El hidroxilo cártamo amarillo A (HSYA) mitiga la osteoartritis de rodilla al mejorar la autofagia y proliferación de condrocitos mientras suprime la apoptosis y la inflamación a través de la inhibición de la vía HIF-1α / BNIP3.
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Artículo de investigación
El hidroxilo cártamo amarillo A (HSYA) mitiga la osteoartritis de rodilla al mejorar la autofagia y proliferación de condrocitos mientras suprime la apoptosis y la inflamación a través de la inhibición de la vía HIF-1α / BNIP3.
La reducción de la autofagia en el tejido cartilaginoso está estrechamente relacionada con el desarrollo de la osteoartritis de rodilla (KOA), sin embargo, los mecanismos por los cuales el hidroxilo cártamo amarillo A (HSYA) ejerce efectos protectores siguen sin comprenderse completamente. En este estudio, se aislaron condrocitos KOA humanos y se asignaron a diferentes grupos de tratamiento, incluido el control normal, el modelo en blanco, el HSYA, el inhibidor del factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α), el inductor de autofagia, el HSYA combinado con el inhibidor de HIF-1α y el HSYA combinado con el inductor de autofagia. Las citocinas proinflamatorias (IL-1β, TNF-α, IL-6) se cuantificaron mediante ELISA, la expresión proteica de HIF-1α, BNIP3 y los marcadores relacionados con la autofagia se examinaron mediante Western blotting, y las vesículas autofágicas en las mitocondrias se evaluaron mediante tinción de monodansilcadaverina y microscopía electrónica de transmisión. En comparación con el control normal, el grupo modelo en blanco mostró niveles significativamente mayores de IL-1β, TNF-α, IL-6 y HIF-1α, acompañados de tasas de apoptosis más altas, proliferación reducida y regulación a la baja de proteínas relacionadas con la autofagia (P < 0,05). El tratamiento con HSYA, inhibidor de HIF-1α o inductor de autofagia aumentó significativamente la expresión de proteínas relacionadas con la autofagia y redujo los niveles de citoquinas inflamatorias. Además, HSYA combinado con el inhibidor de HIF-1α o el inductor de autofagia produjo los efectos más pronunciados, con marcadas reducciones en la liberación de citoquinas y la apoptosis, junto con una mayor proliferación de condrocitos y formación de vesículas autofágicas mitocondriales (P < 0,05). Estos hallazgos demuestran que HSYA ejerce efectos condroprotectores en KOA, al menos en parte, a través de la inhibición de la vía HIF-1α / BNIP3, promoviendo así la autofagia y atenuando la lesión inflamatoria en los condrocitos.
Como una condición ortopédica crónica prevalente, la osteoartritis de rodilla (KOA) afecta a personas de mediana edad y ancianos, lo que afecta significativamente su calidad de vida 1,2. A pesar de su aparición generalizada, la etiología precisa y los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la KOA siguen sin comprenderse completamente. Además, tanto para la prevención como para el tratamiento curativo subraya la urgencia de desentrañar los intrincados fundamentos patológicos de esta afección. Un área de interés emergente es el papel de la autofagia en la homeostasis del cartílago, con evidencia acumulada que sugiere que la reducción de la autofagia dentro del tejido cartilaginoso contribuye a su degeneración en KOA 3,4.
La autofagia, un proceso de degradación celular vital para mantener la homeostasis celular, es de gran importancia en el mantenimiento y reparación del cartílago. En el microambiente hipóxico que prevalece dentro del cartílago articular, la vía de señalización de la proteína 3 que interactúa con el factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α) / adenovirus E1B 19 kDa (BNIP3) emerge como un regulador fundamental de la autofagia. Se ha observado una expresión elevada de HIF-1α en pacientes con KOA, lo que sugiere que la desregulación de esta vía puede contribuir a la alteración de la autofagia y la posterior degeneración del cartílago 5,6,7.
