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Artículo de método

Un modelo avanzado de co-cultivo de la barrera hematocefalorraquídea humana para análisis separado del epitelio y endotelio del plexo coroides

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DOI:

10.3791/69275

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28 de noviembre de 2025

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1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

En este artículo

Resumen

Se estableció una co-cultura de células epiteliales y endoteliales humanas del plexo coroides para generar un modelo avanzado in vitro de la barrera hematocefalorraquídea. Describimos el aislamiento separado del epitelio y el endotelio para la posterior preparación de ARN y el análisis transcripcional bajo condiciones seleccionadas.

Resumen

El plexo coroides (PC), altamente perfundido, situado en el sistema ventricular del cerebro, consta de varios componentes estructurales, incluyendo un epitelio cuboide y un endotelio fenestrado, y es la ubicación de la barrera hematocefalorraquídea (BCSFB). Para investigar la PC in vitro, son posibles varios montajes de cultivo celular. Nuestro laboratorio estableció un modelo de filtro de cultivo celular invertido con una fuerte función de barrera, basado en células de papiloma epitelial CP humano (HIBCPP), que se utiliza extensamente. Recientemente, pudimos generar una línea celular endotelial de CP humana inmortalizada estable (iHCPEnC). Combinando ambas líneas celulares, hemos ensamblado un modelo avanzado funcional de dos células que desarrolló una función barrera aumentada en comparación con las células HIBCPP solas. Dado que este modelo representa tanto el epitelio CP como el endotelio, permite investigar la interacción entre ambos tipos celulares bajo condiciones seleccionadas, como infección, inflamación u otras. En este protocolo, describimos métodos para establecer este modelo de dos células con la posterior separación de las células epiteliales y endoteliales para análisis transcripcionales. Describimos cebadores de PCR específicos para epitelio y endotelio, que sirven para detectar posibles contaminaciones cruzadas entre ambos tipos celulares. Para investigar un posible impacto del endotelio CP en el epitelio en este modelo bajo condiciones inflamatorias, se analizaron los niveles de expresión de genes seleccionados en el contexto del tratamiento con lipopolisacáridos (LPS) en la fracción celular de HIBCPP. El avanzado modelo in vitro de la PC y la posibilidad de analizar por separado las respuestas epiteliales y endoteliales son de gran interés para la investigación sobre procesos celulares que implican funciones biológicas y patológicas de la PC.

Introducción

El plexo coroideo (PC) es un conglomerado altamente vascularizado de diferentes poblaciones celulares situado en los cuatro ventrículos del cerebro. Entre otras funciones, actúa como barrera fisiológica, la llamada barrera hematocefalorraquídea (BCSFB), entre el sistema nervioso central (SNC) y la sangre, impidiendo que el cerebro, por ejemplo, circule sustancias infecciosas en la sangre. La PC está compuesta por diferentes tipos celulares, incluidas las células epiteliales polarizadas, que contienen uniones estrechas y de adhesión, así como desmosomas, que se asientan sobre una membrana basal. La superficie de las células epiteliales se agranda por la presencia de microvellosidades en la superficie luminal. Los capilares endoteliales fenestrados, rodeados de tejido conectivo como fibroblastos y células inmunitarias, se encuentran bajo la membranabasal 1,2,3. Recientemente se informó que las células endoteliales de la PC pueden mejorar la integridad de la BCSFB junto con las células epiteliales y, por tanto, podrían desempeñar un papel en la protección cerebral durante procesosinflamatorios 4,5.

Hasta la fecha, el cultivo invertido de células de papiloma epitelial CP humano (HIBCPP) es el modelo in vitro más utilizado para imitar un BCSFB humano con altos valores de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y una fuerte función barrera. Para comprender mejor las funciones celulares y evitar experimentos con animales, es importante obtener la mayor cantidad de información posible de los experimentos in vitro. La primera línea celular endotelial cerebral inmortalizada humana estable (iHCPEnC) se estableció recientemente en nuestrolaboratorio 6,7. Con la ayuda de células HIBCPP e iHCPEnC, podemos montar un modelo de co-cultivo in vitro que imita al BCSFB de forma másavanzada 8. Utilizando este modelo de dos células, pudimos demostrar que el cocultivo de células HIBCPP e iHCPEnC conduce a un aumento de los valores TEER en comparación con las células HIBCPP por sí solas. Es importante señalar que iHCPEnC por sí sola no desarrolla un TEER 7,8. Una preparación separada y análisis posteriores de los dos tipos celulares empleados en este modelo nos permitiría investigar su interacción en condiciones sanas y enfermas.

