Un método refinado de administración intratraqueal de bleomicina basado en aerosoles para modelos reproducibles y mínimamente invasivos de fibrosis pulmonar en ratones

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para modelar la fibrosis pulmonar en ratones utilizando bleomicina aerosolizada administrada a través de la tráquea. Este método optimizado permite una administración uniforme, cuantitativa y precisa sin incisión quirúrgica, mejorando la reproducibilidad y fiabilidad de la fibrosis inducida por bleomicina.

Resumen

La fibrosis pulmonar se caracteriza por la deposición progresiva de tejido cicatricial fibrótico dentro del parénquima pulmonar, lo que conduce a un intercambio gaseoso gravemente deteriorado. Está presente en un espectro de enfermedades pulmonares intersticiales crónicas, especialmente la fibrosis pulmonar idiopática, una condición asociada a un pronóstico extremadamente deficiente. Dada la falta de terapias efectivas, los modelos murinos robustos son fundamentales para esclarecer los mecanismos patológicos subyacentes y evaluar intervenciones antifibróticas novedosas. La fibrosis pulmonar inducida por bleomicina sigue siendo el modelo experimental más utilizado. Las vías comunes de administración en ratones incluyen inyecciones intravenosas e intraperitoneales, instillación intraqueal abierta invasiva y goteo traqueal no invasivo. Sin embargo, los métodos quirúrgicos invasivos suelen causar lesiones secundarias en el tejido, lo que puede comprometer la reproducibilidad y estabilidad del modelo. Por el contrario, el goteo traqueal no invasivo suele resultar en una distribución desigual de la bleomicina en los lóbulos pulmonares y supone un riesgo de asfixia, reduciendo así la reproducibilidad y aumentando los desafíos técnicos. Para abordar estas limitaciones, se desarrolla un método refinado de administración intratraqueal basado en aerosoles que es operativamente más simple, mínimamente invasivo, altamente reproducible y éticamente superior, al reducir significativamente el malestar animal. Utilizando un laringoscopio de pequeño animal para visualizar directamente la rima glottidis, se inserta una aguja aerosolizante especializada en la tráquea, notablemente más estrecha que el diámetro tráqueal del ratón. La solución de bleomicina se administra bajo presión controlada con precisión, generando un aerosol fino. Esto garantiza una distribución uniforme y eficiente del agente a lo largo del parénquima pulmonar. Además, se puede seleccionar selectivamente el pulmón izquierdo o derecho dirigiendo la aguja hacia el bronquio correspondiente. La relación dosis-respuesta de este modelo optimizado se caracteriza extensamente por el seguimiento sistemático de cambios en la función pulmonar, manifestaciones histopatológicas y contenido de hidroxiprolina pulmonar. Se prevé que este protocolo experimental refinado facilite la estandarización en laboratorio, acelerando en última instancia el desarrollo y la validación preclínica de nuevas terapias antifibróticas.

Introducción

La fibrosis pulmonar (PF) es un grupo de enfermedades letales caracterizadas por daño progresivo al parénquim pulmonar y reparación anormal, de las cuales la fibrosis pulmonar idiopática (FI) representa entre el 30% y el 40%, siendo la edad mediana de diagnóstico de los pacientes de 65 años, y más del 80% de ellos mayores de 60^{años. 2}. A medida que el envejecimiento global se intensifica, la incidencia de IPF aumenta año tras año, con una incidencia mundial de 3-9/100.000/año, y según un estudio en Estados Unidos en personas mayores de 65 años, la incidencia en esta población aumentó a 93,7/100.000/año ^3,4.

El primer modelo históricamente desarrollado de fibrosis pulmonar fue el modelo inducido por bleomicina, que se utiliza frecuentemente en el ámbito académico, con la mejor caracterización y el modelo animal más utilizado actualmente⁵, recapitulando muchas de las características de la IPF y otras ILD fibróticas, incluyendo inflamación pulmonar, lesión epitelial, proliferación de fibroblastos y deposición excesiva de matriz extracelular^{(ECM) 6}. Además, tanto la fibrosis pulmonar aguda como crónica pueden modelarse dependiendo de la dosis y la frecuencia de administración de bleomicina. Se ha informado que los pulmones entran en una fase inflamatoria aguda entre 5 y 7 días tras la exposición a la bleomicina, seguida de una fase fibrótica que comienza alrededor del día 7. Al día 21, se observa típicamente un remodelado fibrótico pronunciado, lo que permite al modelo recapitular tanto la respuesta inflamatoria temprana como la patología fibrótica en fase avanzada de manera temporalmente^{definida 7} (Figura 1A). Esto permite estudiar todo el proceso de la enfermedad desde la lesión inicial hasta la etapa fibrótica, lo cual es muy importante para el desarrollo de fármacos y los estudios de mecanismos en todas las^{fases 8,9}.

