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Artículo de método

Efecto de la prescripción de Yi-Nao-Jie-Yu en la depresión post-ictus en ratas utilizando oclusión de la arteria cerebral media combinada con contención conductual

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DOI:

10.3791/69537

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9 de enero de 2026

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1School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3Capital Medical University Yanjing College, 4School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 5Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo de rata para la depresión postictus (PSD) combinando la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) con estrés leve crónico, contención conductual y alojamiento de aislamiento, y la evaluación de los efectos terapéuticos de la prescripción Yi-nao-jie-yu (YNJYP) mediante pruebas conductuales.

Resumen

La depresión post-ictus (PSD) es una complicación común y tratable del ictus, caracterizada por síntomas depresivos y somáticos que perjudican la recuperación y la calidad de vida del paciente. Este estudio describe un protocolo que combina la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) con la contención conductual y alojamiento de aislamiento para establecer un modelo de PSD en ratas, y evalúa el efecto terapéutico de la prescripción Yi-nao-jie-yu (YNJYP) en la neurogénesis adulta en ratas PSD. Para el establecimiento del modelo, las ratas en los grupos ictus, PSD, fluoroxetina hidrocloruro (FXT) y YNJYP se sometieron a MCAO: se avanzó una sutura monofilamento desde la arteria carótida interna hasta la arteria cerebral media (MCA) durante 2 horas de isquemia, seguida de reperfusión. Desde el día 7 post-MCAO, las ratas de los grupos PSD, FXT y YNJYP fueron alojadas en una sola casa y restringidas en una plataforma personalizada en forma de T durante 2 horas diarias durante 7 días. Las evaluaciones conductuales incluyeron la prueba de natación forzada (FST, para la desesperación), la prueba de consumo de sacarosa (SCT, para anhedonia) y la prueba de campo abierto (OFT, para conducta exploratoria). A las 4 y 8 semanas tras el ictus, las ratas con PSD mostraron un tiempo de inmovilidad más largo en FST y menor preferencia por sacarosa en SCT que las ratas con ictus (P < 0,01). YNJYP revirtió estos comportamientos similares a la depresión (P < 0,01), con una eficacia comparable a la de la FXT. Este protocolo confirma la validez del modelo PSD y el potencial terapéutico de YNJYP, respaldado por rigurosos experimentos y análisis de datos.

Introducción

La depresión post-ictus (PSD) es una complicación común y tratable del ictus, que afecta significativamente al proceso de rehabilitación y a la calidad de vida de los pacientes. Los pacientes con PSD no solo sufren deficiencias funcionales físicas, sino que también sufren trastornos mentales como bajo estado de ánimo y pérdida de interés. Esto dificulta mucho la recuperación de las funciones neurológicas e incluso aumenta la tasa de mortalidad. Actualmente, la patogénesis de la DPP es compleja e involucra múltiples aspectos como la neurobiología, el desequilibrio de neurotransmisores y la respuesta inflamatoria. Es urgente explorar en profundidad métodos de intervención efectivos.

El objetivo general de este método es establecer un modelo fiable y reproducible de PSD en rata que imite estrechamente la condición humana combinando la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) con estrés leve crónico (CMS, principalmente sujeción conductual) y alojamiento de aislamiento, y utilizar este modelo para evaluar posibles terapias como la prescripción Yi-nao-jie-yu (YNJYP). La razón para desarrollar esta técnica surge de la necesidad de integrar tanto el insulto isquémico inicial como el posterior estrés psicológico crónico, reconocidos como componentes clave en la patogénesis de la PSD, en un único modelo estandarizado 1,2,3. En comparación con métodos alternativos, como los que dependen únicamente de extensos paradigmas CUMS, este protocolo ofrece un enfoque más enfocado y replicable empleando una forma específica de contención conductual diseñada para simular la restricción de movimiento que a menudo experimentan los pacientes conictus 3,4,5.

