Artículo de método

Detección de alteraciones dirigidas en el cáncer de pulmón de células no pequeñas mediante secuenciación de próxima generación

DOI:

10.3791/69091

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10 de octubre de 2025

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1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un flujo de trabajo de secuenciación de próxima generación automatizado y acreditado por ISO15189 para detectar alteraciones genómicas dirigidas en tejidos incluidos en parafina fijados en formol de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El éxito de la terapia dirigida en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) depende de la identificación precisa de las alteraciones impulsoras, incluidas las mutaciones, las fusiones de genes y las amplificaciones. La secuenciación de próxima generación (NGS) se ha convertido en una herramienta integral de diagnóstico molecular, capaz de detectar aberraciones genómicas conocidas y novedosas, proporcionando un apoyo fundamental para el tratamiento personalizado del NSCLC. Sin embargo, NGS sigue siendo un método complejo y técnicamente desafiante. A pesar de su adopción generalizada, NGS aún enfrenta algunos desafíos, incluida la complejidad técnica y los tiempos de respuesta prolongados. Aquí se presenta el flujo de trabajo de NGS con certificación ISO15189 implementado en el laboratorio clínico. El protocolo estandarizado abarcó la evaluación de la celularidad tumoral (≥20 %), la extracción de ADN de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) (entrada de ADN ≥ 50 ng), la preparación automatizada de bibliotecas y el análisis bioinformático. Al integrar estrictas medidas de control de calidad (QC) en cada paso, el flujo de trabajo garantiza una alta confiabilidad de los datos. Además, la innovación clave en el flujo de trabajo fue la automatización de la construcción de bibliotecas NGS. El sistema automatizado de construcción de bibliotecas NGS incluyó reparación final, cola A, ligadura de adaptadores, captura de hibridación y purificación, minimizando efectivamente el error humano, mejorando la reproducibilidad experimental, reduciendo el tiempo de manipulación y, por lo tanto, mejorando la eficiencia. En conjunto, la experiencia demuestra que el control de calidad riguroso y la preparación automatizada de la biblioteca son esenciales para mantener la precisión y la escalabilidad en las pruebas clínicas de NGS. Este enfoque optimizado no solo garantiza el cumplimiento de los estándares ISO15189, sino que también respalda la creciente demanda de oncología de precisión en el tratamiento del NSCLC.

Introducción

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El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNM) representa el 75%-85% de todos los casos de cáncer de pulmón, lo que representa tanto una prioridad clínica como un desafío terapéutico 1,2,3. En los últimos años, con el desarrollo exitoso y la aplicación clínica de fármacos dirigidos molecularmente, como los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR-TKI), el tratamiento del CPNM avanzado ha entrado en la era de las terapias de precisión personalizadas 4,5,6. La terapia dirigida ofrece una eficacia precisa, alta especificidad y efectos secundarios mínimos 7,8. Este cambio en el tratamiento ha aumentado simultáneamente la demanda de tecnologías de diagnóstico molecular.

Actualmente, las pruebas integrales dirigidas a tumores se han convertido en un componente indispensable de la práctica clínica que puede ayudar a dilucidar perfiles precisos de mutaciones genéticas y, por lo tanto, proporciona una base confiable para el uso posterior de medicamentos dirigidos, el monitoreo de la resistencia a los medicamentos y la evaluación del pronóstico de los pacientes. En particular, las pruebas multigénicas basadas en NGS, que aprovechan las ventajas técnicas de alto rendimiento y alta sensibilidad, ya se han recomendado para aplicaciones clínicas 9,10,11,12.

