Method Article

Procedimiento de muestreo basado en hilo rojo de fenol para lipidómicos de fluidos lagrimales no dirigidos en el descubrimiento de biomarcadores

DOI:

10.3791/69474

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December 12th, 2025

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1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un protocolo clínico único para la recogida de muestras de fluido lacrimal humano utilizando hilos rojos de fenol y un flujo de trabajo basado en cromatografía líquida-espectrometría de masas tándema (LC-MS/MS) para descubrir el perfil lipidómico de las lágrimas. El método simple de separación bifásica entre metil-tert-butil (MTBE)/metanol permite una extracción rápida de lípidos lagrimales con alta recuperación para el descubrimiento de biomarcadores desgarradores.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los lípidos lagrimales son cruciales para la estabilidad de la película lagrimal y la salud de la superficie ocular. Los cambios en la composición de las lágrimas podrían estar asociados con enfermedades oculares y sistémicas como la disfunción de las glándulas de Meibomio y la dislipidemia. El perfilado de lípidos lagrimales puede ayudar al descubrimiento de biomarcadores para el diagnóstico y manejo de enfermedades. Sin embargo, los métodos comunes de muestreo de lágrimas presentan limitaciones claras: las tiras de Schirmer suelen causar irritación e incomodidad ocular debido a su gran área de contacto con la superficie ocular, mientras que la recogida de tubos microcapilares puede resultar en baja reproducibilidad debido a la variabilidad del operador, especialmente cuando se realiza por diferentes personas. Estas limitaciones podrían comprometer la precisión y consistencia de los datos lipidómicos. Este estudio introduce un método de muestreo basado en hilo rojo de fenol (PRT) mínimamente invasivo, optimizado para la lipidómica de lágrimas. La estructura delgada de la PRT minimiza el riesgo de irritación ocular y permite una recogida rápida y suave de las lágrimas. Este método fácil de usar y fácil de realizar es adecuado para sujetos con menor volumen de lágrimas o menor tolerancia a la sensación de cuerpos extraños, y permite una recogida de muestras más reproducible al reducir la variabilidad dependiente del operador. Los lípidos lagrimales recogidos por PRT se extrajeron utilizando un protocolo optimizado de separación de fase metanol/metil tert-butil éter (MTBE) y se analizaron mediante LC-Orbitrap-IQX MS/MS de alta resolución con el software LipidSearch. El flujo de trabajo identificó más de 700 especies únicas de lípidos lagrimales, cada una caracterizada por iones producto derivados de ácidos grasos específicos. Estos resultados indican que el muestreo basado en PRT proporciona una recuperación robusta de lípidos para el análisis lipidómico de desgarros. Este enfoque mínimamente invasivo y reproducible ofrece una plataforma práctica para la investigación clínica y experimental de lípidos lagrimales. En última instancia, esto también podría facilitar el descubrimiento de biomarcadores y la monitorización de enfermedades.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La película lagrimal es la barrera más externa que protege la superficie ocular de patógenos y mantiene la homeostasis ocular 1,2, mientras que la capa lipídica en la película lagrimal es el componente clave para prevenir la evaporación lagrimal y mantener la estabilidad de la películalagrimal 3,4. La desregulación de la composición de los lípidos lagrimales se ha relacionado con diversas enfermedades oculares, incluyendo la enfermedad ocular seca (DED), la disfunción de las glándulas de Meibomio (MGD) y la conjuntivitis alérgica 5,6,7,8. Como resultado, la caracterización detallada de los lipidómicos lagrimales se ha convertido en una línea de investigación crítica y de tendencia para una comprensión más completa de las patologías moleculares que subyacen a estas afeccionesoculares.