Este modelo contribuye a la literatura más amplia sobre la PSD al proporcionar un marco detallado y práctico para inducir y evaluar la PSD en roedores, abordando la necesidad de estandarización en la investigación preclínica. Los investigadores interesados en estudiar los efectos fisiopatológicos combinados de la isquemia cerebral y el estrés post-ictus, o en cribar intervenciones novedosas para la PSD, pueden considerar este protocolo apropiado, ya que delimita procedimientos claros para la creación de modelos, aplicación del estrés y evaluación conductual.

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Protocolo

El protocolo de estudio animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Medicina China de Pekín. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación

  1. Obtén 216 ratas machos Sprague-Dawley (SD) libres de patógenos específicos (SPF), que pesan entre 300 y 320 g.
  2. Acostumbra a las ratas al entorno de vivienda durante una semana antes del experimento.
    1. Mantener las condiciones de vivienda a 23 ± 3 °C, 45% ± 5% de humedad y un ciclo de 12 horas luz/oscuridad (luces encendidas a las 8:00 a.m., apagadas a las 8:00 p.m.).
    2. Alojar cinco ratas por jaula con acceso improvisado a comida y agua estándar estériles.
      NOTA: Minimizar el número de animales utilizados y reducir el sufrimiento mediante un manejo suave y procedimientos optimizados (por ejemplo, sujeciones ajustables para evitar la supresión respiratoria).

2. Cirugía de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO)

NOTA: Este paso describe el establecimiento del modelo MCAO/reperfusión (MCAO/R), modificado a partir de Bederson et al.6.

  1. Prepara a las ratas para la cirugía.
    1. Ayuno las ratas durante la noche (12 horas) antes de la cirugía (sin restricción de agua).
    2. Anestesiar a las ratas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg).
      NOTA: No se administraron analgésicos adicionales, ya que el pentobarbital sódico se utilizó únicamente como agente anestésico.
      PRECAUCIÓN: El pentobarbital sódico es un anestésico controlado. Maneja en una campana extractora, usa guantes y gafas de protección y guárdalo en un armario cerrado con llave según la normativa institucional.
  2. Asegura y prepara el lugar quirúrgico.
    1. Coloca a las ratas anestesiadas en posición supina y corrige sus extremidades.
    2. Afeita el pelaje del cuello y desinfecta la piel con un desinfectante adecuado (por ejemplo, etanol al 75%).
  3. Expone y prepara los vasos del cuello.
    1. Haz una incisión de 2-3 cm en la línea media en la piel del cuello y luego disecciona de forma directa las glándulas subcutáneas y la fascia. Separa la arteria carótida común (CCA), la arteria carótida interna (ICA) y la arteria carótida externa (ECA), que están formadas por las ramas de la CCA.
    2. Localiza el CCA, coloca dos suturas debajo como reserva, liga uno cerca del extremo del corazón y haz un nudo vivo cerca de la bifurcación del CCA con el otro.
    3. Utiliza una pinza arterial para cerrar el extremo distal del CCA cerca de la bifurcación.
    4. Localiza el ECA y liga con una sutura.
  4. Inserta la sutura para ocluir el MCA.
    1. Corta cuidadosamente una incisión en la pared entre el sitio de ligadura del extremo proximal del CCA y el punto de sujeción del clip de la arteria, luego inserta un tapón especial (sutura monofilamento) en esta incisión.
    2. Abre el clip arterial e inserta el tapón roscado en el ICA desde la horquilla hasta que se sienta una ligera resistencia, luego para (Figura 1).
      NOTA: La longitud de la sutura (18 mm ± 2 mm) es fundamental para una oclusión constante del MCA; Ajusta ligeramente según el peso de la rata (300-320 g).
  5. Induce isquemia y reperfusión.
    1. Mantén la isquemia durante 2 horas (estrictamente cronometrada con cronómetro).
    2. Después de 2 horas, retira suavemente la sutura para restaurar el flujo sanguíneo MCA, corta el exceso de sutura y retira el clip arterial.
  6. Cierra el sitio quirúrgico y supervisa la recuperación.
    1. Irriga la incisión con solución salina estéril y luego sutura el tejido subcutáneo y la piel.
    2. Colocar a las ratas en una jaula de recuperación (mantenida a 25 ± 1 °C) hasta que recuperen la conciencia; Monitoriza hemorragias o molestias durante 24 horas.
  7. Establece el grupo de operaciones simuladas.
    1. Realiza la misma disección del cuello y exposición de vasos que en los pasos 2.1-2.3.
    2. Inserta la sutura en el CCA solo por 5 mm, y luego retírala inmediatamente; Sutura la incisión sin oclusión MCA.

