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Artículo de método

Monitoreo en tiempo real de la dinámica inducida por acupuntura en tejido conectivo subcutáneo a través de imágenes confocales con láser in vivo

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DOI:

10.3791/69173

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10 de octubre de 2025

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, Jianghan University, 2School of Medicine, Jianghan University, 3Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio establece imágenes confocales con láser in vivo como un método en tiempo real para rastrear la dinámica morfológica inducida por la acupuntura, como la vasodilatación y la remodelación del colágeno, en ratas vivas. Utilizando el etiquetado con fluoresceína sódica, el enfoque captura las respuestas tisulares inmediatas y retardadas, ofreciendo una nueva herramienta para evaluar cuantitativamente las terapias físicas, incluida la acupuntura y la moxibustión.

Resumen

El monitoreo dinámico en tiempo real de los efectos de la acupuntura es crucial para dilucidar sus mecanismos biológicos, sin embargo, los métodos histológicos tradicionales no logran capturar respuestas transitorias en el microambiente vivo. Aquí, establecimos un marco metodológico basado en imágenes confocales con láser in vivo , lo que permite la observación de alta resolución y en tiempo real de los cambios morfológicos en los tejidos locales después de la intervención de acupuntura. Después de la inyección intravenosa de fluoresceína de sodio en ratas, se rastrearon las alteraciones dinámicas en la microcirculación y la matriz extracelular (p. ej., disposición de las fibras de colágeno) durante la acupuntura. Los resultados demostraron que este método distinguió claramente las reacciones tisulares inmediatas (p. ej., vasodilatación) y retardadas (p. ej., respuesta inflamatoria) inducidas por la acupuntura, con una resolución espacial de 0,5 μm y una resolución temporal de 3,5 fps. El análisis cuantitativo posterior permitió la medición objetiva de los parámetros morfológicos. Este protocolo, descrito en este estudio, proporciona una herramienta de visualización para estudios in vivo de los mecanismos de acupuntura y sirve como referencia técnica para evaluar los efectos de otros estímulos físicos (por ejemplo, moxibustión).

Introducción

La acupuntura, como piedra angular de la medicina tradicional, ejerce efectos terapéuticos a través de respuestas complejas a nivel de tejido 1,2,3,4. Sin embargo, los conocimientos mecanicistas siguen siendo limitados por la histología convencional, que captura instantáneas estáticas pero no resuelve la dinámica en tiempo real de las adaptaciones morfológicas (p. ej., vasomodulación, remodelación de la matriz extracelular) en tejido vivo5. Si bien la microscopía intravital ofrece potencial de imagen dinámica, su aplicación en la investigación de la acupuntura es escasa, particularmente para cuantificar las respuestas espaciotemporales a los estímulos físicos 6,7. Por el contrario, este enfoque de imágenes confocales permite la extracción cuantitativa de parámetros estructurales y dinámicos, como la tasa de cambio en la velocidad de movimiento de los glóbulos rojos y la disposición del colágeno, en tejidos profundos (por ejemplo, capas musculares y puntos de acupuntura ST 36 / GB 34), superando las limitaciones de la microscopía intravital convencional en resolución espacial, imágenes volumétricas y seguimiento a largo plazo8.

Las imágenes confocales láser se han convertido en una poderosa herramienta para la visualización in vivo con una resolución celular 9,10,11,12,13. Sin embargo, los estudios existentes se centran principalmente en los tejidos superficiales (por ejemplo, la piel o la córnea), y pocos abordan los objetivos de acupuntura profunda o integran el análisis morfológico cuantitativo. Fundamentalmente, hasta donde sabemos, no existe una metodología estandarizada para correlacionar la manipulación de la acupuntura con los cambios cinéticos de los tejidos vivos.

Aquí, cerramos esta brecha mediante el establecimiento de una plataforma metodológica basada en imágenes confocales para el seguimiento en tiempo real de eventos morfológicos inducidos por acupuntura. Utilizando fluoresceína sódica (administrada por vía intravenosa a una concentración del 1%, 0,1 ml / 100 g de peso corporal) como agente de contraste, logramos un monitoreo de alta resolución (resolución espacial de 0,5 μm / resolución temporal de 3,5 fps) de alteraciones microcirculatorias y matriciales en un campo de visión de 450 μm × 450 μm a una profundidad de hasta 400 μm, desde la vasodilatación inmediata hasta las cascadas inflamatorias retardadas, durante la estimulación de la acupuntura. Este enfoque permite además la reconstrucción 3D y la cuantificación de parámetros de la realineación de las fibras de colágeno, superando las limitaciones de la histología del punto final.

