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Artículo de método

Estableciendo un modelo porcino para estudiar trasplante ocular completo, preservación dinámica y trasplante

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DOI:

10.3791/69179

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25 de noviembre de 2025

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children's Boston, 3Plastic Surgery Research Laboratory, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Hospices Civils de Lyon, 5Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, CHU de Rennes, University of Rennes, 6Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Antwerp, 7Bioengineering Research Group, Cardiff Metropolitan University, 8Collaboration for the Advancement of Sustainable Medical Innovation, University College London, 9Division of Plastic Surgery Research, Vascularized Composite Allotransplantation Program Development, Cedars-Sinai Hospital

En este artículo

Resumen

Se describe un modelo detallado y reproducible de trasplante de ojo integral en cerdo (WET), desde la obtención quirúrgica hasta el inicio de la perfusión por máquina, permitiendo el estudio de la preservación dinámica de WET en trasplantes.

Resumen

El primer trasplante ocular completo (WET) en humanos ha despertado nuevas esperanzas en pacientes que han perdido la visión debido a una lesión oftalmológica grave, pero aún quedan desafíos importantes por abordar antes de que la restauración visual mediante WET sea posible. Entre ellos, uno de los desafíos más críticos es la preservación ex vivo . El globo ocular, especialmente sus componentes neuronales como la retina y el nervio óptico, sufre una degeneración rápida e irreversible en cuestión de minutos, a menos que se garantice una adecuada conservación. El almacenamiento estático en frío (SCS) sigue siendo el estándar de oro en alotrasplante compuesto vascularizado (VCA), pero no es adecuado para la preservación ex vivo en el WET debido a su incapacidad para suprimir o apoyar suficientemente el metabolismo, lo que conduce a la pérdida de viabilidad y función del injerto. La perfusión subnormotérmica de máquinas (SNMP) ha surgido como una alternativa prometedora al SCS, ofreciendo el potencial no solo para preservar los injertos, sino también para reacondicionarlos. Nuestro grupo ha traducido con éxito SNMP de trasplante de órganos sólidos a varios modelos de VCA, demostrando su viabilidad y ventajas. En este caso, informamos de la aplicación de SNMP para preservar un WET en cerdos, detallando el modelo anatómico y el protocolo de preservación. Este enfoque representa un avance significativo en la optimización de las técnicas de preservación y trasplante de WET.

Introducción

Los alotrasplantes compuestos vascularizados (VCA) representan un avance significativo en la cirugía reconstructiva, ofreciendo resultados estéticos y funcionales sin igual para pacientes con lesionescomplejas 1,2. Sin embargo, la pérdida visual relacionada con los globos oculares sigue siendo una fuente importante de deterioro en lesiones faciales. El reciente primer trasplante de ojo completo (WET) ha despertado nuevas esperanzas para los pacientes 3,4. Aunque no se recuperó la visión, la imagen funcional demostró activación cortical en respuesta a la estimulación lumínica, y la electroretinografía (ERG) indicó una respuesta de los fotosreceptores embotada pero reconocible a la luz5. A pesar de logros técnicos excepcionales, aún quedan desafíos importantes por abordar para hacer que el WET funcional sea una realidad clínica. El globo ocular es muy sensible a la isquemia, y la retina y el nervio óptico sufren una degeneración irreversible en minutos después del tiempo de isquemia tibia (WIT) a menos que se mantengan los niveles adecuados de oxigenación ypH 6. Por tanto, la WET plantea desafíos específicos dentro del campo del VCA, y deben considerarse múltiples factores, incluyendo tanto los segmentos posterior como anterior, así como los componentes extraoculares. En particular, la musculatura es fundamental para lograr resultados funcionales exitosos, ya que es muy susceptible a lesiones por isquemia tibia, que se agravan aún más por la isquemia-reperfusión 7,8. La privación de ojigeno provoca daños celulares y la liberación de patrones moleculares asociados al daño (DAMPs). Al operar la reperfusión, estos DAMPs activan el sistema inmunitario del receptor, desencadenando inflamación e infiltración de células inmutarias. Este ambiente inflamatorio acelera el rechazo al promover la presentación de antígenos y la activación de las células T9. Además de superar desafíos como la reconexión del nervio óptico, WET requerirá técnicas optimizadas de perfusión ex vivo para prevenir daños derivados de la WIT o almacenamiento estático en frío (SCS) y finalmente lograr la restauración de lavisión 5,7,9,10,11.

