en el grupo TP alcanzó su punto máximo después de 3 h de EVLP, es decir, 90 min después del final de TP, y se mantuvo estable a partir de entonces hasta el final de EVLP. Los datos se presentan como medios ± SEM.

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Figura 1: Descripción de la plataforma EVLP. (1) Depósito de doble pared para perfusión. (2A) Bomba de rodillos para circulación de perfusión. (2B) Bomba de rodillos para muestreo de perfusión (mediciones bioquímicas y análisis de gases). (3) Baño de agua termostático. (4) Intercambiador de gas de membrana conectado a un tanque de gas (no se muestra). (5) Sensor de presión de la aurícula izquierda. (6) Cámara calentada y sellada. (7) Ventilador EVLP. (8) Sonda de temperatura y termómetro. (9) Plataforma de conexión para el bloqueo corazón-pulmón, cuyos elementos se detallan en la Figura 2. (Nota: el sensor de presión PA no es visible). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Plataforma de conexión para el bloqueo corazón-pulmón. (1) Cánula de entrada a la arteria pulmonar. (2) Cánula de salida de la aurícula izquierda. (3) Conexión para la cánula traqueal. (4) Módulo de peso. (5) Sonda de temperatura diseñada internamente firmemente unida contra la cánula de entrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Transductores/amplificadores de señal y caja convertidora analógica/digital. (A). Transductor/amplificador de presión de la arteria pulmonar. (B). Controlador de flujo de velocidad de la bomba. (C). Transductor/amplificador de presión de la aurícula izquierda. (D). Módulo de peso pulmonar. (E). Convertidor analógico/digital. (F). Computadora personal para visualización y registro de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Mantenimiento de la temperatura del perfusado durante EVLP. (1) Baño de agua termostático. (2) Depósito de perfusión con recipiente de vidrio de doble pared por donde circula el agua del baño de agua termostático. (3) Tubería de serpentín de calentamiento dentro de un recipiente de agua caliente conectado al baño de agua termostático. (4) Cámara de órgano con recipiente de vidrio de doble pared para la circulación de agua tibia desde el baño de agua. (5) Termómetro electrónico y sonda de temperatura diseñada internamente firmemente unidos contra la cánula de entrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Identificación de la temperatura óptima para el preacondicionamiento térmico. (A) Protocolo EVLP para la evaluación de diferentes temperaturas de calentamiento. De 60 min a 90 min de EVLP, la temperatura de perfusión se incrementó a las temperaturas indicadas. A los 90 min de EVLP, la temperatura se volvió a 37 °C durante 90 min hasta el final de EVLP, donde se realizaron diversas mediciones fisiológicas y moleculares. (B) Resumen de resultados de los efectos de las diferentes temperaturas de calentamiento sobre los parámetros fisiológicos y moleculares (el verde indica efectos favorables; el rojo indica efectos desfavorables; y el naranja indica efectos mixtos). La temperatura de calentamiento de 41,5 °C proporcionó los efectos más protectores. Abreviaturas: EVLP = perfusión pulmonar ex vivo ; TP = preacondicionamiento térmico. Esta cifra fue modificada de Ojanguren et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Material quirúrgico. (A) Instrumentos para la extracción del bloqueo corazón-pulmón: Soporte de clip de aneurisma y microclip de aneurisma (sistema Yasargil), pinza bulldog, tijeras, microtijeras, retractores unidos a bandas elásticas. (B) Cánulas EVLP para la arteria pulmonar (AP), la aurícula izquierda (LA) y la tráquea. (C) Sistema de perfusión casero para el lavado de los pulmones con perfusión fría. La distancia entre el nivel del PA en el animal y la parte inferior de la jeringa se establece en 20 cm. (C) Soporte casero. (No se muestra: microscopio quirúrgico, ventilador y configuración de anestesia). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Imágenes representativas de la preparación quirúrgica (A) Nudo preatado alrededor de la arteria pulmonar. (B) Nudo preatado alrededor de la punta del corazón. (C) Pinza de bulldog (círculo azul) en la cánula de megafonía y pinza de aneurisma (círculo rojo) en la tráquea. Abreviatura: PA = arteria pulmonar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Diagrama de flujo. Pasos importantes para guiar la progresión a través de las diferentes etapas del protocolo. El período entre 1 h y 1,5 h EVLP se amplía para indicar el protocolo de tratamiento según la asignación del grupo (control vs preacondicionamiento térmico). Abreviaturas: IC = isquemia fría; EVLP = perfusión pulmonar ex vivo ; PA = arteria pulmonar; SPC = distensibilidad pulmonar estática; TP = preacondicionamiento térmico; WI = isquemia caliente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Resultados representativos de los efectos del preacondicionamiento térmico en pulmones de rata dañados. Los pulmones dañados por 1 h de isquemia caliente se perfundieron en un sistema EVLP durante 6 h. De 60 a 90 min de EVLP, un grupo de pulmones fue sometido a preacondicionamiento térmico a 41,5 °C (grupo TP). Un grupo control de pulmones se mantuvo a 37 °C durante toda la EVLP. (A) Distensibilidad pulmonar estática (SPC), expresada como la relación del valor inicial, en los pulmones control (Ctrl, n = 5) y TP (n = 5). La SPC se conservó mejor en los pulmones TP. (B) Aumento de peso de los pulmones durante EVLP en control (n = 5) y pulmones TP (n = 5). Hubo una reducción significativa en la formación de edema en el grupo TP. (C) La liberación en el perfundido del biomarcador de células endoteliales von Willebrand Factor se suprimió en el grupo TP (n = 5) en comparación con los controles (n = 5). (D) Aspecto macroscópico y microscópico pulmonar (tinción con hematoxilina-eosina) al final de EVLP en los pulmones de control (n = 5) y TP (n = 5). (E) La puntuación de lesión pulmonar (para la cuantificación del daño histológico) fue menor en el grupo TP (n = 5) en comparación con el grupo control (n = 5). (F) Niveles de proteína de la proteína de choque térmico inducible HSP70 en extractos de tejido pulmonar medidos después de 1, 2, 3, 4,5 y 6 h EVLP en los grupos de control y TP (n = 5 / grupo en cada punto de tiempo), mostrando una marcada respuesta al choque térmico en el grupo TP. La expresión de HSP70 en el grupo TP alcanzó su punto máximo después de 3 h de EVLP (90 min después del final de TP) y se mantuvo estable a partir de entonces hasta el final de EVLP.
Todos los gráficos muestran medios ± SEM. Para los experimentos de curso de tiempo (A-C, F), se realizaron comparaciones estadísticas utilizando ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Sidak para el efecto de grupo y los ajustes de Bonferroni para el efecto del tiempo (con el tiempo 1 h como referencia). Para la puntuación de lesión pulmonar (E), se realizaron comparaciones estadísticas mediante la prueba de Mann-Whitney. * p < 0,05 (diferencias intergrupales), † p < 0,05 vs 1 h EVLP. Abreviaturas: Ctrl = control; EVLP = perfusión pulmonar ex vivo ; HSP70 = proteína de choque térmico 70; SPC = distensibilidad pulmonar estática; TP = preacondicionamiento térmico. Modificado de Parapanov et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición de las soluciones utilizadas en el protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Ajustes de EVLP para el flujo de perfusión, la temperatura de entrada (a nivel de la cánula de la arteria pulmonar) y la ventilación a lo largo del tiempo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Solución de problemas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Materiales complementarios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El desarrollo de un modelo EVLP de rata reproducible y fisiológicamente relevante representa un importante paso adelante en la investigación del trasplante pulmonar. A pesar de las diferencias significativas entre las especies entre el pulmón de rata y el humano (revisado recientemente en1), en particular la mayor vulnerabilidad del pulmón de rata, el modelo EVLP de rata ofrece intervenciones farmacológicas y no farmacológicas con alta reproducibilidad y bajo costo. EVLP ofrece una plataforma única para evaluar la función pulmonar del donante, simular escenarios de lesión clínica como la lesión por isquemia-reperfusión e implementar intervenciones terapéuticas antes del trasplante 2,39,40. En este contexto, el modelo EVLP en ratas permite investigaciones mecanicistas de alto rendimiento en condiciones estrictamente controladas33. En los últimos años, varios grupos han contribuido al refinamiento de las técnicas de EVLP en ratas. Nelson et al. proporcionaron orientación procesal fundamental39. Wang et al. propusieron una configuración modular de EVLP adaptada para imitar la simulación de donación después de la muerte circulatoria (DCD)41. Gouchoe et al. exploraron nuevas formulaciones de perfusión utilizando portadores de oxígeno artificiales42 y Oliveira et al. se centraron en la inflamación después de la preservación de la isquemia fría prolongada38. Sobre la base de este conocimiento existente, nuestro protocolo actual introduce una estrategia novedosa y no farmacológica, a saber, el preacondicionamiento térmico, diseñada para activar los mecanismos de protección endógenos para el reacondicionamiento de injertos pulmonares de rata dañados por isquemia caliente. Nuestro modelo de pulmón dañado, que simula condiciones de DCD, se realizó en ratas macho Sprague-Dawley33.