En comparación con las técnicas tradicionales de diagnóstico molecular, la NGS demuestra ventajas innovadoras. La principal ventaja de NGS radica en su capacidad de alto rendimiento. Permite la detección simultánea de múltiples genes, incluidas alteraciones genéticas conocidas y desconocidas13,14. Mientras tanto, NGS logra pruebas exhaustivas en una sola ejecución, lo que reduce relativamente el costo, el consumo de muestras y el tiempo de respuesta de las pruebas15,16. Dadas estas ventajas, la NGS se ha aplicado cada vez más en la práctica clínica. Sin embargo, los procesos de NGS son complejos, incluida la evaluación de la celularidad tumoral, la extracción de ácidos nucleicos, la preparación automatizada de bibliotecas y el análisis bioinformático. La calidad del procesamiento inicial de la muestra afecta directamente el rendimiento de los análisis bioinformáticos posteriores17. Especialmente, la preparación de bibliotecas implica una serie de pasos para convertir muestras de ácidos nucleicos en bruto en bibliotecas estandarizadas compatibles con instrumentos de secuenciación. La preparación de la biblioteca incluye fragmentación, reparación final, ligadura con adaptador y amplificación por PCR18. Este complejo proceso a menudo introduce varios sesgos técnicos: por ejemplo, la fragmentación puede conducir a la subrepresentación de las regiones de heterocromatina; la preferencia por el sustrato de la ligasa durante la ligadura con adaptador puede resultar en la pérdida de ciertas secuencias; y la amplificación por PCR tiende a causar una cobertura desigual en regiones con contenido extremo de GC19. Estos sesgos sistémicos no solo reducen la calidad de los datos de secuenciación, sino que también pueden llevar a conclusiones erróneas en análisis bioinformáticos posteriores. Por lo tanto, establecer un sistema de control de calidad riguroso es esencial para garantizar la confiabilidad y consistencia de los resultados experimentales.

Para abordar estos desafíos técnicos de larga data, el laboratorio ha adoptado un sistema NGS totalmente automatizado. El sistema está diseñado para reducir el tiempo de procesamiento manual y disminuir los períodos de respuesta generales. Incorpora protocolos programables para garantizar tanto la flexibilidad operativa como la precisión del procesamiento, al tiempo que utiliza módulos y unidades integrados para minimizar eficazmente los posibles sesgos técnicos en cada paso. Además, esta solución automatizada no solo mejora la reproducibilidad y el rendimiento de la preparación de la biblioteca, sino que, lo que es más importante, garantiza que los datos de secuenciación reflejen con mayor precisión la composición molecular de las muestras originales. Aquí, el laboratorio desea introducir el sistema a través de la detección de alteraciones del conductor mediante NGS basado en ADN.

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Protocolo

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El protocolo recibió una exención del IRB para muestras de archivo anónimas.