Aquí describimos dos enfoques diferentes para lograr este objetivo. La base es que, en ambos casos, el enfoque se basa en el modelo de cultivo celular invertido de las células HIBCPP (Figura 1). El método 1, el método de "cocultivo directo", comprende ambas células en un mismo filtro insertado. Las células HIBCPP se cultivan de forma invertida antes de sembrar iHCPEnC de forma estándar 7,8. Método 2, el cultivo "membrana en inserto", aquí añadimos una membrana separada con las mismas propiedades que la utilizada en los insertos del filtro. Esta membrana adicional se introduce en un inserto filtro donde las células de HIBCPP ya están creciendo en cultivo invertido. Los iHCPEnC se siembran sobre la membrana adicional de forma estándar en cultivo.

La separación posterior de las células para el análisis de ARN permite obtener información sobre la reacción transcripcional del epitelio y endotelio del CP bajo condiciones seleccionadas. Describimos cebadores de PCR específicos para células HIBCPP e iHCPEnC que permiten confirmar la separación exitosa y limpia de ambos tipos celulares. Tras el tratamiento con lipopolisacáridos (LPS), utilizamos los modelos descritos para investigar las respuestas distintas del epitelio de la PC en presencia del endotelio en condiciones inflamatorias.

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Protocolo

1. Celdas HIBCPP

NOTA: A continuación, describimos el cultivo y mantenimiento de células HIBCPP, así como la preparación de inserciones de filtros de cultivo celular invertido con células HIBCPP. Este protocolo está diseñado para el crecimiento de células HIBCPP en inserciones de filtros de cultivo celular de 12 pozos. Un protocolo detallado con vídeo acompañante para el cultivo de células HIBCPP en insertos de filtros de cultivo celular de 24 pozos se ha publicadoanteriormente 9.

  1. Toma de células HIBCPP en cultivo
    1. Descongelar un vial de células HIBCPP a temperatura ambiente (RT).
    2. Resuspende el contenido del vial con 10 mL de medio DMEM/HAMS-F12 que contiene 10% de suero fetal para terneros (FCS) y 5 μg de insulina/mL de medio precalentado (medio 10% HIBCPP).
    3. Colocar las células HIBCPP resuspendidas en un matraz de cultivo de células T75 e incubarlas durante 24 horas a 37 °C con un 5% de CO2.
    4. Cambia el medio del matraz para eliminar el DMSO 24 horas después de sembrar las celdas.
    5. Cultiva las células hasta que confluyan al 90%, este paso dura unas 2 semanas. Cambia el medio dos veces por semana.
  2. Cultivo continuo de células HIBCPP
    NOTA: Para cultivo continuo, dividir las células HIBCPP 1:3 en nuevos frascos de cultivo celular T75.
    1. Retira el medio de cultivo del matraz T75.
    2. Lava las células una vez con 10 mL de PBS.
    3. Quita el PBS.
    4. Desprenden las células de HIBCPP con la ayuda de 3 mL de tripsina-EDTA al 0,25%. Este paso dura unos 10-20 minutos a 37 °C. Mientras tanto, remueve el matraz para asegurar que la capa celular se cubra completamente con tripsina-EDTA.
    5. Añade 7 mL de medio HIBCPP y centrifuga a 50 x g durante 10 minutos en RT.
    6. Resuspende el pellet celular en 30 mL de medio al 10% de HIBCPP y extiéndelo a 3 nuevos frascos de T75.
    7. Cultivar las células hasta alcanzar un 90% de confluencia; Las células alcanzarán la confluencia en aproximadamente una semana.
    8. Cambia el medio dos veces por semana.
      NOTA: Las células HIBCPP no están inhibidas por crecimiento; Por lo tanto, el matraz se volverá confluyente y las células seguirán creciendo y formando múltiples capas.
  3. Siembra de células HIBCPP en cultivo invertido
    1. Retira el medio de cultivo del matraz T75.
    2. Lava las células una vez con 10 mL de PBS.
    3. Quita el PBS.
    4. Desprenden las células de HIBCPP con la ayuda de 3 mL de tripsina-EDTA al 0,25%. Este paso dura unos 10-20 minutos a 37 °C. Mientras tanto, remueve el matraz para asegurar que la capa celular se cubra completamente con tripsina-EDTA.
    5. Mientras tanto, prepara los insertos del filtro. Gira los insertos de filtro de 12 pozos en orientación invertida en una placa de cultivo celular de 6 pozos con la ayuda de pinzas y llénalos con medio de HIBCPP al 10% precalentado. Prehumedece la membrana con una gota de medio encima de cada inserto filtrante.
    6. Resuspender las células tripsinizadas con 17 mL de medio al 10% de HIBCPP.
    7. Centrifuga a 50 x g durante 10 minutos en RT y ajusta las células de HIBCPP a una concentración de 1 × 106 células/mL.
      NOTA: Las células HIBCPP tienden a formar pequeños aglomerados. No es necesario disolverlos completamente antes de sembrar en los insertos del filtro. Asegúrate de que el 90% de las células sean únicas.
    8. Semilla las celdas HIBCPP de forma invertida en insertos de filtro de 12 pozos con una densidad de 4 × 10 celdasde 5 por inserto.
    9. Espera hasta que la membrana ocupa la suspensión celular. Cierra la tapa de la placa de cultivo celular de 6 pozos.
    10. Mete las placas con los insertos invertidos en la incubadora.
    11. 24 horas después de la siembra, gira los insertos con la ayuda de pinzas a su orientación correcta en una nueva placa de cultivo celular de 12 pozos. Ponga 2 mL de medio al 10% de HIBCPP en el compartimento inferior y 1 mL en el compartimento superior.
    12. Deja las células durante 5 a 6 días sin cambios de medio y comienza la determinación de TEER y la preparación del cocultivo.