El establecimiento de este protocolo requirió una atención cuidadosa a varios pasos técnicamente exigentes que influyen críticamente en la viabilidad y reproducibilidad pulmonar. La recuperación pulmonar debe realizarse con una manipulación mínima para evitar lesiones parenquimatosas. La profundidad de la anestesia es primordial para prevenir la congestión pulmonar inducida por el jadeo y la mala exanguinación. Es esencial evitar estrictamente las burbujas de aire durante la canulación y el cebado del circuito, ya que incluso los émbolos pequeños pueden precipitar el edema43. En la Tabla 3 se indican consejos específicos para la resolución de problemas de protocolos comunes. Si bien los ajustes de ventilación y perfusión se pueden ajustar dentro de los límites seguros, se deben mantener estrategias de protección pulmonar para prevenir el barotrauma o el volutrauma44. El flujo de perfusión se puede aumentar hasta un 20% del gasto cardíaco estimado en ratas, en comparación con el 40% en modelos más grandes como cerdos y humanos, pero debe ajustarse cuidadosamente45. En nuestro protocolo, utilizamos un flujo de perfusión más bajo (7,5% del gasto cardíaco teórico), para prevenir aumentos repentinos de la presión de la arteria pulmonar y el desarrollo de edema pulmonar temprano en pulmones dañados isquémicos calientes, lo que permite una preparación prolongada. Aunque algunos laboratorios administran corticosteroides durante la perfusión para reducir la inflamación46,47, sus efectos antiinflamatorios conocidos podrían confundir algunos resultados experimentales y, por lo tanto, no los usamos en nuestro modelo para preservar la capacidad de estudiar la lesión pulmonar y los procesos inflamatorios.

El preacondicionamiento térmico requiere un control preciso de la temperatura. Debido a que el calor se pierde a lo largo del tubo desde el depósito hasta el pulmón, la temperatura de perfusión debe controlarse en la cánula de entrada y la configuración del baño de agua debe mantenerse ligeramente por encima de la temperatura de entrada deseada para lograr el objetivo dentro de la preparación. Los sensores se calibran anualmente utilizando un termómetro digital PCE-T 1200 multicanal para garantizar la precisión.

Nuestros hallazgos también abordan las limitaciones clave de la terapia de calor convencional. La aplicación sistémica de calor está limitada por una regulación imprecisa de la temperatura, efectos secundarios sistémicos y falta de especificidad de los órganos. EVLP elude estas barreras al proporcionar un entorno controlado y localizado, lo que permite la administración precisa de estrés térmico directamente al tejido pulmonar29. Este método permite una modulación rigurosa tanto de la magnitud como de la duración del estrés térmico, dos parámetros críticos para optimizar la respuesta celular protectora sin desencadenar daño térmico. Además, nuestra plataforma EVLP permite múltiples evaluaciones posteriores, incluidos análisis moleculares, histológicos y funcionales. Es importante destacar que los pulmones sometidos a EVLP también pueden ser trasplantados, lo que permite la evaluación directa de la función del injerto post-EVLP in vivo29. Por lo tanto, el modelo apoya la evaluación tanto a nivel de órgano aislado como posterior al trasplante. En este contexto, la integración del preacondicionamiento térmico, una exposición transitoria a 41,5 °C durante EVLP, surge como una intervención prometedora. Al estimular una respuesta de choque térmico y otras vías de adaptación al estrés, este método mejora la resistencia del injerto sin factores de confusión farmacológicos. Nuestros resultados muestran que el preacondicionamiento térmico mejora la fisiología del injerto pulmonar, reduce la formación de edema y la liberación de mediadores inflamatorios y biomarcadores de lesión celular (como lo ejemplifican los niveles reducidos del factor von Willebrand en el perfusato EVLP de los pulmones tratados térmicamente). Los análisis morfológicos respaldan aún más el efecto protector de esta intervención, con un daño estructural reducido y una integridad tisular preservada. La mayoría de los datos experimentales de EVLP en ratas se han generado en machos, lo que limita la percepción específica del sexo; Dos estudios informaron resultados divergentes en las mujeres: reducción de la lesión por reperfusión en uno y aumento de la inflamación en otro48,49. Aunque nuestro estudio utilizó hombres, previamente observamos beneficios de TP en un modelo de EVLP porcino con mujeres29, lo que sugiere relevancia entre sexos.