La acupuntura, la moxibustión, las hierbas y los masajes son cuatro métodos clásicos de la medicina tradicional china para tratar la artritis de rodilla. Los tratamientos actuales, como los antiinflamatorios no esteroideos, las inyecciones de ácido hialurónico y la artroplastia, han demostrado ser útiles, pero también se asocian con ciertos efectos secundarios8. Además, no existe un tratamiento de rutina recomendado para la osteoartritis de rodilla. Con el tiempo, como terapia complementaria común para KOA, la Medicina Tradicional China (MTC) ha desarrollado numerosos remedios a base de hierbas que se muestran prometedores en el tratamiento de KOA9. Entre estos, el amarillo de cártamo hidroxilo A ha atraído una atención significativa debido a sus propiedades antiinflamatorias y moduladoras de la autofagia10,11. Sin embargo, los mecanismos exactos por los cuales HSYA ejerce su influencia terapéutica en la osteoartritis de rodilla (KOA), particularmente en términos de regulación de la autofagia a través de la vía HIF-1α / BNIP3, siguen siendo inciertos. Por lo tanto, investigamos el mecanismo de los efectos terapéuticos de HSYA en KOA centrándonos en su impacto en la autofagia de condrocitos y su interacción con la vía HIF-1α / BNIP3. Nuestra hipótesis es que HSYA mitiga la osteoartritis de rodilla al mejorar la autofagia y la proliferación de condrocitos mientras suprime la apoptosis y la inflamación a través de la inhibición de la vía HIF-1α / BNIP3.
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Todos los procedimientos con muestras humanas fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Popular Central de Zhanjiang (Aprobación No. KY-YS-2021-09). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la recolección de la muestra. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Pacientes y diseño del estudio
Se reclutaron treinta pacientes diagnosticados de artrosis de rodilla (KOA) y sometidos a artroplastia total de rodilla. La cohorte incluyó 14 hombres y 16 mujeres, con edades comprendidas entre 52 y 75 años (media ± DE: 64,3 ± 12,6 años), todos cumpliendo con los criterios KOA del American College of Rheumatology12. Se excluyeron los pacientes que habían recibido antiinflamatorios no esteroideos o esteroides dentro de las 2 semanas anteriores a la cirugía o inyecciones intraarticulares dentro de 1 mes.
2. Cultivo primario de condrocitos
El cartílago articular se recolectó en condiciones estériles inmediatamente después de la cirugía y se colocó en PBS frío. Usando bisturíes estériles, el cartílago se cortó en fragmentos de ~ 1 mm³ en una placa de vidrio helada y se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 10 ml de tripsina-EDTA al 0,25%. El tubo se incubó en un baño de agua agitada a 37 °C a 80 rpm durante 30 min y se invirtió suavemente cada 5 min para facilitar la digestión. Se aspiró el sobrenadante y se lavó el gránulo de tejido una vez con PBS y se centrifugó a 200 × g durante 5 min. Luego, el gránulo se resuspendió en 10 ml de colagenasa tipo II al 0,02% y se digirió a 37 ° C durante 4 h con agitación. La suspensión se pipeteó hacia arriba y hacia abajo cada 30 min para promover la disociación, se pasó a través de un filtro de 70 μm y se centrifugó nuevamente a 200 × g durante 5 min. El gránulo resultante se resuspendió en DMEM suplementado con FBS al 10%, 100 U / ml de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina y se sembró en matraces T25. Las células se incubaron a 37 °C con 5% de CO2, el medio se reemplazó cada 2-3 días y se utilizaron células de los pasajes 1-2 para experimentos. Los grupos experimentales incluyeron control normal, modelo en blanco, HSYA (100 μmol / L), inhibidor de HIF-1α YC-1 (10 μmol / L), rapamicina (10 nmol / L), HSYA + YC-1 y HSYA + rapamicina.
3. HIF-lα mediado por ARNip, eliminación de BNIP3
Los condrocitos primarios se sembraron en placas de 6 pocillos a 2-5 × 105 células/pocillo y se cultivaron a 37 °C hasta que alcanzaron una confluencia del 30%-50%. Para cada pocillo, se diluyeron 5 μL de ARNip de 20 μM en Opti-MEM de 250 μL, y 5 μL de reactivo de transfección a base de lípidos se diluyeron por separado en Opti-MEM de 250 μL. Las dos soluciones se mezclaron suavemente y se incubaron a temperatura ambiente durante 15-20 min para formar complejos. El medio de cultivo se reemplazó con 1,5 ml de DMEM fresco con FBS al 10%, y el complejo siRNA-lípido (500 μL) se agregó gota a gota a lo largo de la pared del pocillo con un remolino suave. Las células se incubaron durante 6 h, el medio se reemplazó por medio completo y el cultivo se continuó durante 48-72 h. La eficacia de la eliminación se verificó mediante qRT-PCR y Western blot antes de otros tratamientos.