2. Determinación del TEER

NOTA: La determinación de los valores TEER se realiza con la ayuda de un MilliCell ERS2 y un electrodo de palillos. Se requiere una medición en blanco desde el filtro de cultivo celular insertado en un medio sin celdas (en blanco deOhm) para el cálculo.

  1. Guarda el electrodo seco del palillo. Antes de comenzar la medición, introduce el electrodo en etanol al 80% durante 10 minutos para desinfectarlo.
  2. Después, enjuaga el electrodo con PBS.
  3. Inicio de la medición: Coloca el extremo largo del electrodo en el pozo y el extremo corto del electrodo en el filtro que contiene las celdas sembradas.
  4. Registrar el valor de Ohm del inserto del filtro de cultivo celular de 12 pozos (muestra de Ohm).
  5. Calcular el TEER de la siguiente manera: Ohm·cm2 = (Ohm muestra-Ohm en blanco) × 1,1 cm2.
  6. Después de terminar la medición, enjuaga el electrodo con etanol al 80% y luego guárdalo en seco.
    NOTA: Entre mediciones de diferentes condiciones experimentales o de distintas líneas celulares, el electrodo de palillos debe desinfectarse y enjuagarse con PBS para evitar la contaminación cruzada.

3. iHCPEnC

  1. Llevar iHCPEnC a la cultura
    1. Descongela un vial de iHCPEnC en RT.
    2. Suspende el contenido del vial con 5 mL precalentados de Medio Endotelial Clásico Completo (medio iHCPEnC).
    3. Centrifugar a 500 g durante 5 minutos en RT.
    4. Mientras tanto, recubre un matraz de cultivo celular T25 con 2 mL de Factor de Inserción durante aproximadamente 1 minuto. Aspira el factor de unión y deja el matraz hasta sembrar el iHCPEnC.
    5. Resuspende el pellet celular con 5 mL de medio iHCPEnC y ponlo en el matraz de cultivo de células T25 preparado.
    6. Incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 1 semana sin cambiar el medio.
  2. Cultivo continuo de iHCPEnC
    NOTA: Para cultivo continuo, divide iHCPEnC 1:4 en nuevos frascos de cultivo de células T25.
    1. Retira el medio iHCPEnC y lava las células una vez con 3 mL de PBS. Ten cuidado de evitar el desprendimiento de células.
    2. Aspira el PBS.
    3. Despegar el iHCPEnC confluente con la ayuda de 1 mL de Tripsina-EDTA. Este paso dura entre 3 y 5 minutos en RT.
    4. Resuspende las células en 5 mL de medio iHCPEnC.
    5. Centrifugar a 500 g durante 5 minutos en RT.
    6. Mientras tanto, recubre 4 nuevos frascos T25 con 2 mL de factor de inserción por matraz.
    7. Resuspende el pellet celular con 20 mL de medio iHCPEnC.
    8. Distribuye 5 mL de la suspensión de celda a cada uno de los 4 frascos preparados.
    9. De nuevo, cultiva las células durante una semana sin cambiar el medio. Alcanzarán la confluencia en una semana.
      NOTA: Las células iHCPEnC están inhibidas por el crecimiento; por lo tanto, el frasco se volverá confluyente y las celdas restantes flotarán.