Es necesario enfatizar las limitaciones e inconvenientes importantes de nuestro método. En primer lugar, para garantizar que los pulmones se perfundan con la temperatura real deseada, esta última debe controlarse en la cánula de entrada aplicando firmemente el sensor de temperatura. En segundo lugar, es obligatorio que los cambios de temperatura se obtengan en períodos de tiempo muy cortos, lo que requiere el uso de un baño de agua termal de respuesta rápida para calentar y la adición de hielo al baño de agua para un enfriamiento rápido. En tercer lugar, la respuesta fisiológica al estrés por calor puede diferir según la especie utilizada y depende en gran medida del nivel y la duración del estrés. Por lo tanto, es obligatorio realizar experimentos piloto utilizando varias temperaturas de calentamiento durante varias duraciones en caso de que este protocolo se aplique a diferentes especies animales o pulmones humanos y evaluar criterios de valoración específicos relacionados tanto con los efectos protectores como con los posibles efectos perjudiciales del estrés térmico aplicado. En cuarto lugar, debido a la expresión cinética de los genes sensibles al calor, los efectos del preacondicionamiento térmico dependen del tiempo de recuperación después de la aplicación de estrés térmico. Se requieren experimentos que utilicen diferentes duraciones posteriores al estrés térmico (es decir, con diferentes duraciones de EVLP) para evaluar dichos efectos dependientes del tiempo de la aplicación de calor, como se muestra en nuestra reciente publicación sobre este tema30.

En conjunto, nuestro estudio actual establece un protocolo EVLP detallado y reproducible en ratas que incorpora el preacondicionamiento térmico como una estrategia viable para mejorar la calidad pulmonar marginal del donante. El protocolo es escalable y adaptable a sistemas EVLP animales o humanos más grandes, lo que refuerza su relevancia traslacional. Al proporcionar rigor metodológico y fidelidad fisiológica, este modelo abre nuevas vías para explorar intervenciones no farmacológicas destinadas a reducir la lesión por isquemia-reperfusión y mejorar los resultados del injerto pulmonar después del trasplante.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Con el apoyo de una subvención de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (Nº 310030_212252) a TK y LL).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipo general
Clip de aneurisma yB. BraunFE762K
Sensor térmico de esferas de aire/superficieTES Electrical Electronic Corp/Distrelec AGTP01/176-67-162
Separadores romosHerramientas Científicas Fines18200-09
Bulldog SerafinesHerramienta de Ciencia Fina18051-50
Compresas de la Mirada Promedical25404
Kit de conexión para anestesiaHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3076
Hisopos de algodónAplausos SA6001109
Tijeras DiseccionadorasB. Braun & nbsp;BC165R
Mascarilla facial para rataTem SegaPFM0006
Heparina 5000 U/mLB. Braun3522430
Cámara de inducción para anestesiaHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard50-0116
Pinzas de disección de iris completamente curvadasEsculap  OC022R
IsofluranProvet AG2222
Vapor de isofluran 19,3Rothacher médicoCV30-310 O2/Air
Cartucho iSTAT4AG de laboratorio Axon03P85-25
Ketasol 100 (100 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN01AX03
Lister tijeras B. BraunBC876R
Microtijeras, Romo Curvado/RomoEsculap FM011R
Pinzas Micro-AdsonHerramienta de Ciencia Fina11018-12
Hemostats micromosquitosHerramienta de Ciencia Fina13011-12
Microscopio OPMI MDUZeiss267067
NaCl 0,9 % B. Braun534534
Aguja 23 G x 25 mmBD Microlance 4300800
Aguja 25 G x 25 mmBD Microlance 3300400
Perfadex (solución de preservación)Perfusión AB de Xvivo19811
Jeringuilla de perfusión 60 ml luer lockBD plastik300865
RasorEsculap GT-421
EscalaMettler ToledoPB602-L
Sutura de seda 4-0B. BraunF1134035
Sutura de seda 5-0B. BraunF1134027
Steen (solución de perfusión)Perfusión AB de Xvivo19004
Guantes quirúrgicosAnsell93-843
Jeringuilla 1 mL, Omnifix-FB. Braun9161406V
CintaLeukofix02136-00
TermómetroTES Electrical Electronic Corp1303
Tubos que contienen Formol Biosystems Suiza AG87-0960-00-10113
Ventilador (EVLP) (Ajuste el volumen de marea según el protocolo EVLP)FlexiventFX3