4. ELISA
Se recogieron sobrenadantes de cultivo celular, se centrifugaron a 200 × g durante 5 min y se diluyeron 1:2 en tampón de ensayo cuando fue necesario. Se utilizaron kits ELISA para IL-1β, TNF-α e IL-6 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los estándares, los espacios en blanco y las muestras se ejecutaron por triplicado. Después de la reacción del sustrato, la absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas en 15 min.
5. Ensayo MTT
Los condrocitos se sembraron en placas de 96 pocillos a 5.000 células/pocillo en 100 μL de medio completo y se incubaron durante 0 h, 24 h, 48 h o 72 h. En cada punto de tiempo, se agregaron 20 μL de solución de MTT (5 mg / mL en PBS) directamente a cada pocillo, y las placas se incubaron a 37 ° C durante 30 min hasta que los cristales de formazán púrpura se hicieron visibles en el fondo de los pocillos. El sobrenadante se aspiró cuidadosamente sin alterar los cristales, se agregaron 150 μL de DMSO a cada pocillo y las placas se colocaron en un agitador a 100 rpm durante 10 min para disolver los cristales por completo. La absorbancia se midió a 490 nm utilizando un lector de microplacas. El tiempo de incubación corto se seleccionó para evitar la saturación de señales en células altamente metabólicamente activas.
6. Citometría de flujo
Las células se recolectaron por tripsinización, se centrifugaron a 200 × g durante 5 min y se lavaron dos veces con PBS frío. Se resuspendieron en 500 μL de tampón de unión a ~1 × 106 células/mL, y se añadieron 5 μL de anexina V-FITC y 5 μL de PI. Después de una mezcla suave, las células se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo, con al menos 10.000 eventos recolectados por muestra (excitación 488 nm, emisión FITC 530/30 nm, PI > 600 nm). Las células apoptóticas se cuantificaron utilizando un software estándar.
7. Western blot
Las células se enjuagaron dos veces con PBS frío y se lisaron en tampón RIPA de 200 μL que contenía inhibidores de proteasa en hielo durante 30 min. Las células se rasparon con un raspador de plástico, se pipetearon hacia arriba y hacia abajo para reducir la viscosidad y se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. Se recogieron sobrenadantes y se midieron las concentraciones de proteínas mediante el ensayo BCA. Se mezclaron cantidades iguales de proteína (30 μg) con tampón de carga al 5×, se calentaron a 95 °C durante 5 min y se separaron en geles SDS-PAGE al 10%-12%. La electroforesis se ejecutó a 80 V para el apilamiento y 120 V para la separación, y las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF a 300 mA durante 90 min. Las membranas se bloquearon en leche descremada al 5% durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios (1:1.000). Después de tres lavados con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1: 5,000) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron con sustrato ECL y se obtuvieron imágenes utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia con una exposición de 30-120 s. Las intensidades de banda se cuantificaron utilizando ImageJ y se utilizó GAPDH como control de carga.
8. Tinción con monodansilcadaverina (MDC)
Se preparó una solución de trabajo MDC de 50 μM a partir de la solución madre inmediatamente antes de su uso. Las células se fijaron con 1 mL de paraformaldehído al 4% durante 10 min a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con 500 μL de solución de trabajo MDC durante 30 min a 37 °C en la oscuridad. Después de dos lavados con PBS, los cubreobjetos se montaron con medio de montaje antidecoloración y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (excitación 355 nm, emisión 512 nm).
9. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Las células se recolectaron y granularon por centrifugación a 200 × g durante 5 min, luego se fijaron en glutaraldehído al 2% a 4 ° C durante la noche. Las muestras se lavaron tres veces con PBS durante 5 min cada una y se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1% durante 1 h a 4 °C en una campana extractora. La deshidratación se realizó a través de una serie de acetona graduada de 30%, 50%, 70%, 90% y 100% durante 10 min cada una. Las muestras se infiltraron con acetona/resina epoxi 1:1 durante 1 h y luego con resina pura durante la noche. La inclusión se realizó en resina fresca y se polimerizó a 60 °C durante 48 h. Se cortaron secciones ultrafinas de 50-70 nm con un ultramicrotomo, se montaron en rejillas de cobre de malla 200, se tiñeron con acetato de uranilo al 2% durante 30 min seguido de citrato de plomo durante 15 min, se lavaron con agua destilada, se secaron al aire y se examinaron bajo un microscopio electrónico de transmisión a 80 kV. Como nota de seguridad, el glutaraldehído y el tetróxido de osmio son tóxicos y volátiles y deben manipularse solo en una campana extractora con guantes y gafas protectoras. Los desechos deben eliminarse en contenedores peligrosos designados de acuerdo con los protocolos de seguridad institucionales.
10. Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos se expresan como media ± DE. La significación estadística se evaluó mediante ANOVA de una vía seguido de prueba post-hoc de LSD, con P < 0,05 considerado significativo.
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Efecto de HSYA sobre la expresión de citocinas proinflamatorias de condrocitos (IL-1β, TNF-α, IL-6)
En comparación con el grupo de control normal, todos los demás grupos mostraron niveles significativamente elevados de citocinas proinflamatorias (IL-1β, TNF-α e IL-6) (P < 0,05, Tabla 1, Figura 1A-G). El tratamiento con HSYA, inhibidor de HIF-1α, inductor de autofagia, inhibidor de HSYA + HIF-1α o inductor de HSYA + aut...
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La osteoartritis (OA), una enfermedad crónica prevalente, afecta significativamente la calidad de vida de los pacientes. Entre los diversos subtipos de OA, KOA es el más común y contribuye a la carga mundial de enfermedades. A pesar de su alta incidencia, la etiología precisa y los mecanismos fisiopatológicos subyacentes de KOA siguen siendo difíciles de alcanzar. La intrincada interacción entre los procesos mecánicos y bioquímicos dentro del cartílago articular, particularmente la regul...
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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Medicina Tradicional China de la provincia de Guangdong
(Subvención No. 20221446).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tetróxido de osmio al 1% | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 19150 | Más correcciones y muestras de tinción para análisis TEM |
| 2% de glutaraldehído | Sigma-Aldrich | G5882 | Soluciones de células para la preparación de muestras TEM |
| 4% de paraformaldehído | Servicebio | G1101 | Corrige las células para la tinción MDC y la preparación de muestras TEM |
| AG1478 | Corporación Selleck | S1005 | Inyección intravenosa de 20 mg/kg, inhibidor de la quinasa del receptor ErbB en modelo de rata |
| Kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC/PI | Biopantano | BS3030 | Tinte células apoptóticas para la detección de citometría de flujo |
| Inducidor de autofagia (RAPA) | Sigma Corporation | R0395 | Rapamicina, inducidor de autofagia, usado a 10 nmol/L en experimentos con condrocitos |
| Anticuerpo de Beclin1 | Santa Cruz Biotecnología | SC-48341 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de la proteína relacionada con la autofagia Beclin1 |
| Anticuerpo BNIP3 | Santa Cruz Biotecnología | SC-517348 | Anticuerpo principal para la detección de Western blot en BNIP3 |
| Incubadora de dióxido de carbono | Yiheng | BPN-150CW | para cultivo celular |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Disuelve cristales de formazano en ensayo MTT |
| DMEM | Beyotime | C0001 | Medio de cultivo celular, suplementado con un 10% de FBS para el cultivo de condrocitos |
| Lector de microplacas ELISA | Thermo Fisher Scientific | Multiskan FC | Mide valores de OD en ensayos ELISA y MTT |
| Reactivo de Quimioluminiscencia Mejorada (ECL) | Thermo Fisher Scientific | 32106 | Visualiza bandas proteicas en Western blot |