Aunque el enfoque lipidómico de lágrimas tiene una importancia clínica significativa, un desafío crítico en los lipidómicos de lágrimas es establecer un flujo de trabajo estandarizado y reproducible de recogida y análisis. Los métodos actuales de muestreo por lágrima, las tiras de Schirmer y el tubo microcapilar, presentan limitaciones distintivas. Las tiras de Schirmer tienen una gran zona de contacto con la superficie ocular que a menudo provoca irritación ocular y desgarrosreflejos 9,10. En comparación, la recogida de tubos microcapilares depende en gran medida de la técnica del operador y puede dar resultados inconsistentes cuando la realizan diferentes personas11. Además, el uso inadecuado de estas herramientas de muestreo puede conllevar un riesgo de lesión en la superficie ocular. Estas limitaciones podrían comprometer la precisión y reproducibilidad de los datosposteriores 12,13. Además, los métodos de recogida de lágrimas que requieren procedimientos complejos de manipulación pueden limitar su accesibilidad y estandarización en diferentes laboratorios y entornos clínicos. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer un flujo de trabajo de recogida y procesamiento de lágrimas no invasivo, robusto y reproducible que pueda preservar el perfil lipídico nativo de las lágrimas.

Estudios recientes han destacado la utilidad del hilo rojo de fenol (PRT) para análisis posteriores de flujos de trabajo LC-MS/MS en aplicaciones proteómicas ymetabolómicas 14,15. La PRT ofrece ventajas inherentes como herramienta de recogida de lágrimas. Su estructura delgada, naturaleza mínimamente invasiva y procedimiento de muestreo sencillo podrían minimizar la complejidad técnica y reducir la variabilidad dependiente del operador, siendo bien tolerados por la mayoría de lossujetos 14,16. Sin embargo, aún no se ha establecido un flujo de trabajo estandarizado específicamente para el análisis lipidómico de desgarros basado en PRT.

Este protocolo introduce un flujo de trabajo integrado para la lipidómica de lágrimas reproducibles: un método de recogida de lágrimas basado en PRT fácil de usar, adaptado para el análisis de lípidos, un protocolo optimizado de extracción de metil-tert-butil éter (MTBE)/metanol con proporciones solvente-muestra definidas y controlesde almacenamiento 17,18, y un método modificado de identificación lipídica usando LC-MS/MS de alta resolución. Este enfoque estandarizado permite un perfil lipidómico consistente de desgarros para el descubrimiento posterior de biomarcadores y la caracterización de enfermedades. Además, es especialmente adecuado para sujetos con bajo volumen de lágrimas o menor tolerancia a la sensación de cuerpos extraños (Figura 1).

figure-introduction-1
Figura 1: Visión esquemática del flujo de trabajo basado en Phenol Red Thread (PRT) para lipidómica de lágrimas humanas. El líquido lacrimal se recoge de sujetos utilizando el método PRT, lo que permite la adquisición constante de muestras con molestias mínimas. El procesamiento de muestras implica extracción bifásica secuencial de MTBE/metanol, concentración mediada por SpeedVac y reconstitución de extractos de lípidos lagrimales para cromatografía líquida-espectrometría de masas tándem (LC-MS/MS). Los perfiles lipidómicos se adquieren posteriormente mediante LC-MS/MS y se someten a anotación e identificación mediante el software LipidSearch. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad Politécnica de Hong Kong. Los sujetos proporcionaron consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Colección de fluido lacrimal humano basada en hilo rojo de fenol (PRT)

  1. Lleva guantes y desinfecta la estación de trabajo para evitar la contaminación de la muestra.
  2. Asegúrate de que el paquete del PRT esté sellado y no caducado antes de abrirlo.
  3. Sujeta el hilo por el extremo opuesto al gancho doblado. Evita siempre tocar la parte doblada del gancho del PRT.
  4. Pide al sujeto que mire la dirección nasal superior.
  5. Tira suavemente del párpado inferior del sujeto e inserta el PRT con el gancho doblado posicionado en la conjuntiva palpebral temporal inferior, cerca del canto externo del ojo del sujeto (Figura 2).