4. Preparativos para experimentos de co-cultura

  1. Método 1: Para la "co-cultura directa" (cultivar las células epiteliales y endoteliales a ambos lados de un inserto), no prepare nada adicional.
  2. Método 2: Para el método "membrana en inserto", realiza los siguientes pasos:
    1. Perforar membranas de filtro de cultivo celular de 12 pozos del tamaño de un inserto con la ayuda de un hierro perforador nº 11 (correspondiente a un diámetro de 11 mm) de una membrana Din-A-4 separada.
    2. Ponle membranas perforadas en una placa de Petri.
    3. Esteriliza las membranas perforadas durante 60 minutos usando luz ultravioleta (UV-C, 254 nm).
      NOTA: Las membranas de filtro de cultivo celular de 12 pozos, del tamaño de un inserto de 12 pozos, pueden prepararse con antelación y almacenarse en condiciones estériles.

5. Creación de la cocultura

NOTA: En esta etapa, las células HIBCPP ya están preparadas para el modelo de cultivo in vitro de dos tipos de células. Las células HIBCPP se han cultivado durante 5 a 6 días (comparar los pasos 1.3.8-1.3.12). Las células HIBCPP deberían empezar a desarrollar un TEER (alrededor de 20 Ohm·cm 2).

  1. Para ambos, el Método 1 ("cocultivo directo") y el Método 2 ("membrana en inserto") reemplazan el medio al 10% de HIBCPP por medio al 1%. Para ello, se introduce 2 mL de medio de HIBCPP al 1% en un pozo de una placa de cultivo celular de 12 pozos.
  2. Vacía el inserto del filtro que contiene el cultivo invertido con la ayuda de una pipeta y pinzas, y coloca el inserto del filtro en orientación estándar en el 12-pozo preparado.
  3. Para el Método 2 ("membrana en inserto"), preparar los insertos de filtro de la siguiente manera:
    1. Coloca la membrana perforada y esterilizada en un inserto de filtro de 12 pozos preparado con células de HIBCPP en cultivo invertido con la ayuda de pinzas.
  4. Vuelve a colocar las placas de cultivo celular en la incubadora para la tripsinización del iHCPEnC (descrito en el paso 6).

6. Siembra y cultivo de iHCPEnC en co-cultura

NOTA: En la siguiente sección se describe el establecimiento de un cocultivo de células HIBCPP e iHCPEnC en insertos de filtro de cultivo celular de 12 pozos. Un protocolo detallado para el cocultivo de células HIBCPP e iHCPEnC en inserciones de filtros de cultivo celular de 24 pozos ha sido descritopreviamente 8. Antes de desprender iHCPEnC, calcula cuántas células se necesitan para realizar el cocultivo. Un matraz de cultivo celular T25 confluente proporcionará una cantidad aproximada de 5 × 105 celdas.