La perfusión por máquina (MP) está bien establecida en el trasplante de órganos sólidos como método para prevenir lesiones porisquemia-reperfusión 12,13,14, mientras que la perfusión subnormotérmica por máquina (SNMP) ha demostrado resultados superiores en comparación con la SCS en varios modelos 15,16,17. Hemos traducido con éxito SNMP en modelos animales que van desde roedores18,19 hastacerdos 20,21,22 y, recientemente, primates nohumanos 23. SNMP no solo ha demostrado su eficacia para preservar los injertos durante largos periodos, sino que también ha demostrado potencial en el reacondicionamiento de injertos y la mitigación de lesiones isquémicas tibias, permitiendo una replantación segura hasta 24 horas tras laadquisición 24,25. Debido a su capacidad para mantener parcialmente el metabolismo celular, SNMP también abre nuevas vías al transformar la fase de preservación en una plataforma diagnóstica, terapéutica y de preacondicionamiento que puede integrarse en protocolos de replantación y trasplante en VCA. Hemos desarrollado un protocolo SNMP optimizado específicamente adaptado para los VCA y lo hemos aplicado a este complicado escenario de trasplante ocular completo.

En este estudio, se emplea SNMP para la preservación de órganos oxigenados y dinámicos a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). Esta técnica utiliza una bomba peristáltica y un oxigenador para circular y oxigenar el perfusado. Se utiliza un modelo porcina, que es muy relevante para estudios sobre trasplante y preservación de WET debido a sus similitudes fisiológicas con los humanos, tamaño comparable de vasos y la ausencia única de una pared orbitarialateral 26,27,28. Esta característica la hace especialmente adecuada para experimentos ex vivo y estudios de alotrasplantes, ya que la arteria carótida externa y la arteria oftálmica están directamente conectadas, permitiendo que el WET se obtenga únicamente a través de la arteria carótida externa y las venas yugulares sin requerir disección intracraneal para experimentos ex vivo e in vivo replantación ortotópica o heterotópica. La extracción se realiza tras la muerte circulatoria, alineándose con los protocolos de donación después de la muerte cardíaca y permitiendo un retraso en la extracción hasta que se extraigan otros órganos sólidos. Este modelo, por tanto, explora aún más el potencial de la SNMP para reacondicionar injertos altamente sensibles tras isquemia tibia y apoya el desarrollo de técnicas de preservación de WET en laboratorios de trasplantes establecidos que ya se centran en otros órganos, siguiendo los principios "3-R" de refinamiento, reducción yreemplazo 29,30. Además, sigue siendo relevante para compras de ritmo acelerado siguiendo pasos similares. El objetivo es establecer un modelo de preservación fiable basado en los pedículos carotídeos y yugulares externos y evaluar su viabilidad para la preservación dinámica. Se proporcionan pasos procedimentales detallados, que abarcan la adquisición de corrupción, la preservación y los aspectos clave de la implementación de SNMP.