figure-protocol-1
Figura 2: Posición del hilo rojo fenol durante la recogida de lágrimas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Pide al sujeto que cierre los ojos suavemente y incline ligeramente la cabeza hacia adelante para evitar que el PRT toque su piel facial.
    NOTA: La lágrima absorbida induciría gradualmente un frente de tinte rojo, indicando la región muestreada de PRT debido al fenol rojo sensible al pH. Para asegurar suficiente fluido lacrimal para el análisis lipidómico, se prefiere recoger un volumen lagrimalar equivalente a 50 mm de PRT, que normalmente se completa en 2 minutos.
  2. Baja suavemente el párpado inferior del sujeto y saca el PRT muestreado. Evita tocar la zona muestreada.
  3. Registrar la longitud de la región muestreada del PRT y transferir el PRT a un nuevo tubo de muestra con la ayuda de pinzas estériles.
    NOTA: Si la longitud del PRT muestreado es <50 mm, por favor pide al sujeto que descanse entre 1 y 3 minutos y repita la recogida con el mismo ojo. Transfiere cada PRT muestreado a un tubo de muestra separado.
  4. Etiqueta y tapa bien los tubos de muestra.
  5. Limpia bien los guantes y las pinzas con metanol y limpia toallitas de papel para eliminar cualquier residuo de lágrimas o contaminantes, y luego déjalos secar.
  6. Repite los pasos 1.2-1.10 para el otro ojo.
  7. Sella los tubos de la muestra con parafilm y almacena inmediatamente la muestra a -20°C para almacenamiento temporal o -80°C para almacenamiento a largo plazo. Evita ciclos innecesarios de congelación y descongelación y protege la PRT muestreada de la luz.

2. Procesamiento de PRT muestreado

  1. Prelava las microtijeras con metanol antes de procesar los PRT.
  2. Descarta el extremo doblado del gancho (es decir, los primeros 3 mm) de los PRT (Figura 3).

figure-protocol-2
Figura 3: Aspecto físico del hilo rojo fenol (PRT). (A) PRT sin usar con extremo de gancho doblado. (B) Utilizó PRT con la sección indicada cortada y recogida para extracción de lípidos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Corta la región muestreada del PRT (es decir, la zona por encima del frente del tinte rojo fenol) en piezas de 2 mm y transfiere estas piezas a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL y tolerante a disolventes orgánicos.

3. Separación bifásica MTBE/metanol para la extracción de lípidos a partir de PRT muestreado

PRECAUCIÓN: El MTBE y el metanol son inflamables y volátiles. Úsalo en una zona bien ventilada o en una campana extractora. Evita llamas abiertas y chispas. Lleva guantes y bata de laboratorio. Lávate las manos después de manipularlas.

  1. Coloca las muestras sobre hielo.
  2. Añadir 232 μL de metanol helado (grado MS) a cada muestra y vórtice durante 15 segundos.
  3. Sonica las muestras con un limpiador ultrasónico preenfriado durante 15 minutos.
  4. Añadir 774 μL de MTBE (grado HPLC) y 194 μL de agua desionizada a cada muestra y vórtice durante 15 segundos. La relación de volumen resultante de MTBE:metanol:agua en la muestra debería ser de 4:1,2:1 (v/v/v).
  5. Sonica las muestras de nuevo con un limpiador ultrasónico preenfriado durante 15 minutos.
  6. Incubar la muestra en el termomezclador durante 8 horas a 4 °C, agitando a 1.200 rpm.
  7. Deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  8. Centrifugar las mezclas resultantes a 10.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
  9. Tras la centrifugación, las mezclas se separan en dos fases (Figura 4).
    NOTA: Al completar la separación de fases, inspeccione la muestra en busca de dos capas distintas: la fase orgánica superior (rica en MTBE) debe parecer transparente con una ligera opacidad lechosa, mientras que la fase acuosa inferior presenta una coloración amarilla atribuible a la presencia de indicador rojo fenol. Proceder solo si se observan estas características de fase, como se muestra en la Figura 4.