  1. Retirar el medio de un matraz T25 confluente que contiene iHCPEnC.
  2. Lava iHCPEnC con 3 mL de PBS. Evita el desprendimiento de las células.
  3. Quita el PBS.
  4. Despegar el iHCPEnC confluente con la ayuda de 1 mL de Tripsina-EDTA. Este paso dura entre 3 y 5 minutos en RT.
  5. Resuspende las células en un matraz de 5 mL/T25 con medio iHCPEnC.
  6. Cuenta las células en una cámara de Neubauer.
  7. Centrifugar a 500 × g durante 5 minutos en RT.
  8. Resuspende el pellet celular hasta una concentración final de 1 × 105 células/mL en un medio iHCPEnC.
  9. Tanto el Método 1 ("cocultivo directo") como el Método 2 ("membrana en el inserto"): semilla 700 μL de iHCPEnC (7x105 celdas) en un inserto filtrado de 12 pozos.
  10. Monitorizar los valores TEER del cocultivo y los controles (es decir, cultivos solo de células HIBCPP e iHCPEnC) por primera vez 24 horas después de la siembra de iHCPEnC y después diariamente.

7. Tratamiento con SPL

NOTA: Los cocultivos deben presentar valores TEER más altos en comparación con los cultivos solo de células HIBCPP (factor sugerido: 1,5 o superior).

  1. Mide y registra los valores TEER de los insertos de cultivo celular instalados para experimentos.
  2. Prepara una mezcla maestra que contenga 5 μg/mL LPS en un medio de 1% de HIBCPP.
  3. Preparar nuevas placas de 12 pozos que contengan 2 mL de medio al 1% de HIBCPP por pozo.
  4. Vacía los insertos con la ayuda de pinzas y pipeteo.
  5. Coloca los insertos en los pozos preparados.
  6. Añade 1 mL de la mezcla maestra LPS o un medio HIBCPP al 1%, respectivamente (control negativo).
  7. Incuba durante 4 horas a 37 °C.
  8. Mide y registra los valores TEER antes de proceder a la sección 8.

8. Aislamiento separado de ARN de células HIBCPP e iHCPEnC para análisis transcripcional posterior

NOTA: Para lograr dos fracciones celulares separadas y evitar la contaminación cruzada con células cultivadas en el modelo de cocultivo, las fracciones celulares se raspan cuidadosamente del inserto por separado. Realizar todos los pasos de aislamiento de ARN para cada inserto de filtro sin interrupción (los insertos no pueden quedarse sin filtros).

  1. Lava los insertos del filtro una vez con PBS. Para ello, preparar placas de cultivo celular de 12 pozos que contengan 1,5 mL PBS/pozo.
  2. Vacía los insertos del filtro de cultivo celular con la ayuda de una pipeta y pinzas. Coloca los insertos en la placa de cultivo celular de 12 pozos llena de PBS.
  3. Añade 1 mL de PBS en los insertos.
  4. Para preparar las células iHCPEnC y HIBCPP para el Método 1 ("cocultivo directo"), realiza los siguientes pasos:
    1. Retira el PBS del inserto y colócalo en una placa de cultivo celular vacía y seca de 12 pozos.
    2. Con la ayuda de una punta de pipeta y el pipeteo de 10-20 μL de PBS, los iHCPEnC se desprenden del inserto raspando.
    3. Coloque esta fracción celular en un tubo de 1,5 mL que contiene 350 μL de tampón de lisis de ARN. Pipetea arriba y abajo para mezclar correctamente las células con el tampón de lisis de ARN.
    4. Una vez completada la extracción de la fracción de iHCPEnC, gira el inserto boca arriba en la tapa de una placa de cultivo celular.
    5. Retira las células de HIBCPP de la membrana, igual que la fracción de iHCPEnC, y colócalas en un tubo preparado de 1,5 mL que contiene 350 μL de RLT-β-mercaptoetanol.
      NOTA: Si se preparan múltiples cocultivos para una condición, tomar 350 μL de tampón de lisis de ARN por inserto y fracción celular. Las fracciones de una sola célula preparada de una condición específica se purifican consecutivamente en la misma columna.
  5. Para preparar las células iHCPEnC y HIBCPP para el Método 2 ("membrana en inserto"), realiza los siguientes pasos:
    1. Retira la membrana adicional con la ayuda de pinzas y colócala en una tapa seca de una placa de cultivo celular de 12 pozos. Pipetear 100 μL de tampón de lisis de ARN sobre la membrana para la lisis de iHCPEnC.
    2. Coloque este lisato de 100 μL en un tubo de 1,5 mL que contenga 250 μL de tampón de lisis de ARN y mezcle bien.
    3. Retira el PBS del inserto del filtro y colócalo boca arriba en la tapa de una placa de cultivo celular de 12 pozos. Añade 100 μL de tampón de lisis de ARN sobre la membrana del inserto y lisa la fracción celular de HIBCPP.
    4. Coloque este lisato de 100 μL en un tubo de 1,5 mL que contiene 250 μL de tampón de lisis de ARN.
  6. Realiza aislamiento de ARN según el protocolo del fabricante.
  7. Mide la cantidad de ARN usando un espectrofotómetro.
  8. Realizar transcripción inversa y análisis qPCR de muestras de ARN según lo descrito por el fabricante.
    NOTA: Como los cocultivos contienen menos cantidades de iHCPEnC en comparación con las células HIBCPP, se necesitan varios insertos de filtro de 12 pozos para aislar suficiente ARN de iHCPEnC, dependiendo del análisis posterior. Los lisados de ARN de los distintos insertos filtrados deben agruparse. La transcripción inversa y la qPCR pueden realizarse como se describióanteriormente 6.

