El hidroxilo cártamo amarillo A (HSYA) mitiga la osteoartritis de rodilla al mejorar la autofagia y proliferación de condrocitos mientras suprime la apoptosis y la inflamación a través de la inhibición de la vía HIF-1α / BNIP3.
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Artículo de investigación
El hidroxilo cártamo amarillo A (HSYA) mitiga la osteoartritis de rodilla al mejorar la autofagia y proliferación de condrocitos mientras suprime la apoptosis y la inflamación a través de la inhibición de la vía HIF-1α / BNIP3.
La reducción de la autofagia en el tejido cartilaginoso está estrechamente relacionada con el desarrollo de la osteoartritis de rodilla (KOA), sin embargo, los mecanismos por los cuales el hidroxilo cártamo amarillo A (HSYA) ejerce efectos protectores siguen sin comprenderse completamente. En este estudio, se aislaron condrocitos KOA humanos y se asignaron a diferentes grupos de tratamiento, incluido el control normal, el modelo en blanco, el HSYA, el inhibidor del factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α), el inductor de autofagia, el HSYA combinado con el inhibidor de HIF-1α y el HSYA combinado con el inductor de autofagia. Las citocinas proinflamatorias (IL-1β, TNF-α, IL-6) se cuantificaron mediante ELISA, la expresión proteica de HIF-1α, BNIP3 y los marcadores relacionados con la autofagia se examinaron mediante Western blotting, y las vesículas autofágicas en las mitocondrias se evaluaron mediante tinción de monodansilcadaverina y microscopía electrónica de transmisión. En comparación con el control normal, el grupo modelo en blanco mostró niveles significativamente mayores de IL-1β, TNF-α, IL-6 y HIF-1α, acompañados de tasas de apoptosis más altas, proliferación reducida y regulación a la baja de proteínas relacionadas con la autofagia (P < 0,05). El tratamiento con HSYA, inhibidor de HIF-1α o inductor de autofagia aumentó significativamente la expresión de proteínas relacionadas con la autofagia y redujo los niveles de citoquinas inflamatorias. Además, HSYA combinado con el inhibidor de HIF-1α o el inductor de autofagia produjo los efectos más pronunciados, con marcadas reducciones en la liberación de citoquinas y la apoptosis, junto con una mayor proliferación de condrocitos y formación de vesículas autofágicas mitocondriales (P < 0,05). Estos hallazgos demuestran que HSYA ejerce efectos condroprotectores en KOA, al menos en parte, a través de la inhibición de la vía HIF-1α / BNIP3, promoviendo así la autofagia y atenuando la lesión inflamatoria en los condrocitos.
Como una condición ortopédica crónica prevalente, la osteoartritis de rodilla (KOA) afecta a personas de mediana edad y ancianos, lo que afecta significativamente su calidad de vida 1,2. A pesar de su aparición generalizada, la etiología precisa y los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la KOA siguen sin comprenderse completamente. Además, tanto para la prevención como para el tratamiento curativo subraya la urgencia de desentrañar los intrincados fundamentos patológicos de esta afección. Un área de interés emergente es el papel de la autofagia en la homeostasis del cart....
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Todos los procedimientos con muestras humanas fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Popular Central de Zhanjiang (Aprobación No. KY-YS-2021-09). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la recolección de la muestra. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Pacientes y diseño del estudio
Se reclutaron treinta pacientes diagnosticados de artrosis de rodilla (KOA) y sometidos a artroplastia total de rodilla. La cohorte incluyó 14 hombres y 16 mujeres, con ....
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Efecto de HSYA sobre la expresión de citocinas proinflamatorias de condrocitos (IL-1β, TNF-α, IL-6)
En comparación con el grupo de control normal, todos los demás grupos mostraron niveles significativamente elevados de citocinas proinflamatorias (IL-1β, TNF-α e IL-6) (P < 0,05, Tabla 1, Figura 1A-G). El tratamiento con HSYA, inhibidor de HIF-1α, inductor de autofagia, inhibidor de HSYA + HIF-1α o inductor de HSYA + aut.......
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La osteoartritis (OA), una enfermedad crónica prevalente, afecta significativamente la calidad de vida de los pacientes. Entre los diversos subtipos de OA, KOA es el más común y contribuye a la carga mundial de enfermedades. A pesar de su alta incidencia, la etiología precisa y los mecanismos fisiopatológicos subyacentes de KOA siguen siendo difíciles de alcanzar. La intrincada interacción entre los procesos mecánicos y bioquímicos dentro del cartílago articular, particularmente la regul.......