1. Pasos previos a la prueba y control de calidad

  1. Registre la información de la muestra en el sistema de gestión de información de laboratorio (Tabla 1). Complete el formulario de consentimiento informado para las pruebas de mutaciones genéticas.
  2. Reciba una muestra de FFPE de NSCLC. Asegúrese de que la muestra utilizada para la prueba sea una muestra de tejido de parafina que se haya almacenado durante no más de 2 años. Asegúrese de que las muestras se procesen y almacenen de acuerdo con los métodos patológicos estándar.
    NOTA: Este estudio se centra principalmente en el flujo de trabajo metodológico, en lugar de realizar un análisis clínico a gran escala. Por lo tanto, no se estableció ningún requisito específico de número de muestra para esta fase de la investigación.
  3. Corte secciones con cuchillas de micrótomo desechables. Cambie las cuchillas, las pinzas y los microtubos de 1,5 ml entre muestras para evitar la contaminación cruzada y evitar la introducción de contaminantes derivados del operador (por ejemplo, cabello, células de la piel, saliva).
    NOTA: Tamaño de muestra grande (≥ 0,5 cm x 0,5 cm) 6-10 μL, cinco hojas; tamaño de muestra pequeño (< 0,5 cm x 0,5 cm) y muestras de punción, 6-10 μL, 10 hojas.
  4. Realizar tinciones rutinarias de hematoxilina-eosina (HE) para evaluar el contenido de células tumorales.
  5. Seleccione muestras que contengan ≥20% de células tumorales malignas para el análisis posterior. El contenido tumoral es evaluado por patólogos en portaobjetos de vidrieras de HE20.
    NOTA: Si el contenido tumoral es inferior al 20%, bajo la guía de las regiones tumorales marcadas en el portaobjetos HE, raspe el área de tejido tumoral correspondiente. Este proceso logra el enriquecimiento del tejido tumoral al eliminar eficazmente los componentes no neoplásicos circundantes, lo que aumenta significativamente el porcentaje de células tumorales en el material recolectado.
  6. Realice la extracción de ácidos nucleicos utilizando un sistema de purificación automatizado como se describe a continuación.
    1. Seccione el bloque FFPE con un micrótomo para obtener una cinta. Coloque la cinta en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Transfiera la cinta a la ubicación de entrada de muestra designada en el instrumento de extracción automatizado.
    2. Utilice un instrumento de extracción automática con un kit de extracción automática y sustituya el pipeteo manual por un sistema automático de extracción de ácido nucleico con perlas magnéticas.
      NOTA: La automatización de este paso ayuda a garantizar la extracción automática para garantizar una producción de ADN reproducible y de alta precisión para aplicaciones NGS posteriores.
    3. Consulte las instrucciones del purificador de ácido nucleico completamente automático y el reactivo de extracción de ácido nucleico para extraer ácido nucleico.
    4. A continuación, seleccione el programa C1102, elija el tiempo de incubación del desparafinado de la muestra como 16 h y el volumen de elución como 100 μl.
      NOTA: Si la solución de ADN extraída no se analiza inmediatamente, debe almacenarse a -20 °C durante no más de 6 meses.
  7. Evalúe la calidad de los ácidos nucleicos (Tabla 2) como se describe a continuación.
    1. Use electroforesis en gel de agarosa para determinar el tamaño del fragmento de ADN. Utilice Agilent2100 y otros sistemas de análisis de electroforesis capilar microfluídica para muestras de bajo insumo.
    2. Disuelva 1 g de agarosa en 100 ml de solución de TAE. Calentar la mezcla al baño maría hasta que esté transparente. Enfriar la solución a unos 60 °C.
    3. Conéctelo al electrodo positivo (rojo) del instrumento de electroforesis. Realice el polo negativo (negro) a voltaje 180 V, funcione durante 15 min21,22.
    4. De acuerdo con los resultados de la electroforesis en gel de agarosa, clasifique los tamaños de los fragmentos en cuatro niveles (A-D; Tabla 3), y seleccionar el ácido nucleico de los niveles A-C para operaciones posteriores.
    5. Utilice espectrofotometría para verificar la pureza. Asegúrese de que OD260/OD280 > 1.8; OD260 / OD230 > 2.0 para indicar niveles aceptables de contaminantes23,24.
    6. Utilice un kit de detección (tabla de materiales) basado en colorantes fluorescentes específicos de secuencia para el ensayo fluorométrico para medir con precisión la concentración de ADN.
    7. Agregue 1 μL de ADN a analizar a 199 μL de solución de trabajo, luego mezcle, centrifugue brevemente y mida su concentración con un fluorómetro (Tabla de materiales).