Las consideraciones prácticas para la implementación de este protocolo son (i) el hardware recomendado incluye un sistema confocal con una resolución de ≥0,5 μm y una tasa de adquisición de ≥3 fps, (ii) las limitaciones típicas incluyen fotoblanqueo más allá de 90 s de imágenes continuas y sensibilidad al movimiento respiratorio o tisular, y (iii) la penetración en profundidad puede reducirse en tejidos altamente densos o dispersos. Hasta donde sabemos, este trabajo no solo proporciona el primer atlas dinámico de la reorganización tisular evocada por acupuntura, sino que también sienta un precedente para la evaluación de terapias físicas (por ejemplo, moxibustión) en sistemas vivos. Al convertir las respuestas fisiológicas transitorias en métricas cuantificables, ofrecemos un nuevo paradigma para los estudios mecanicistas de las terapias neuromoduladoras.

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Acupuntura y Moxibustión de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas (No. D2023-01-29-01). Se obtuvieron ocho ratas Sprague Dawley (SD) macho (8 semanas de edad, 200-220 g) de Biotechnology Co., Ltd. (Licencia No. SCXK (Jing) 2020-0001). Los animales se alojaron en recintos de aislamiento esterilizados en condiciones controladas: ciclo de luz-oscuridad de 12 h, temperatura de 21 ±± 2 °C, con acceso ad libitum a gránulos de comida estándar y agua. Todos los experimentos cumplieron con las directrices institucionales y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

NOTA: En la Figura 1 se muestra un diagrama de flujo que destaca los procedimientos principales.

1. Preparación de animal y trazador: Fluoresceína sódica (FS)

  1. Para preparar una solución de tinción de fluoresceína sódica (FS) al 1%, disuelva 0,1 g de FS en 10 ml de solución salina estéril (NaCl al 0,9%). Almacene la solución a temperatura ambiente (RT) para su uso posterior.
  2. Anestesiar ratas SD mediante inducción de isoflurano (inducción: 5% de isoflurano, mantenimiento: 2,5% de isoflurano). Retire el vello de la región craneal (excluyendo la cabeza) con una maquinilla eléctrica, luego aplique crema depilatoria durante 5 min. Elimine los restos de crema y cabello enjuagando con agua tibia.
    NOTA: Mantenga la cuchilla de la cortadora paralela a la superficie de la piel durante la operación para evitar lesiones dérmicas que puedan comprometer el análisis cuantitativo de imágenes. Se debe usar agua tibia estrictamente para enjuagar para evitar que la hipotermia animal afecte los resultados experimentales.

2. Inyección de FS

  1. Asegura la rata.
    1. Anestesiar ratas depiladas mediante inyección intraperitoneal de uretano al 10% (1 g/10 ml, en solución salina) a una dosis de 1,0 g/kg.
    2. Una vez que se logre la anestesia completa, asegure a los animales en posición supina en la plataforma quirúrgica. Aplique un suave pellizco en la pata trasera con fórceps y observe la ausencia de reflejo de retirada. Verifique la pérdida del reflejo corneal tocando ligeramente la córnea con una punta de algodón húmeda.
    3. Confirme la falta de respuesta sostenida y la frecuencia respiratoria estable antes de continuar con el procedimiento. Durante la anestesia, mantenga la temperatura corporal del animal con una almohadilla térmica a 37 °C.
      NOTA: Se debe confirmar la anestesia completa para evitar movimientos involuntarios que comprometan la reubicación de la ventana de imágenes.
  2. Administrar por vía intravenosa una solución de FS al 1% a través de la vena de la cola a una dosis de 0,1 ml por 100 g de peso corporal.
    1. Realice la inyección en la vena de la cola con una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 27 G. Limpie la cola suavemente con agua tibia para promover la vasodilatación, seguida de la desinfección con etanol al 70%.
    2. Inserte el biselado de la aguja en un ángulo poco profundo (≤15°) a lo largo del eje longitudinal de la vena. Inyecte la solución lentamente a una velocidad de 0,1-0,2 ml / min.
    3. Asegure el flujo técnico sin resistencia, la ausencia de edema perivascular y confirme la inyección exitosa mediante la decoloración amarilla de las pupilas, el pabellón auricular y las patas.
      NOTA: Se debe evitar estrictamente la inyección intraarterial accidental.