Las rutas de modelado de la bleomicina son diversas y pueden administrarse local o sistémicamente, incluyendo rutas endotraqueicas, nasales, intravenosas e intraperitoneales. La más utilizada es la inyección endotraqueal. La desventaja es que crea incisiones en los ratones, lo que afecta a la tasa de supervivencia de los ratones^{modelados 10}. Posteriormente se realizaron mejoras para permitir el uso de una aguja permanente para la intubación traqueal e inyección por goteo en^{ratones 11}. Sin embargo, el fármaco administrado por la jeringuilla solo puede distribuirse en los pulmones como un bloqueo, lo que puede provocar una distribución desigual de la bleomicina en cada lóbulo pulmonar, produciendo sobredensidad local y afectando la estabilidad del modelo murino. Además, se han utilizado cartuchos nebulizadores de cámara para la administración de bleomicina, pero la cantidad de aerosol inhalado en cada ratón no puede cuantificarse con precisión, y el tiempo de inducción único es^{largo, 12}. Por ello, se desarrolla un método refinado de administración intratraqueal de bleomicina basado en aerosoles para modelos reproducibles y mínimamente invasivos de fibrosis pulmonar. La bleomicina se aerosoliza, permitiendo una dispersión y depósito uniformes en los pulmones, lo que permite una mejor recapitulación de la patología de la enfermedad pulmonar. Se espera que la aparición de este método acelere la investigación de fármacos que puedan curar completamente la fibrosis pulmonar.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo bajo directrices institucionales aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC). Se implementaron medidas adecuadas de bienestar animal durante todo el experimento. Se seleccionaron machos C57BL/6 ratones de entre 6 y 8 semanas, que pesaban aproximadamente 25 g, para el experimento. La Tabla de Materiales enumera todos los animales, reactivos y equipos utilizados en este estudio y sus fuentes comerciales.

1. Selección y aclimatación animal

1. Aloja a todos los ratones bajo condiciones específicas libres de patógenos, con un ciclo de 12 horas luz/oscuridad y acceso improvisado a comida y agua.
2. Aclimata a los ratones a la instalación durante 5-7 días antes de iniciar el modelo basado en aerosoles.

2. Preparación de la solución de bleomicina

PRECAUCIÓN: La bleomicina es un agente antitumoral citotóxico. Realiza todos los pasos en un armario de bioseguridad certificado usando el EPI adecuado.

1. Usando una jeringuilla estéril de 1 mL, extrae 3 mL de cloruro sódico estéril al 0,9% e inyectarlo en un vial que contenga 15 U de clorhidrato de bleomicina.
2. Gira suavemente el vial hasta que el polvo esté completamente disuelto para obtener una solución de fondo de 5 U/mL.
3. Alicuota la solución original en tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 mL. Prepara soluciones de trabajo de 3,75 U/mL y 2,5 U/mL diluyéndolas con solución salina estéril.
   NOTA: Para un ratón de 25 g, estas concentraciones corresponden a dosis de 7,5 U/kg y 5 U/kg, respectivamente. Ajusta las concentraciones si el peso del ratón varía.
4. Almacena las soluciones funcionales a 4 °C durante hasta 1 semana o a -80 °C durante hasta 1 mes. Descongela y lleva a temperatura ambiente antes de usarla.