2. Preparación de la biblioteca y control de calidad (Figura 1)

  1. Preparar el ADN genómico de los fragmentos mediante ultrasonidos (tabla de materiales) como se describe a continuación.
    1. Mezcle 200 ng de ADN genómico en 50 μL de tampón con bajo contenido de Tris-EDTA (TE). A continuación, mantenga el tubo de muestra en una gradilla de muestras preenfriada (8 °C).
    2. Ajuste el parámetro del instrumento de acuerdo con la Tabla 4. Luego inicie la fragmentación.
    3. Utilice electroforesis en gel de agarosa para verificar el efecto de fragmentación. Este paso genera fragmentos de ADN con extremos dañados que requieren reparación final para transformarlos en extremos romos para los pasos posteriores.
  2. Realice la reparación final y la adición de A a 3' como se describe a continuación.
    1. Repare los extremos dañados del ADN FFPE con enzimas para formar extremos planos, asegurando 3'-OH y 5'-P. Agregue A a los extremos aplanados de doble hebra de 3 '.
    2. Prepare la mezcla ERA añadiendo 7 μl de tampón de reparación final y 3 μl de enzima de reparación final, mueva suavemente manualmente 3x-5x y centrifugue durante 1-3 s.
    3. Agregue la mezcla ERA a 50 μL de muestra de ADN roto, mezcle suavemente y centrifugue durante 1-3 s.
    4. Colóquelo en el instrumento de PCR y seleccione el programa ERA (20 °C durante 30 min; 65 °C durante 30 min; 4 °C Hold; tapa 85 °C). Realice la siguiente operación en 2 h.
  3. Realice la ligadura del adaptador como se describe a continuación.
    1. Prepare la mezcla LIG del sistema de reacción agregando 30 μL de tampón de ligadura, 10 μL de ADN ligasa y 10 μL de adaptador de ADN. Luego, mueva ligeramente manualmente 3x-5x y centrifugue durante 1-3 s.
    2. Agregue 50 μL de mezcla LIG al producto de 60 μL del paso anterior, mezcle suavemente y luego centrifugue durante 1-3 s.
    3. Coloque la mezcla en un instrumento de PCR, luego seleccione el programa LIG (20 °C durante 15 min sin calentar la tapa; 70 °C durante 10 min (tapa calefactora); 4 °C Mantener; tapa 85 °C).
  4. Realice la purificación de perlas magnéticas.
    1. Tome 1,5 ml de un tubo de centrífuga de baja adsorción y agregue 88 μl de perlas magnéticas homogeneizadas y 110 μl de producto ligado con adaptador. Agite y mezcle bien, e incube a temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Centrifugue inmediatamente la muestra incubada durante 1-3 s y coloque el tubo de centrífuga en una gradilla magnética. Espere a que la solución se aclare (aproximadamente 3-5 min).
    3. Con el tubo asegurado en el imán, abra la tapa y aspire cuidadosamente el sobrenadante aclarado con una pipeta sin alterar el gránulo de perlas.
    4. Mantenga el tubo en el imán y agregue 300 μL de etanol al 75% recién preparado a cada tubo.
    5. Espere 1 minuto para permitir que las perlas magnéticas se asienten por completo. Gire lentamente el tubo de centrífuga horizontalmente una vez para absorber el etanol.
    6. Repita los pasos 2.4.4 y 2.4.5 una vez, para un total de 2x.
    7. Realice una centrifugación instantánea durante 1-3 s, devuelva el tubo a la gradilla magnética y espere 30 s. Utilice una pipeta para eliminar el etanol residual y mantenga abierta la tapa del tubo.
    8. Seque las perlas magnéticas a temperatura ambiente durante 2 minutos hasta que la superficie de la perla parezca mate y no muestre grietas.
    9. Eluya el producto de ligadura con 28 μL de tampón de elución (EB).
      NOTA: Las perlas magnéticas deben equilibrarse a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de su uso.
  5. Amplíe y purifique la prebiblioteca como se describe a continuación.
    1. Prepare la premezcla del sistema de reacción agregando 10 μL de tampón de PCR, 10 μL de cebadores de PCR, 1,5 μL de mezcla de dNTP, 1 μL de enzima de PCR. Golpee suavemente manualmente 3x-5x y centrifugue durante 1-3 s.
    2. Agregue 22,5 μL de premezcla a 27,5 μL del producto purificado del paso anterior, mezcle suavemente y luego centrifugue durante 1-3 s.