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Protocolo

La aprobación institucional para este estudio se obtuvo del Comité Local de Cuidado y Uso Institucional de Animales (protocolo #2024N000205). Todo el trabajo con animales seguía las directrices31 de Investigación Animal: Reporte de Experimentos In Vivo y estaba de acuerdo con las recomendaciones de la Oficina de Revisión de Cuidado y Uso Animal del Ejército de EE. UU. (ACURO)32. Todos los WETs se adquirieron de cerdos sometidos a procedimientos terminales de obtención de órganos, siguiendo los principios "3-R" 33. Animales de peso entre 30 kg y 50 kg fueron eutanasiados por exanguinación tras recibir 100 UI/kg de heparina, y se utilizaron injertos WET izquierdos para experimentos. Los WETs adecuados servían como controles. La obtención de órganos se realizó post mortem con menos de 180 minutos de isquemia tibia. Consulte la Tabla de Materiales para detalles sobre todos los reactivos y equipos utilizados en el protocolo.

NOTA: Los datos se registraron en una hoja de cálculo (por ejemplo, Excel) y los análisis estadísticos se realizaron utilizando un software estadístico adecuado (por ejemplo, GraphPad Prism). El riesgo de alfa se estableció en el 5% y fue de dos colas. Para cada variable monitorizada, se determinaron la media y el error estándar de la media. La prueba de Spearman se utilizó para estudiar las correlaciones entre parámetros de perfusión.

1. Preparación por perfusión con máquina (1 día antes del experimento)

  1. Instala el sistema de perfusión de máquina34 (véase la Figura 1).
    1. Monta los componentes del sistema de perfusión: bomba, oxigenador, trampa de burbujas, sensor de presión continua y sensor de peso.
      NOTA: La longitud de la tubería debe mantenerse al mínimo necesario para ensamblar todos los componentes del montaje. Una vez montado, ten en cuenta que la calibración de presión es específica del sistema, especialmente de las longitudes de los tubos.
    2. Conecta el sistema como un circuito semicerrado de recirculación para bombear el perfusado del depósito al oxigenador, y luego al flujo de injerto (arteria carótida). La salida venosa drena de nuevo al depósito (Figura suplementaria 1 y vídeo suplementario 1).
    3. Conecta el sensor de presión a la tubería de entrada.
    4. Coloca el injerto sobre la plataforma tridimensional (impresa en 3D) situada en la báscula electrónica.
    5. Conecta tanto la báscula como el sensor de presión al microcontrolador.
    6. Conecta el microcontrolador al ordenador del operador para monitorización en tiempo real y grabación continua de datos.
    7. Prepara la cámara térmica para monitorizar la temperatura.
      NOTA: El control del peso, como sustituto para la formación de edema, es crucial ya que sirve como un indicador temprano de lesión del injerto durante laperfusión 35.
  2. Limpia bien los componentes del circuito antes de iniciar la perfusión y presta especial atención al oxigenador, especialmente si se ha utilizado varias veces.
    1. Empieza enjuagando todos los tubos por separado con etanol al 70% y luego con agua desionizada estéril.
    2. Montar el sistema y hacer circular 2 L de agua desionizada estéril para enjuaguar el oxigenador a un caudal de 50-100 mL/min si ya se ha utilizado.
      NOTA: Para estudios de replantación de animales vivos, utilice un nuevo oxigenador estéril y esterilice todos los demás componentes de perfusión con óxido de etileno (ETO)
  3. Prepara la solución de perfusión. Para la perfusión subnormotérmica de máquinas, se utiliza una solución Steen+ optimizada paraVCA 24,34,36. En total, utiliza 1,5 L por injerto, siguiendo la composición detallada previamentereportada de 34.
  4. Añade solución de hidróxido de sodio al perfusado para lograr un pH de 7,5-7,6. Establece este valor inicial deliberadamente alto, ya que el pH disminuirá durante la circulación cuando la mezcla de carbogénios (95% oxígeno, 5% dióxido de carbono) se disuelva.
  5. Calibra los sensores de peso y presión para asegurar mediciones precisas.
    1. Haz la báscula para tener en cuenta el peso de la plataforma.
    2. Para medir con precisión la presión vascular, calibrar el sistema según el manómetro y el caudal utilizados: mide la presión del sistema para cada tamaño de catéter que pueda usarse en intervalos regulares de caudal (cada incremento de 0,5 mL, de 0 a 20 mL/min).
    3. Durante los experimentos, para calcular la presión arterial, se resta la presión de calibración de la presión total que se está midiendo. La tabla de calibración utilizada en estos experimentos se proporciona como ejemplo (Figura suplementaria 2).
      NOTA: La calibración es específica para cada configuración. Repite la calibración tras cualquier cambio en el tubo, oxigenador o perfuso, ya que estas modificaciones pueden alterar la presión del sistema.