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Figura 4: Separación de fase de la extracción de lípidos usando MTBE-metanol-agua: fase orgánica superior y fase acuosa inferior. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Recoge cuidadosamente 700 μL de la fracción orgánica superior que contiene lípidos y transfiere a un nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mL previamente enfriado.
  2. Descartar la fase acuosa inferior que contiene MTBE residual y metanol como residuos químicos peligrosos. Recoge los residuos en recipientes etiquetados y sellados y deséchalos según los protocolos institucionales de residuos peligrosos y la normativa local. No eches disolventes por el desagüe.
  3. Seca los extractos lipídicos usando un concentrador SpeedVac refrigerado durante 4 horas a 4 °C.
    NOTA: Para asegurar un secado completo, revisa periódicamente la sequedad de la muestra a partir de las 2 horas. Amplía el tiempo de secado según sea necesario hasta que las muestras estén completamente secas.
  4. Almacenar los extractos lipídicos secos a -20 °C para almacenamiento a corto plazo o a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.

4. Reconstitución de los lípidos lagrimales extraídos para análisis LC-MS/MS

  1. Reconstituir los extractos lipídicos secos con 50 μL de la mezcla de metanol frío (grado MS)/cloroformo (grado HPLC) (1:1, v/v) como disolvente (1 μL de disolvente por cada 1 mm de PRT utilizado) y seguir mediante sonicación en un limpiador ultrasónico preenfriado durante 15 minutos.
  2. Centrifugar los extractos lipídicos reconstituidos a 14.000 × g y 4 °C durante 10 minutos.
  3. Transfiera cuidadosamente 40 μL del sobrenadante a un vial de vidrio automuestreador con un inserto de vidrio instalado.
  4. Tapa bien el vial con una tapa abierta de tabique sin rendija y listo para el análisis de LC-MS/MS.

5. Adquisición de muestras por LC-MS/MS

  1. Para Cromatografía Líquida, se ajusta la cámara de columna y la temperatura del muestreador a 50 °C y 4 °C, respectivamente.
  2. Para cada inyección, carga 5 μL de la muestra sobre una columna de LC de fase inversa (C18; 1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) y fracciona los lípidos a un caudal de 0,3 mL/min en un gradiente de separación de 24 minutos.
    1. Utiliza la fase móvil A que consiste en una mezcla de acetonitrilo 60:40 (grado MS):agua (v/v) con 5 mM de formiato de amonio (grado MS) y 0,1% (v/v) de ácido fórmico (grado MS) y fase móvil B que contenga isopropanol 90:10 (grado MS):acetonitrilo (v/v) con 5 mM de formiato de amonio y 0,1% (v/v) de ácido fórmico.
    2. Utiliza el siguiente gradiente: 0-2 min: 40% B; 2-2,5 min: 40% B; 2,5-3 min: 58% B; 3-18 min: 99% B; 18-20 min: 99% B; 20-20,1 min: 40% B; 20,1-24 min: 40% B.
  3. Para el espectrómetro de masas Orbitrap, se ajusta el voltaje de pulverización a +3,5 kV para el modo positivo o -2,5 kV para el modo negativo.
  4. Ajusta el caudal de gas de la vaina a 45 Arb y el caudal de gas auxiliar a 10 Arb.
  5. Ajusta el caudal de gas de barrido a 2 Arb.
  6. Ajusta la temperatura del tubo de transferencia iónica a 300 °C y la del vaporizador a 320 °C.
  7. Utiliza el modo de adquisición dependiente de datos (DDA).
  8. Para MS1, ajusta la resolución a 120.000, el rango de escaneo a 100-2000 m/z, objetivo AGC estándar, tiempo de inyección automática, exclusión dinámica a 6 s y umbral de intensidad a 5,0e4.
  9. Para MS2, se ajusta la resolución a 15.000, rango de escaneo automático, objetivo AGC estándar, tiempo de inyección dinámica, ventana de aislamiento a 1,6 m/z, tipo de energía de colisión como disociación colisional de mayor energía (HCD) y energía normalizada de colisión (NCE) a valores escalonados de 15, 30 y 40.
  10. Analizar datos en bruto con el software LipidSearch u otras plataformas compatibles.