    3. Seleccione el programa PRE: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 ciclos; 72 °C 2 min; Retención de 4 °C; Tapa 105 °C.
    4. Una vez completado el programa de PCR, realice la purificación de perlas magnéticas con etanol al 75% recién preparado. Eluya el producto con 18 μL de EB.
  6. Capture híbrido como se describe a continuación.
    1. Prepare el sistema de reacción A agregando 15 μL de pre-biblioteca y 4 μL de mezcla de bloqueador.
    2. Coloque en PCR y ejecute el programa de PCR HYB (95 °C durante 5 min; 65 °C Mantener; Tapa 105 °C).
    3. Prepare la mezcla de HYB del sistema de reacción B agregando 10 μL de tampón de hibridación, 0,5 μL de bloqueador de inhibidores de ARNasa y 1 μL de sonda. Mueva suavemente 3x-5x y centrifugue durante 1-3 s.
      NOTA: El nombre de la sonda es LCOO1 y los genes de la sonda incluyen EGFR, KRAS, BRAF, ALK, etc.
    4. Cuando la temperatura del instrumento de PCR descienda a 65 °C, agregue 11,5 μL de mezcla HYB al sistema de reacción A, mezcle suavemente, luego cubra la tapa del instrumento de PCR y continúe la incubación durante 16-24 h.
    5. Incube el tampón de lavado 2 en un tubo cónico de 15 ml con un calentador metálico a 65 °C a una dosis de 600 μl por muestra.
    6. Recupere las perlas magnéticas SCB, invierta y mezcle 5x, haga vórtices durante 10 s y equilibre a temperatura ambiente durante 30 min. Agite durante 10 s, transfiera 25 μL a un tubo de centrífuga de baja adsorción de 1,5 ml, colóquelo en una gradilla magnética durante 3 min y deseche el sobrenadante.
    7. Agregue 200 μL de tampón de lavado de perlas a las perlas magnéticas SCB de 25 μL, mezcle en vórtice y mezcle durante 3 s, centrifugue momentáneamente durante 1-3 s, deje reposar en la rejilla magnética durante 3 min y deseche el sobrenadante.
    8. Repita el paso 2.6.7 2 veces, para un total de tres veces.
    9. Agregue 200 μL de tampón de lavado de perlas a las perlas magnéticas, vórtice y mezcle durante 3 s, vuelva a suspender para su uso posterior.
    10. Transfiera aproximadamente 30 μL de la muestra híbrida a perlas magnéticas SCB resuspendidas, vórtice y mezcle, colóquelas en un mezclador giratorio, incube a temperatura ambiente durante 30 min y centrifugue durante 1-3 s.
    11. Coloque el tubo de mezcla en una rejilla magnética durante 3 min, luego aspire aproximadamente 230 μL de sobrenadante. Agregue 500 μL de tampón de lavado 1, vórtice durante 5 s, colóquelo en un mezclador rotativo e incube a temperatura ambiente durante 15 min. Centrífuga instantánea durante 1-3 s.
    12. Coloque el tubo de mezcla de muestras de perlas magnéticas en una gradilla magnética y déjelo reposar durante 3 minutos. Luego, aspire aproximadamente 500 μL de sobrenadante y líquido residual.
    13. Precalentar 150 μL de tampón de lavado 2 a 65 °C, vórtice durante 10 s, colocar en un mezclador a temperatura constante, agitar e incubar a 65 °C durante 10 min a una velocidad de 600 rpm. Realice una centrifugación instantánea durante 1-3 s, colóquela en una rejilla magnética durante 3 min y aspire aproximadamente 150 μL de sobrenadante y líquido residual.
    14. Repita el paso 2.6.13 3 veces, para un total de cuatro veces.
    15. Centrifugar instantáneamente durante 1-3 s para eliminar cualquier líquido residual del tubo de muestra. Agregue 20 μL de EB, mezcle hacia arriba y hacia abajo 8x-10x, mezcle bien y colóquelo en hielo para su uso posterior.
  7. Preparación y purificación de la biblioteca final.
    1. Prepare la mezcla POST del sistema de reacción agregando 25 μL de mezcla de amplificación, 5 μL de índice y 20 μL de biblioteca de perlas magnéticas. Golpee suavemente 3x-5x y centrifugue durante 1-3 s. Mezclar suavemente, centrifugar durante 1-3 s.
    2. Elija el programa POST: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 ciclos; 72 °C 10 min; Retención de 4 °C; Tapa 105 °C.
    3. Una vez completado el programa de PCR, realice la purificación de perlas magnéticas con etanol al 75% recién preparado. Eluya la biblioteca final con 20 μL de EB.