Ventilador (extracción pulmonar) & nbsp; (Establece el volumen de marea como: 7,69*(peso corporal (kg))^1,04)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard683
Separador WEITLANERB. BraunBV073R
Xilasol (1 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN05CM92
Yasargil applierB. BraunFE502T
IPL-2 fuerte
Adaptador para presión positivaHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3635
AME 14- Tubo de bomba SC0062 (tygon) con collar de 3 paros, paquete de 12Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0126
AME 24 - Tubo de bomba SC0072 (tygon) con collar de 3 stops, paquete de 12Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0155
Unidad básica para el pulmón perfundido aislado tamaño 2 (IPL-2) tipo 829/2Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-2266
Kit de conexión para oxigenador de fibra D150Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3765
Módulo de Equilibrio de Edema (EBM) con sensorHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-4626
Oxigenador de fibra tipo D150, paquete de 5Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3762
Soporte para clampaje de cánula aórtica o traqueal para tablas OP tamaño 5Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3855
Soporte para oxigenadoresHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3061
Sistema de Medición de Peso HSEHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-4604
Software básico de adquisición de datos HSE-BDAS para windows 2000, XP, windows 7Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-1712
Hardware de adquisición de datos HSE-USB, caja USB independiente para Windows 10 o 11Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3330
ISM 827/230 V bomba de rodillos reglo analógica, 4 canales, 0,003-35 ml/min (2 x)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0114
Cánula de la aurícula izquierda (DD 4,0 mm)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0712
Electrodo de ogénito de flujo directo con conexiones de 1/16" (opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-4189
Kit de montaje para oxigenador de fibra tipo D150 en soportesHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3759
Grifo de registro unidireccional tipo 9500 (uno para PA, otro para LA)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0097
OPPM plugsys módulo de presión parcial de oxígeno tipo 697  (Opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0210
Tipo de caja básica del sistema Plugsys 603Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0045
pO2 solución cero 20 paquetes de 20 ml  (Opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3812
Transductor de presión tipo P75 379/HSE, rango -75 a + 75 mm Hg (PA, LA)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0020
Cánula de la arteria pulmonar (DO 2,0 mm, diámetro de la cabeza, 2,5 mm)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0711
Depósito (con camisa) para solución tampónHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3496
Controlador servo SCP plugsys para perfusión tipo 704Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-2806
Carcasa de blindaje para un sensor pO2 o pCO2 mini sensor   (Opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-4196
Placa de montaje pequeña para un sensor O2 o CO2 sensor   (Opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3000
Módulo amplificador de transductor TAM-A plugsys tipo 705/1 (uno para PA, otro para LA)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0065
Circulador termostático E 103 (3 L)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0125
Grifo de registro de tres vías tipo 9560 R (uno para PA, otro para LA)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0096
Juego de tubos para depósito de amortiguador con gatos con válvulas de cierre de línea de fluidoHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3456
Cánula de ventilación (traqueica) diámetro diâmetro 2,0 mm, larg 14 mmHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3384
Softwares informáticos
Software básico de adquisición de datos HSE-BDAS para windows 2000, XP, windows 7Hugo Sachs Elektronik - Aparato de HarvardV2.0
ExcelMicrosoft2502, Microsoft 365
FlexiwareScireq8
GraphPad PrismGraphPad Software inc.10.0.1
Ratas Sprague-Dawley...Laboratorios Charles River (Saint-Germain-Nuelles, Francia) y nbsp;

Referencias

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