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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Medicina Tradicional China de la provincia de Guangdong
(Subvención No. 20221446).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tetróxido de osmio al 1% | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 19150 | Más correcciones y muestras de tinción para análisis TEM |
| 2% de glutaraldehído | Sigma-Aldrich | G5882 | Soluciones de células para la preparación de muestras TEM |
| 4% de paraformaldehído | Servicebio | G1101 | Corrige las células para la tinción MDC y la preparación de muestras TEM |
| AG1478 | Corporación Selleck | S1005 | Inyección intravenosa de 20 mg/kg, inhibidor de la quinasa del receptor ErbB en modelo de rata |
| Kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC/PI | Biopantano | BS3030 | Tinte células apoptóticas para la detección de citometría de flujo |
| Inducidor de autofagia (RAPA) | Sigma Corporation | R0395 | Rapamicina, inducidor de autofagia, usado a 10 nmol/L en experimentos con condrocitos |
| Anticuerpo de Beclin1 | Santa Cruz Biotecnología | SC-48341 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de la proteína relacionada con la autofagia Beclin1 |
| Anticuerpo BNIP3 | Santa Cruz Biotecnología | SC-517348 | Anticuerpo principal para la detección de Western blot en BNIP3 |
| Incubadora de dióxido de carbono | Yiheng | BPN-150CW | para cultivo celular |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Disuelve cristales de formazano en ensayo MTT |
| DMEM | Beyotime | C0001 | Medio de cultivo celular, suplementado con un 10% de FBS para el cultivo de condrocitos |
| Lector de microplacas ELISA | Thermo Fisher Scientific | Multiskan FC | Mide valores de OD en ensayos ELISA y MTT |
| Reactivo de Quimioluminiscencia Mejorada (ECL) | Thermo Fisher Scientific | 32106 | Visualiza bandas proteicas en Western blot |
| Resina epoxi (EPON812) | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 14120 | Muestras de embeds para seccionamiento TEM |
| FBS | Beyotime | C0205 | Suero bovino fetal, añadido al DMEM para la nutrición de condrocitos |
| Citómetro de flujo | Beckman (mencionado por apoptosis) | CytoFLEX S | Detecta la tasa de apoptosis de los condrocitos y los marcadores celulares |
| Microscopio de fluorescencia | Olimpo | IX73 | Observa vesículas autofágicas teñidas con MDC |
| Sistema de imagen en gel | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Captura y cuantifica bandas proteicas de Western blot |
| HIF-1 y alfa; Anticuerpo | Santa Cruz Biotecnología | SC-13515 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de HIF-1 y alfa; |
| HIF-1 y alfa; Inhibidor (YC-1) | Corporación Selleck | S1047 | HIF-1 y alfa; Inhibidor de vías, usado en 10 y mu; mol/L en experimentos celulares |
| Centrífuga refrigerada de alta velocidad | Eppendorf | 5430R | Usado para separar componentes |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | Se une a los anticuerpos primarios para la amplificación de señales en Western blot |
| IL-1 y beta; ELISA Kit | Biología Shenggong | C5236 | Cuantifica IL-1 y beta; niveles en los supernadantes celulares mediante ELISA |
| IL-6 ELISA Kit | Biología Shenggong | C5237 | Cuantifica los niveles de IL-6 en los supernadantes celulares mediante ELISA |
| Anticuerpo LC3 | Santa Cruz Biotecnología | SC-398822 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de la proteína relacionada con la autofagia LC3 |
| Reactivo de lipofectamina 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | Reactivo de transfección a base de lípidos para la tanfección |
| Monodansilcadaverina (MDC) | Sigma-Aldrich | D4008 | 0,05 mol/L, colorea las vesículas autofágicas para microscopía de fluorescencia |
| Reactivo MTT | Beyotime | C0009 | 0,5 mg/mL, utilizado en el ensayo MTT para evaluar la proliferación de condrocitos |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | determinar la concentración de ARN |
| NRG1 ELISA Kit | Abcam (Reino Unido) | ab213961 | Mide la concentración de NRG1 en tejidos cardíacos mediante ELISA |
| Anticuerpo P62 | Santa Cruz Biotecnología | SC-28359 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de la proteína P62 relacionada con la autofagia |
| Anticuerpo fosforilado ErbB4 (p-ErbB4) | Afinidad | AF3445 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de ErbB4 activado |
| Kit de reactivos PrimeScript RT | Takara | RR047A | Transcripción inversa de ARN para proporcionar plantillas para experimentos qPCR |
| Sistema de PCR cuantitativa en tiempo real | Bio-Rad | CFX96 | para la detección RT-PCR |
| NRG1 humano recombinante (rh-NRG1) | R& Sistemas D | 396-HB | Inyección intravenosa de 5 mg/kg para activar la vía NRG1/ErbB4 en el modelo de rata |
| Amortiguador RIPA | Meilunbio | MA0151 | Tampón de lisis con inhibidores de proteasas/fosfatasa para la extracción de proteínas |
| Amarillo Cártamo A (HSYA) | Chengdu Mansit Biotechnology Co., Ltd. | Must-160601 | Componente bioactivo de Carthamus tinctorius L., usado en 100 y mu; mol/L para tratamiento de condrocitos |
| Equipamiento SDS-PAGE | Bio-Rad | Tetra mini-PROTEANO | Separa proteínas por peso molecular en Western blot |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820A | para el experimento qPCR |
| TNF-& alfa; ELISA Kit | Biología Shenggong | C5238 | Cuantifica TNF-y alfa; niveles en los supernadantes celulares mediante ELISA |
| Anticuerpo Total ErbB4 | Proteintech | 19943-1-AP | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de ErbB4 total |
| Microscopio Electrónico de Transmisión (MET) | Hitachi (mencionado por las vesículas autofágicas) | H-7650 | Observa vesículas autofágicas en mitocondrias a nivel ultraestructural |
| Reactivo Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | para la extracción de ARN |
| Tripsina-EDTA | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | Utilizado para la digestión enzimática del cartílago articular para aislar condrocitos |
| Colagenasa tipo II (0,02%) | Worthington Biochemical | CLS-2 | Digiere tejido cartilágico para aislamiento de condrocitos |
| Anticuerpo β-catenina | Santa Cruz Biotecnología | SC-7963 | Anticuerpo de referencia interno para la normalización de Western blot |
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