3. Configuración de endomicroscopía láser confocal con sonda in vivo (pCLE)

  1. Active el sistema pCLE y verifique la limpieza tanto del conector de la sonda de escaneo como de la punta distal.
  2. Limpie la punta distal de la sonda (también denominada punta de escaneo) con un hisopo de algodón humedecido con solución salina fisiológica, luego séquela suavemente con un pañuelo de lente.
  3. Coloque la sonda láser en el sitio de observación objetivo (p. ej., región medial del muslo). Asegure la sonda de imágenes confocales con una abrazadera ajustable, asegurando un contacto estable con la superficie del tejido sin artefactos de compresión, y fíjela apretando la perilla de ajuste.
  4. Conecte la sonda al sistema pCLE y configure los parámetros de adquisición (por ejemplo, campo de visión [FOV], directorio de almacenamiento). Los parámetros específicos utilizados en este experimento son los siguientes:Profundidad: 18 μm; Láser: 219 mW; Brillo: 76%; Velocidad: 1920 × 540; Ganancia: 2400; Zoom: 1× (464 μm); Filtro: LP 515; Tabla de búsqueda: Escaneo gris.
    NOTA: Los parámetros de imagen (profundidad de escaneo/potencia del láser) se optimizaron iterativamente hasta que se logró una visualización distinta de la arquitectura del tejido. La intensidad constante es fundamental para la comparabilidad longitudinal de la imagen. La adición de gotas salinas de 37 °C en la interfaz sonda-tejido eliminó la pérdida de señal observada en las iteraciones iniciales. La potencia del láser utilizada en este estudio está por debajo del umbral comúnmente aceptado para la fototoxicidad en imágenes confocales in vivo .

4. Imagen de la estructura organizativa con pCLE y adquisición

  1. Coloque la sonda en la superficie de la piel e inicie la adquisición de datos para visualizar la arquitectura del tejido.
    1. Sostenga la sonda con un lápiz; maniobrótelo hacia las regiones objetivo (p. ej., áreas con vasculatura o tejido conectivo fibroso dentro del campo de visión), coloque la punta distal directamente en la zona de imágenes y luego estabilice a través del brazo de la sonda.
  2. Primero, adquiera la arquitectura tisular basal durante 1 minuto en condiciones fisiológicas, seguido de un registro de 5 minutos durante la intervención de acupuntura. Terminar la adquisición después de la intervención. Los archivos de datos se guardan automáticamente en el directorio especificado en los pasos 3.3-3.4.
    NOTA: Los archivos se guardan como pilas de capas (.tiff) y fotogramas individuales (.tiff).

5. Intervención de acupuntura

NOTA: La adquisición en el paso de imagen se realiza durante la intervención.

  1. Inserte una aguja desechable de acero inoxidable de 1 cun (la unidad china de medida de longitud es de aproximadamente 13 mm) en el punto de acupuntura adyacente al tejido observado por la sonda. Conecte un cable a la aguja de acero inoxidable y asegure el otro electrodo de referencia en la cola de la rata.
  2. Aplicar estimulación de electroacupuntura (EA) utilizando los siguientes parámetros: intensidad de 1 mA, onda densa-dispersa (2/15 Hz), durante 5 min.
    NOTA: Mantenga una distancia suficiente (>3 mm) entre el sitio de inserción de la aguja y la sonda para evitar temblores dérmicos inducidos por EA que comprometan la estabilidad de la imagen.

6. Análisis de imágenes

  1. Abra las pilas de imágenes adquiridas en ImageJ. Convierta la calibración espacial a micrómetros y transforme el formato de imagen a 8 bits para compatibilidad con complementos (Tipo de > de imagen > 8 bits).
    NOTA: Las dimensiones predeterminadas de la imagen están en pulgadas (configuración específica del sistema).
  2. Defina la región de interés (ROI) para: microcirculación: segmento capilar único, estructura de la matriz: región de fibra de colágeno. Mantenga ROI idénticos en imágenes secuenciales para lograr consistencia longitudinal.
  3. Análisis de microcirculación
    1. Seleccione la región que contiene los glóbulos rojos que debe observarse y recorte la imagen para eliminar otras áreas de interferencia (Rectángulo > Imagen > Recortar). Utilice la herramienta de umbral para segmentar los glóbulos rojos (RBC) exclusivamente (Imagen > Ajustar > herramienta de umbral).
    2. Cargue el complemento MTrack2 . Establezca los parámetros de seguimiento apropiados basados en el tamaño de RBC (en este experimento, 10-42 píxeles) para excluir interferencias y garantizar un seguimiento preciso de RBC (Plugin > Tracking > MTrack2).
  4. Análisis estructural matricial
    1. Cargue el complemento Directionality , seleccione el modo de componentes de Fourier y realice un análisis estadístico sobre la proporción de distribución de fibras de colágeno en orientaciones de 0° a 180° (Analizar > direccionalidad).