3. Administración intratraqueal de bleomicina basada en aerosoles

1. Preparación y administración de anestesia
   1. Prepara la solución anestésica disolviendo 0,1 g de polvo pentobarbital sódico en 10 mL de solución fisiológica estéril. Filtra usando un filtro de membrana PES de 0,22 μm. Guarda la solución a 4 °C en un entorno protegido de la luz y úsalo en un plazo de 3 días tras la preparación.
   2. Administrar solución de pentobarbital sódico mediante inyección intraperitoneal usando una jeringuilla de 1 mL con una aguja de calibre 26 a una dosis de 60 mg/kg de peso corporal. Si la profundidad o duración de la anestesia es insuficiente, ajusta la dosis según la respuesta del animal bajo la supervisión del veterinario que lo acompaña.
   3. Evalúa la profundidad de la anestesia varios minutos después de la inyección pellizcando firmemente el dedo del pie y confirmando la ausencia de reflejo de retirada antes de proceder con los procedimientos posteriores.
2. Preparación de aparatos de entrega de aerosoles
   1. Preparar el aparato de administración de aerosoles, asegurándose de que la aguja de nebulización, la jeringuilla de nebulización y el pilar de dosificación estén presentes y estériles (Figura 1B).
   2. Sumerge la jeringuilla de administración en aerosol en solución salina estéril. Aspira el líquido lentamente y pausa durante 8 segundos. Expulsa el líquido rápidamente. Repite esto tres veces para llenar y vaciar el sistema.
   3. Rellena la jeringuilla con solución salina tras la expulsión final. Coloca la aguja aerosolizante, asegurándote de que la unión esté llena de solución salina.
   4. Sumerge la aguja ensamblada en solución salina y repite el ciclo de aspiración-pausa-expulsión tres veces más para eliminar las burbujas de aire.
      NOTA: Para confirmar la preparación, expulsar solución salina sobre un fondo oscuro. Asegúrate de que la solución salina rápidamente expulsada forme una niebla en forma de abanico sobre un fondo oscuro.
3. Procedimiento de administración intratraqueal de aerosoles
   1. Imprima la aguja en aerosol con solución de acción de bleomicina aspirándola y expulsándola tres veces con pausas de 8 s.
   2. Inserta un pilar de dosificación de 25 μL encima del pilar de 50 μL para calibrar el volumen. Aspira el volumen requerido (50 μL). Expulsa cualquier exceso de líquido.
      NOTA: Esta configuración de dosificación garantiza una entrega consistente al minimizar el error humano.
   3. Colocar al ratón anestesiado sobre la plataforma de intubación, enganchar los incisivos superiores y cintar las extremidades para estabilizar (Figura 1C).
      NOTA: Confirma movimientos rítmicos del pecho. Si el animal parece estar activo, administra una dosis adicional de anestesia.
   4. Usa pinzas curvas para sacar la lengua suavemente. Inserta un laringoscopio de animal pequeño para exponer la glotis (Figura 1D).
   5. Inserta la aguja aerosolizante verticalmente a través de la glotis. Administra el aerosol de bleomicina rápidamente (Figura 1E).
      NOTA: Inclina la punta de la aguja hacia el pulmón deseado para una entrega dirigida. Evita insertar demasiado profundo para evitar traumatismos. La punta de la aguja del nebulizador debe posicionarse cerca pero sin tocar el punto de bifurcación (primera bifurcación) de la tráquea del ratón para lograr el mejor efecto de modelado. Si la punta se inserta solo en el centro de la tráquea, el aerosol puede impactar únicamente en la pared traqueal, formando grandes gotas que se expulsan o se tragan. Si la punta está demasiado cerca de la bifurcación traqueal, existe el riesgo de daño traqueal.

4. Recuperación tras el procedimiento

1. Coloca el ratón sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal. Observa al ratón de forma continua hasta que se recupere de la anestesia (normalmente entre 1 y 2 horas).
2. Haz un pellizco en el dedo del pie para comprobar los reflejos y confirmar que el ratón está vivo.
3. Realiza un seguimiento clínico diario durante 21 días, incluyendo peso corporal, nivel de actividad, cuidado personal y signos respiratorios.
4. Eutanasiar a los animales cuando se cumpla cualquiera de los siguientes criterios: (i) pérdida >20% de peso corporal en comparación con la línea inicial previa al tratamiento, o ≥15% de pérdida acompañada de otros signos clínicos de malestar; (ii) dificultad respiratoria severa persistente en reposo (respiración dificultosa o abdominal, taquipnea o bradicnea marcada, brote nasal o respiración abierta), con o sin cianosis de las extremidades; (iii) incapacidad para obtener comida o agua, letargo marcado o apariencia moribunda (sin respuesta al manipulo y/o pérdida del reflejo de enderezamiento); o (iv) deshidratación severa, hipotermia u otros signos de deterioro irreversible según lo determine el veterinario que lo atenda. Cuando se alcanzan estos objetivos humanos, se sacrifica a los animales con una sobredosis de pentobarbital sódico (≥150 mg/kg, i.p.), seguida de un método físico secundario (por ejemplo, luxación cervical), para asegurar la muerte y minimizar el dolor y la angustia.