3. Preparación de bibliotecas totalmente automatizada (Tabla 5)

  1. Presione el botón de encendido para activar el sistema y espere la inicialización. Vaya a Configuración del programa y seleccione Ejecutar protocolo, luego seleccione Protocolo: Burning Rock HS.
  2. Establezca los parámetros de control de calidad alícuotas como Tipo de muestra: ADN de alta calidad; Cantidad de entrada (ng): 50; Ciclos de pre PCR: 12; Ciclos posteriores a la PCR: 12. Haga clic en EJECUTAR.
  3. Inserte el cartucho de reactivo preempaquetado en la ranura designada (valida automáticamente la ubicación y el estado del reactivo).
  4. Después de cargar las muestras, presione Inicio para que el sistema funcione de forma autónoma. Observe los indicadores LED para monitorear el progreso.
  5. Una vez finalizado el programa, haga clic en Aceptar y el programa transferirá automáticamente la biblioteca final al tubo de la biblioteca, finalizando la preparación de la biblioteca.

4. Secuenciación y control de calidad

  1. Realice la cuantificación de la biblioteca y el control de calidad como se describe a continuación.
    1. Mida la concentración previa a la biblioteca y a la biblioteca total mediante fluorometría.
    2. Detecte el tamaño del fragmento de la biblioteca. Utilice un kit para evaluar el tamaño del fragmento de la biblioteca y la presencia de adaptadores (Tabla de materiales).
      NOTA: Si la biblioteca final contiene dímeros de cebador, se debe agregar un paso de purificación adicional antes de mezclar las muestras en la máquina. El estándar calificado para insertar fragmentos es ≥ 150 pb y la eficiencia de captura esperada es ≥ 40 %.
    3. Diluya la biblioteca de secuenciación a 1,6 pM y 1300 μL para las operaciones de secuenciación.
  2. Lleve a cabo el monitoreo del entorno de secuenciación como se describe a continuación.
    1. Controle el entorno de secuenciación, incluida la temperatura interior (19-25 °C), la humedad interior (20%-80%).
    2. Control de calidad completo de los datos de salida del instrumento, incluida la base por encima de Q30 y el filtro de paso de densidad del clúster (PF).

5. Análisis de datos de secuenciación y control de calidad

  1. Realice el procesamiento de datos sin procesar y el perfil molecular como se describe a continuación.
    1. Utilice el alineador Burrows-Wheeler (versión 0.7.10) para alinear los datos de secuenciación con hg19.
    2. Realice alineación local, optimización, marcado de duplicación y llamadas de variantes utilizando Genome Analysis Tool Kit (versión 3.2) y Vardict (versión 1.5.1).
    3. Filtre variantes mediante la canalización VarScan (versión 2.4.3) fpfilter y elimine loci con profundidades inferiores a 50. Clasifique y excluya variantes con una frecuencia poblacional superior al 0,1% en las bases de datos ExAC, 1000 Genomas, dbSNP o ESP6500SI-V2 como polimorfismos de nucleótido único (SNP).
    4. Anote las variantes restantes usando SnpEff (versión 3.6).
    5. Analice variantes estructurales (SV), incluidos grandes reordenamientos genómicos (LGR), utilizando MarkSV (herramienta de algoritmo Burning Rock). Analice las variantes del número de copias (CNV) en función de los datos de profundidad de cobertura de los intervalos de captura.
    6. Datos de cobertura correctos para sesgos de secuenciación resultantes del contenido de guanina-citosina y el diseño de la sonda.
  2. Evalúe la calidad de la muestra, incluida la profundidad media, la profundidad mediana, la profundidad única, el tamaño de la inserción, la complejidad de la biblioteca, la cobertura, la relación Q30 y la relación de correlación de la muestra emparejada como se describe en25.
  3. Para la generación de informes, verifique la versión y los parámetros de la canalización para completar la revisión bioinformática. Utilizar las guías pertinentes para evaluar la patogenicidad de las mutaciones26,27. Emitir informe final.