| Resina epoxi (EPON812) | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 14120 | Muestras de embeds para seccionamiento TEM |
| FBS | Beyotime | C0205 | Suero bovino fetal, añadido al DMEM para la nutrición de condrocitos |
| Citómetro de flujo | Beckman (mencionado por apoptosis) | CytoFLEX S | Detecta la tasa de apoptosis de los condrocitos y los marcadores celulares |
| Microscopio de fluorescencia | Olimpo | IX73 | Observa vesículas autofágicas teñidas con MDC |
| Sistema de imagen en gel | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Captura y cuantifica bandas proteicas de Western blot |
| HIF-1 y alfa; Anticuerpo | Santa Cruz Biotecnología | SC-13515 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de HIF-1 y alfa; |
| HIF-1 y alfa; Inhibidor (YC-1) | Corporación Selleck | S1047 | HIF-1 y alfa; Inhibidor de vías, usado en 10 y mu; mol/L en experimentos celulares |
| Centrífuga refrigerada de alta velocidad | Eppendorf | 5430R | Usado para separar componentes |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | Se une a los anticuerpos primarios para la amplificación de señales en Western blot |
| IL-1 y beta; ELISA Kit | Biología Shenggong | C5236 | Cuantifica IL-1 y beta; niveles en los supernadantes celulares mediante ELISA |
| IL-6 ELISA Kit | Biología Shenggong | C5237 | Cuantifica los niveles de IL-6 en los supernadantes celulares mediante ELISA |
| Anticuerpo LC3 | Santa Cruz Biotecnología | SC-398822 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de la proteína relacionada con la autofagia LC3 |
| Reactivo de lipofectamina 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | Reactivo de transfección a base de lípidos para la tanfección |
| Monodansilcadaverina (MDC) | Sigma-Aldrich | D4008 | 0,05 mol/L, colorea las vesículas autofágicas para microscopía de fluorescencia |
| Reactivo MTT | Beyotime | C0009 | 0,5 mg/mL, utilizado en el ensayo MTT para evaluar la proliferación de condrocitos |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | determinar la concentración de ARN |
| NRG1 ELISA Kit | Abcam (Reino Unido) | ab213961 | Mide la concentración de NRG1 en tejidos cardíacos mediante ELISA |
| Anticuerpo P62 | Santa Cruz Biotecnología | SC-28359 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de la proteína P62 relacionada con la autofagia |
| Anticuerpo fosforilado ErbB4 (p-ErbB4) | Afinidad | AF3445 | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de ErbB4 activado |
| Kit de reactivos PrimeScript RT | Takara | RR047A | Transcripción inversa de ARN para proporcionar plantillas para experimentos qPCR |
| Sistema de PCR cuantitativa en tiempo real | Bio-Rad | CFX96 | para la detección RT-PCR |
| NRG1 humano recombinante (rh-NRG1) | R& Sistemas D | 396-HB | Inyección intravenosa de 5 mg/kg para activar la vía NRG1/ErbB4 en el modelo de rata |
| Amortiguador RIPA | Meilunbio | MA0151 | Tampón de lisis con inhibidores de proteasas/fosfatasa para la extracción de proteínas |
| Amarillo Cártamo A (HSYA) | Chengdu Mansit Biotechnology Co., Ltd. | Must-160601 | Componente bioactivo de Carthamus tinctorius L., usado en 100 y mu; mol/L para tratamiento de condrocitos |
| Equipamiento SDS-PAGE | Bio-Rad | Tetra mini-PROTEANO | Separa proteínas por peso molecular en Western blot |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820A | para el experimento qPCR |
| TNF-& alfa; ELISA Kit | Biología Shenggong | C5238 | Cuantifica TNF-y alfa; niveles en los supernadantes celulares mediante ELISA |
| Anticuerpo Total ErbB4 | Proteintech | 19943-1-AP | Anticuerpo principal para la detección por Western blot de ErbB4 total |
| Microscopio Electrónico de Transmisión (MET) | Hitachi (mencionado por las vesículas autofágicas) | H-7650 | Observa vesículas autofágicas en mitocondrias a nivel ultraestructural |
| Reactivo Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | para la extracción de ARN |
| Tripsina-EDTA | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | Utilizado para la digestión enzimática del cartílago articular para aislar condrocitos |
| Colagenasa tipo II (0,02%) | Worthington Biochemical | CLS-2 | Digiere tejido cartilágico para aislamiento de condrocitos |
| Anticuerpo β-catenina | Santa Cruz Biotecnología | SC-7963 | Anticuerpo de referencia interno para la normalización de Western blot |
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