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Results

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Se recogieron muestras compuestas de lágrimas de 16 voluntarios sanos en tres visitas independientes separadas por dos semanas (R1, lote más antiguo; R2, R3 recogidas secuencialmente dos semanas después de cada una). Utilizando LipidSearch con criterios estrictos (es decir, Relación señal-ruido ≥100, grado C o superior, e intensidad iónica ≥30.000), identificamos 773, 890 y 1.025 especies de lípidos únicos en R1-R3, respectivamente (Figura 5A). El modo iónic...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ventajas del muestreo por lágrimas basado en PRT y la extracción de lípidos
El flujo de trabajo de lipidómicos de lágrimas basado en PRT presentado aquí proporciona un método de muestreo mínimamente invasivo y práctico para un perfil integral de lípidos lagrimalides. En comparación con las tiras de Schirmer, que requieren contacto prolongado y mayores volúmenes de muestra, el muestreo PRT es rápido, puede completarse en 2 minutos, bien tolerado por diversas poblacione...

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Disclosures

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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de la iniciativa InnoHK, el Gobierno de la Región Administrativa Especial de Hong Kong y el Centro de Investigación para la Visión SHARP de la Universidad Politécnica de Hong Kong. Los autores también agradecen el apoyo técnico de la Instalación de Investigación Universitaria en Análisis Químico y Ambiental (UCEA) y de la Instalación de Investigación Universitaria en Ciencias de la Vida (ULS) de la Universidad Politécnica de Hong Kong.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrilo (ACN), grado LC-MSRCI LabscanLM1005
Columna C18 de ACQUITY UPLC CSHCorporación Waters186005297130Å, 1.7 µ m, 2,1 mm x 100 mm
Formato de amonio, grado LC-MSSigma-Aldrich55674
Vial de vidrio autosamplerWell Rich Scientific2ML-9-V1002Vial de rosca roscada de rosca 9-425 mm de vidrio transparente de 2 mL con base plana 9-425 con etiqueta (CON bloc de escritura)
Tapa de rosca acanalada abierta azul 9-425 y acanalado y acanalado;Well Rich Scientific9-SP1003con 9mm, septa de PTFE blanco/silicona roja de 1mm
Cloroformo, grado HPLCReactivos de Duksan1271
Tubos de bloqueo de caja fuerte Eppendorf, 1,5 mLEppendorf30120086
Ácido Fórmico (FA),   Grado LC-MSThermoFisher ScientificA117-50
Microinserto de vidrioWell Rich Scientific2ML-N2002250 y micro; Inserto en L, cristal transparente, base cónica con polietilena, tamaño: 5,8*28,5mm
Isopropanol, grado LC-MSRCI LabscanLM1162
LipidSearch SoftwareThermoFisher ScientificOPTON-30879Versión 5
Metanol,   Grado LC-MSRCI LabscanLM1115
Hilo rojo de fenol   (PRT)Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd20192160086
Centrífuga refrigeradaThermoFisher Scientific75007200
Concentrador centrífugo refrigerado CentriVap y trampas de frío CentriVapLabconco16108335
Microtubos de tapa de roscaThermoFisher Scientific3488
Éter metílico tert-butílico (MTBE), grado HPLCReactivos de Duksan1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCThermoFisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MSThermoFisher ScientificFSN05-10001
Termomezclador CEppendorf5382000015
Limpiador ultrasónicoCrest UltrasonicP500D-45
Mezclador de vórticesÍndice de referenciaBV1003

References

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