5. Medición de la función pulmonar terminal y recogida de tejidos

1. En el día 21, anestesiar al ratón con 90 mg/kg de la misma solución anestesiosa para inducir anestesia profunda y suprimir la respiración.
2. Confirma la anestesia completa con pellizco en el dedo del pie. Expone la tráquea cortando la piel y separando los músculos.
3. Haz una pequeña incisión bisejada en la tráquea e inserta la aguja de intubación. Asegura con una ligadura quirúrgica.
4. Transfiere el ratón al ventilador de mecánica pulmonar de pequeños animales controlado por ordenador. Inicia la ventilación mecánica y asegúrate de no respirar de forma espontánea. Utiliza el sistema de ventilación para medir los parámetros de la función pulmonar.
5. Realizar perfusión ventricular derecha con 5-10 mL de suero fisiológico estéril hasta que los pulmones parezcan blanqueados.
6. Disecciona todo el pulmón. Fija el pulmón izquierdo en formol neutral amortiguado durante 24 horas.
7. Incrustar el tejido pulmonar fijo en parafina, seccionarlo y realizar tinción H&E, tinción tricroma de Masson y tinción inmunohistoquímica para COL1A1 y α-SMA.
8. Coloca el pulmón derecho en un tubo de homogeneización de 2 mL con perlas. Añade agua según el protocolo del kit de hidroxiprolina. Homogeneiza y procede con el ensayo.

Resultados

En este estudio, propusimos un método de administración intrabronquial basado en aerosoles para inducir fibrosis pulmonar en ratones utilizando bleomicina. En experimentos preliminares, se aerosolizó un tinte verde y se administró en los pulmones de diferentes ratones. El contraste mostró un patrón de distribución moteado a lo largo de los pulmones, lo que indica que la administración intrabronquial basada en aerosoles permitió una dispersión uniforme del agente en todos los lóbulos pulm...

Discusión

Este estudio propuso un modelo optimizado de nebulización traqueal no invasiva de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones. Se utilizó un laringoscopio de pequeño animal para localizar la glotis y se insertó una pequeña aguja de nebulización en las vías respiratorias del ratón. Se aplicó presión manualmente para nebulizar el medicamento en los pulmones, reduciendo así la incomodidad y la asfixia asociadas a la aguja de retención utilizada en la inyección^n...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 & mu; Filtro de jeringuilla de polietersulfona M	Cytosci	CSTPE3320
1 mL de jeringuilla desechable	BD	300481
Tubo microcentrífuga de 1,5 mL	Servicebio	EP-150-M
Tubo de lisis reforzado de 2,0 mL	Servicebio	HT-200-M
4 & deg; Frigorífico de laboratorio C	Meiling	BCD-402WPCX
Tubo centrífugo cónico de 50 mL	Servicebio	EP-5001-J
-80 ºC; Congelador ultra baja C	Haier Biomedical	DW-86L828J
Etanol absoluto	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092683
Solución de diferenciación ácida	Servicebio	G1039
Micropulverizador en aerosol para intubación de animales pequeños	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	Yan-30012
Conjunto básico de instrumentos quirúrgicos	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	YAN-21A3
Solución de clorhidrato de bleomicina	Hanhui Pharmaceutical Co., Ltd	H20055883
Reactivo de azulado	Servicebio	G1040
Ventilador de mecánica pulmonar de pequeños animales controlado por ordenador	EMKA Biotech Beijing Co., Ltd.	FX-2
Cinta aislante eléctrica	3M	1500
Solución de tinción con eosina Y	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4022
Tinta verde para marcar	Piloto	Chiku-rin
Solución de tinción de hematoxilina	Servicebio	G1004
Kit de ensayo de cuantificación de hidroxiprolina	Abcam	ab222941
Campana de flujo laminar	HDL	DL-CJ-1N
Laringoscopio para procedimientos en animales pequeños	Shenzhen Bilead Biology Technology CO., LTD	DXSHJ0
Microscopio óptico	Nikon	E100
Solución de dewaxing de baja toxicidad	Servicebio	G1128
Kit de tinción tricroma de Masson	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4079B
Lector de microplacas con detección de absorbancia	Agilent	Sinergia H1
Formalina amortiguada en neutro	Servicebio	G1101-3ML
Medio de montaje neutro	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Anticuerpo monoclonal recombinante de conejo anti-COL1A1	Huabio	HA722517
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5424R
Agua libre de RNasa	Generalbiol	TYJC002
Plataforma de intubación traqueal para animales pequeños	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	CG-02M
Solución estéril de cloruro de sodio al 0,9%	China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	H12020024
Homogeneizador de tejidos	Servicebio	KZ-III
Xileno	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10023418
Cuentas de molienda de circonia	Servicebio	G0203