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Resultados

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Utilizando un flujo de trabajo de análisis NGS automatizado con estrictos controles de calidad, el laboratorio realizó un perfil genómico completo de las muestras de NSCLC. El flujo de trabajo de detección optimizado (Figura 2) identificó de manera confiable varias alteraciones genómicas clínicamente procesables en muestras tumorales representativas (Figura 3).

Los resultados de la secuenciación demos...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cada informe calificado de NGS se encuentra detrás de un proceso riguroso, que sigue siendo complejo y requiere mucho tiempo28. Para abordar estos problemas, el laboratorio desarrolló un sistema NGS totalmente automatizado. Esta operación reduce significativamente la intervención manual, minimiza los errores experimentales y acorta sustancialmente el tiempo de respuesta. Por lo tanto, este sistema ha proporcionado una estrategia más confiable y eficiente para NGS,...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue financiado por subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing de la República Popular China (7252122), la Fundación de Investigación de Oncología Clínica Beijing Xisike de la República Popular China (Y-HS202402-0021), el Fondo de Investigación Docente de Capacitación de Residencia del Hospital del Cáncer, la Academia China de Ciencias Médicas y el Colegio Médico de la Unión de Pekín (E2025004), y la Financiación Nacional de Investigación Clínica del Hospital de Alto Nivel (2025-LYZX-R-B03).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  Agilent  Kit de ADN de Alta Sensibilidad  Agilent5067-4626Para usarse con el  Sistema Bioanalizador Agilent 2100
  Kit de reactivos Agilent DNA 1000  Agilent5067-1504Para usarse con el  Sistema Bioanalizador Agilent 2100
Bioanalizador Agilent 2100AgilentG2939AEvalúa el tamaño del fragmento de la biblioteca y la presencia de adaptadores. 
Concert Instrumento de purificación totalmente automático de ácidos nucleicosCONCIERTOMC1002Utilizado para la extracción de ADN
Bit igual 1 veces; Kit de análisis HS dsDNAVazymeEQ121-02-AAPara usarse con el  Fluorómetro Qubit 3.0
Kit de detección combinada de mutaciones del gen EGRR/KRAS/BRAF/ALK en humanosBurning RockBR-LC00102Construcción de la biblioteca
Magnis BRAgilent TechnologiesG7595AAPreparación automatizada de bibliotecas NGS
Ultrasonicador enfocado ME220Covaris500396Ultrasonicación
NanoDrop One/OneCThermo FisherND-ONE-WDetección espectrofotométrica ultravioleta visible de longitud de onda completa
NextSeq 550DxIllumina20005715secuencia
NSQ 500/550 Alta Salida KT v2.5(300CYS)Illumina20024908Para su uso con el NextSeq 550Dx
Reactivo de extracción de ácidos nucleicosCONCIERTORC1102Utilizado para la extracción de ADN
Fluorómetro Qubit 3.0VidaP33216Utilizado para la detección de concentraciones de ácidos nucleicos o bibliotecas
Kit de ensayo Qubit dsDNA HSVidaP32851Para usarse con el  Fluorómetro Qubit 3.0

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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