2. Adquisición post-mortem de WET

NOTA: Para simular la donación tras la muerte cardíaca y/o la obtención post-mortem, el animal debe ser sacrificado según las directrices locales de la IACUC. Prefiero la exanguinación a la inyección intravenosa de pentobarbital para evitar toxicidad por fármacos que pueda interferir con el estudio.

  1. Mantén al animal eutanasiado en posición prona. Afeita y frota la zona de la cabeza y el cuello y coloca cortinas estériles.
    NOTA: El modelo anatómico se presenta en la Figura 2, y en el Archivo Suplementario 1 se proporciona una guía de disección paso a paso.
  2. Dibuja las marcas cutáneas del colgajo.
    1. Asegúrate de que las marcas consistan en una línea alrededor de la órbita, a 2 cm del borde orbitario, y una incisión extendida 1 cm por debajo del canto lateral hacia el cuello.
    2. Realizar la incisión con un bisturí n°23 a través de la piel y el tejido subcutáneo hasta el hueso en las partes superior e inferior de la órbita, incluido el periostio. En las partes anterior y posterior del colgajo, asegúrese de que la incisión alcance el plano fascial.
  3. Comienza la disección con la parte anterior de la órbita usando tijeras Stevens y una pinza Adson.
    1. Elevar el contenido orbital en un plano subperióstico hacia las paredes orbitales con un elevador perióstico.
    2. Identificar y dividir estructuras cercanas a la pared orbitaria usando un bisturí n°15, incluyendo las inserciones de los músculos oblicuos y el plexo venoso orbitario, que sale de la órbita para unirse a la vena frontal.
      NOTA: La vena frontal drena hacia la vena facial, lo cual puede sacrificarse para ahorrar tiempo, siempre que se preserve la rama anastomótica con la vena oftálmica.
  4. Continúa la disección en la parte posterior de la órbita. Con un bisturí, se reseca el músculo masetero en su inserción cigomática, seguido de la rama ascendente de la mandíbula con un cortador óseo de Liston. Desarticular el cóndilo manualmente girando externamente el fragmento de la mandíbula.
  5. Divide el ligamento orbitario que se extiende desde el proceso cigomático hasta el hueso frontal para acceder a la porción orbitaria del músculo temporal. Resecar el músculo temporal.
  6. Con un elevador periostal, se crea un túnel subperiostal bajo el arco cigomático hacia el margen orbitario anterior. Usa una sierra recíproca para cortar el hueso. Identifica la arteria oftálmica que se encuentra en la porción inferolateral del cono orbitario bajo el músculo temporal.
  7. Resecar el arco cigomático y las paredes orbitarias anteroinferiores usando un rongeur.
    NOTA: Estos escalones proporcionan acceso al aspecto inferolateral del cono orbitario y a su pedículo vascular.
  8. Identificar y diseccionar con tijeras Stevens finas y pinzas microquirúrgicas ambas ramas de la arteria oftálmica a medida que penetran en el contenido orbitario.
    NOTA: La mayoría de los vasos (arteria carótida externa y vena yugular superficial) se encuentran por debajo de la mandíbula, excepto la vena facial, que es superficial a la mandíbula.
  9. Tras aislar la longitud deseada de la arteria carótida externa y la vena yugular, completar la disección seccionando el nervio óptico, los nervios oculomotores y el pedículo vascular usando un bisturí.