7. Finalización de los datos

  1. Exporte los datos analizados en formatos TIFF/XSL utilizando la convención de nomenclatura: [Group]_[Date].extension. Haga una copia de seguridad de todos los archivos procesados y sin procesar en un servidor seguro designado. Registre los resultados cuantitativos en una hoja de cálculo de resumen para el análisis estadístico.

8. Seguridad y gestión de residuos

  1. Equipo de protección personal (EPP): Use guantes de nitrilo, una bata de laboratorio y gafas de seguridad cuando manipule uretano, isoflurano o fluoresceína sódica.
  2. Manejo anestésico: Realice procedimientos que involucren uretano o isoflurano dentro de una campana extractora para minimizar la exposición por inhalación.
  3. Precauciones para objetos punzantes: Deseche todas las agujas y objetos afilados inmediatamente en recipientes designados para objetos punzantes resistentes a perforaciones.
  4. Seguridad de electroacupuntura (EA): Verifique el aislamiento eléctrico del equipo EA y asegure las conexiones de cables para evitar corrientes de fuga o cortocircuitos.
  5. Eliminación de desechos: Deseche las botellas de isoflurano como desechos médicos según las pautas institucionales. Deseche los desechos de materiales contaminados con tintes (por ejemplo, hisopos, pañuelos) en contenedores sellados para desechos peligrosos. Recoja objetos punzocortantes en cajas de eliminación de objetos punzantes certificadas.
    NOTA: Todos los procedimientos deben cumplir con las normas institucionales de seguridad y salud ambiental.

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Resultados

Este protocolo demuestra la utilidad de pCLE para la evaluación dinámica en tiempo real de los efectos de la acupuntura en la microcirculación y la arquitectura de la matriz extracelular. Después de la administración intravenosa de fluoresceína de sodio a través de la vena de la cola, los cambios se evaluaron observando alteraciones en la velocidad de los eritrocitos dentro de los capilares locales y la reorganización de la disposición de las fibras de colágeno.

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Discusión

Como se demuestra en los resultados, el protocolo de imágenes confocales in vivo establecido en este estudio permite el análisis cuantitativo simultáneo de la dinámica de la matriz microcirculatoria y extracelular durante la intervención de acupuntura utilizando equipos estándar disponibles comercialmente y etiquetado fluorescente de rutina. El éxito de este protocolo se basa en dos pasos críticos: el momento preciso de la inyección de fluoresceína de sodio, asegurando un contra...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2024YFA1209900, 2024YFA1209903, 2024YFA1209904); Fondos especiales de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82050006); Proyecto de investigación de medicina tradicional china de la administración de medicina tradicional china de la provincia de Hubei (ZY2025Z015); El Fondo de Investigación de la Universidad de Jianghan (2024JCYJ13).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 aguja de acupuntura cunHwato, Suzhou, ChinaN/A13 mm/0,25 mm
10% de fluoresceína sódicaGuangxi Wuzhou Pharmaceutical Co Ltd, ChinaH45021477
Máquina de anestesia animalRWD, Shenzhen, ChinaR620IE
Monitor de temperatura corporalRWD, Shenzhen, China69026
Aparato de acupuntura eléctricaHwato, Suzhou, ChinaSDZ-III
Crema depilatoriaVeet, Francia
ImagenJInstitutos Nacionales de Salud, EE. UU.https://imagej.nih.gov/ij/
Endomicroscopía láser confocal con sonda in vivoOptiscan, AustraliaVistonVivoB30Diámetro: Sonda rígida de mano de 4 mm, resistente a la flexión y mantiene la integridad estructural a lo largo del tiempo. Longitud: ≥ Modo de escaneo de 46 mm.: Capacidad de escaneo con zoom.
IsofluranoRWD, Shenzhen, China
R510-22-16
UretanoSigma-Aldrich, Estados Unidos94300

Referencias

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