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Resultados

En este protocolo, describimos la generación paso a paso de un modelo de tipo bicelular de la PC humana compuesto por epitelio (células HIBCPP) y endotelio (iHCPEnC) en insertos de filtro de cultivo celular, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1. En este sistema modelo, las células HIBCPP se cultivan de forma invertida en la parte inferior del filtro, mientras que las iHCPEnC se siembran ya sea en la parte superior del filtro del inserto o en un se...

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Discusión

La PC humana consta de varios tipos celulares diferentes, incluyendo un epitelio formador de barrera y un endotelio de la vasculaturaextendida 3. Aunque las células endoteliales de la PC están fenestradas, investigaciones recientes han demostrado su contribución a la función de barrera en la BCSFB 4,7. Para estudiar las interacciones complejas entre el endotelio y el epitelio en órganos como la PC, se requ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% de tripsina-EDTALife Technologies 25200056
placa de cultivo celular de 12 pozos y nbsp;StarLabCC7682-7512
Insertos de filtro de 12 pozos (3 y micro; M pores)Greiner Bio One665631
placa de cultivo celular de 24 pozos y nbsp;StarLabCC7672-7524
inserción de filtro de 24 pozos   (0.4 & micro; M pores)Greiner Bio One662641
Inserto de filtro de 24 pozos (3 y micro; M pores)Greiner Bio One662631
placa de cultivo celular de 6 pozos y nbsp;StarLabCC7682-7506
Kit de síntesis de ADNcDNA AffinityScript (síntesis de ADNc)Agilent600559
Factor de uniónSistemas celulares4ZO-500Parte del kit completo Classic Endothelial Medium.
Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (PCR en tiempo real)Agilent600828
Electrodo de palillosMilliporeMERSSTX01Este producto está descatalogado.
Medio endotelial clásico completo (medio iHCPEnC)Sistemas celulares4ZO-500Kit que contiene medio, suplementos y Factor de Ancración para el recubrimiento.
DMEM/F-12 (1:1) con fenolred (medio HIBCPP al 10%)Thermo Fisher31330-038
DMEM/F-12 (1:1) sin fenolido (medio HIBCPP al 1%)Thermo Fisher11039-021
Suero fetal para terneros (FCS) (1% y 10% medio HIBCPP)Thermo Fisher10270-106
Insulina (1% y 10% HIBCPP medio)SigmaI9278
Lipopolisacáridos (LPS)SigmaL3024
MilliCell ERS2 MilliporeMERS00002Este producto está descatalogado.
Nanodrop (espectrofotómetro)Termo CientíficaND1000Este producto está descatalogado.
Hierro perforador nº 11Wü rth880223211
PBSLife Technologies 14190169
Herramienta de diseño de imprimaciónNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Imprimadores SigmaVC00021
Qiagen RNeasy microQiagen74004
RLT+b-ME (parte del micro kit Qiagen Rneasy)Qiagen74004
Matraz de cultivo celular T25Sarstedt AG & Co KG83,39,10,002
Matraz de cultivo celular T75Sarstedt AG & Co KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3,0 cc (membrana separada)SabeuSK4580
Luz ultravioletaCarl RothH469.1

Referencias

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