3. Preparación para la perfusión

  1. En una mesita auxiliar, dilata la arteria carótida usando un dilatador microquirúrgico e inserta un angiocateter. Asegura la canulación con lazos de seda 3-0.
    NOTA: En este protocolo, se utilizó un angiocateter 18-G para todas las arterias. Si el pedículo arterial es corto, se debe tener cuidado de no introducir el catéter demasiado lejos para evitar la canulación selectiva de solo una de las dos ramas oftálmicas. La vena yugular no necesita ser canulada a menos que se utilice un sistema de perfusión en lazo cerrado, lo cual no ocurrió en este protocolo.
  2. Para enjuaguar la arteria carótida, utiliza una jeringuilla de 10 mL montada con un sensor de presión idéntico al que se usa para el montaje de perfusión. Utiliza 10 mL de heparina (100 UI/mL) para lavar los vasos y que la salida sea clara. Mantente por debajo de 35 ± 5 mmHg, ya que la presión alta puede provocar lesiones microvasculares y fallos de perfusión.

4. Perfusión subnormotérmica de máquinas

  1. Conecta la arteria canulada del injerto al tubo de entrada del sistema de perfusión de máquina y coloca el injerto en la escama.
  2. Arranca la bomba que está ajustada a 2-4 mL/min.
    NOTA: El flujo y las tasas de presión por perfusión dependen del protocolo utilizado. Para el VCA, se utiliza un régimen estable y de bajo flujo para prevenir daños capilares y formación de edema.
  3. Evalúa los parámetros de viabilidad en cada punto temporal predefinido tanto en entrada como en salida utilizando una jeringuilla de 1 mL y analiza muestras con la máquina del sistema de gases sanguíneos (por ejemplo, métricas de gasoplastia [pH, pCO2,pO 2, lactatos, exceso de bases, bicarbonato], glucosa, sodio, potasio, calcio, cloruro). Esto nos permite calcular el estado metabólico del injerto según las ecuaciones presentadas en la Tabla 1.
    NOTA: En este protocolo, la perfusión dura 18 horas, y se toman muestras del flujo de entrada y salida cada hora durante las primeras 6 horas y luego cada 3 horas durante las 12 horas restantes.

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Resultados

Se realizó una prueba preliminar de viabilidad durante un periodo de 6 horas de SNMP, seguida de 2 horas de perfusión normotérmica con máquina (NMP) con sangre total para evaluar la correcta reperfusión de todo el injerto y simular la replantación. Durante la fase SNMP, se observó una salida constante y la posterior simulación de repercusión de sangre entera demostró una recoloración exitosa de todo el injerto. Los parámetros de perfusión confirmaron además la viabilidad de la técnica (<...

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Discusión

Más de dos décadas después de los primeros casos clínicos, el VCA sigue enfrentando importantes desafíos inmunológicos y de preservación ex vivo , limitando su disponibilidadgeneralizada en 37. Estos desafíos son aún más evidentes en el caso de WET, que ofrece perspectivas emocionantes para la restauración de la visión pero presenta obstáculos únicos, como lograr una reconexión exitosa del nervio óptico, preservar la funcionalidad tanto de los segmentos a...

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Divulgaciones

Algunos autores declaran intereses en competencia. Los doctores Uygun, Lellouch y Cetrulo tienen solicitudes de patente relevantes para este estudio. Los doctores Korkut Uygun y Basak Uygun tienen intereses financieros y forman parte del Consejo Asesor Científico de Sylvatica Biotech Inc., una empresa centrada en el desarrollo de tecnología para la preservación de órganos de bajo cero. Los intereses en competencia para los investigadores del MGH son gestionados por el MGB de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. Todos los autores restantes declaran no haber conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue parcialmente financiado por los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio nº R01AR082825 (BEU), R01EB028782 (KU), DoD RTRP RT240044 (KU, AGL, CLC), Shriners Children's 84308 (YB) y el sub-premio ARPA-H FY25.1065.001 (CLC), así como por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la subvención nº EEC 1941543 (KU). HO y YB recibieron financiación de la Fondation des Gueules Cassées. El apoyo de la Société Française de Chirurgie Plastique, Reconstructrice et Esthétique (SOFCPRE, Francia) a HO y YB es muy reconocido.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pinzas AdsonHerramientas Científicas Fines11019-12Herramienta quirúrgica
Sistema de Oxigenación Pixie de AfinidadMedtronicBBP241Oxigenador
Angiocath (24 G)Becton Dickinson381112Catéter de canulación
Albúmina sérica de BovinSigma-AldrichA9647Componente de perfusión
Dihidrato de cloruro de calcioSigma-Aldrich223506Componente de perfusión
Dióxido de carbono OxígenoAirgasUN3156Mezcla de dióxido de carbono y oxígeno   gas 
Catéter 24 GDutscher921048Canulación arterial
D-(+)-Glucosa monohidratoSigma-Aldrich49159Componente de perfusión
DexametasonaSigma-AldrichD2915Componente de perfusión
DextranTermociencia406271000Componente de perfusión
Pinzas dilatadorasAROSurgical11.946.1102Herramienta quirúrgica
Excel MicrosoftHoja de cálculo
Inyección de heparina sódicaEugia Pharma63739-953-25Componente de perfusión
Humulina Insulina regular humanaLily0002-8215-01Componente de perfusión
Hidrocortisona succinato sódicoPfizer0009-0011-03Componente de perfusión
LigaclipEthiconMCS20Clips vasculares quirúrgicos
Cortador óseo ListonHerramientas Científicas Fines16104-19Herramienta quirúrgica
Cloruro de magnesio hexahidratoSigma-AldrichM9272Componente de perfusión
MasterFlex L/SCole-Parmer77200-32Bomba de rodillos
Pinzas microquirúrgicasHerramientas Científicas Fines11253-20Herramienta quirúrgica
Elevador periósticoAROSurgical46.415.18Herramienta quirúrgica
Polietileno glicol 35000Sigma-Aldrich25322-68-3Componente de perfusión
Cloruro de potasioSigma-Aldrich7447-40-7Componente de perfusión
Monitor de presión, portátil, PM-P-1Instrumentación de Sistemas VivosPM-P-1Sensor de presión
Prism GraphPadv. 10.1.1Software de análisis estadístico
Radnoti  Cámara de cumplimiento de la trampa de burbujasRadnoti130149Trampa de burbujas
RAPIDPoint 500Siemens500Sistema de gases sanguíneos
Sierra reprocandoStryker5100-37Herramienta quirúrgica
RongeurHerramientas Científicas Fines16002-18Herramienta quirúrgica
Bisturí (n15)Herramientas Científicas Fines10015-00Herramienta quirúrgica
Bisturí (n23)Herramientas Científicas Fines10023-00Herramienta quirúrgica
Sutura de seda 3-0EthiconP683HSutura
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS5761Componente de perfusión
Cloruro de sodioSigma-AldrichS9888Componente de perfusión
Hidróxido de sodioSigma-Aldrich72068Componente de perfusión
Fosfato de sodio monobasique dihidratado  Sigma-Aldrich71505Componente de perfusión
Tijeras StevensAROSurgical07.367.13Herramienta quirúrgica
Jeringuilla 1 mLBD309659Adquisición de muestras
Jeringuilla 10 mLDutscher300912Enjuaguado de injerto
Cámara térmicaFlir Onehttps://www.flir.fr/products/flir-one-gen-3/?vertical=condition+monitoring&segment=solutionsMonitorización de la temperatura de perfusión
Tubería (n° 16)Masterflex13-310-282Montaje de perfusión por máquina
Clorhidrato de vancomicinaSlate run pharmaceuticals70436-021-82Componente de perfusión

Referencias

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