3. Agrupación de animales

  1. Dividir aleatoriamente las ratas en seis grupos (n = 36 por grupo inicialmente) para la puntuación neurológica.
    1. Grupo de ictus: solo MCAO, sin retención conductual ni tratamiento farmacológico.
    2. Grupo PSD: MCAO + contención conductual + alojamiento de aislamiento, sin tratamiento con drogas.
    3. Grupo FXT: MCAO + restricción conductual + alojamiento de aislamiento + gavage de fluoroxetina clorhidrato.
    4. Grupo YNJYP: MCAO + contención conductual + alojamiento de aislamiento + Yi-nao-jie-yu (YNJYP) gavage.
    5. Grupo en blanco: No se ha realizado ninguna operación.
    6. Grupo de operación simulado: Sin obstrucción de la arteria cerebral media.
  2. Excluye a las ratas con puntuaciones de 0 o 4 o a aquellas que murieron tras la cirugía.
    1. Realizar la puntuación neurológica Longa7 24 horas después del MCAO para seleccionar ratas cualificadas.
    2. Utiliza la escala de Longa de 5 puntos: 0 = sin déficit; 1 = flexión de la extremidad anterior cuando se levanta por la cola; 2 = caminar circular hacia el lado parético; 3 = caer hacia el lado parético; 4 = inconsciencia o incapacidad para caminar.

4. Administración de fluoroxetina clorhidrato (FXT) y YNJYP

  1. Prepara YNJYP y FXT.
    NOTA: YNJYP contiene seis materiales medicinales chinos: Ciwujia (raíces de Acanthopanax senticosus ) 30 g, Yujin (rizomas de Curcuma longa ) 10 g, Wuweizi (frutos de Schisandra chinensis ) 15 g, Zhizi (frutos de Gardenia jasminoides ) 10 g, Danshen (raíces de Salvia miltiorriza ) 15 g y Chuanxiong (Ligusticum chuanxiong rizomas) 15 g (proporcionados por el Departamento de Farmacia, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Pekín). Según estudiosprevios, se determinó que la dosis de administración intragástrica era de 9,92 g/(kg·d).
    1. Disuelva las cápsulas de clorhidrato de fluoxetina en agua destilada para alcanzar una concentración de 0,233 g/L cuando se utilicen. En función de la dosis adulta multiplicada por siete, fija la dosis para ratas en 2,33 mg/(kg·d).
  2. Administra drogas mediante gavage.
    1. Comienza el gvage el primer día post-MCAO y continúa hasta el final del experimento, realizando el procedimiento de forma constante por la mañana en todos los grupos.
    2. Administrar FXT al grupo FXT a 2,33 mg/(kg·d), YNJYP al grupo YNJYP a 9,92 g/(kg·d) y 0,9% de solución salina normal (10 mL/kg) a los grupos ictus y PSD.
      NOTA: Usa una aguja gavage de 1 mL; Asegúrate de que la aguja se inserte en el estómago (no en la tráquea) para evitar la aspiración.

5. Estrés leve crónico (contención conductual) combinado con alojamiento aislado

  1. Empieza con la sujeción conductual y el aislamiento en el día 7 post-MCAO (para evitar la fase aguda de ictus).
  2. Prepara la plataforma de sujeción personalizada en forma de T.
    1. La plataforma consta de una base (20 cm × 10 cm × 2,8 cm) y una zona de sujeción (22 cm × 6,6 cm).
    2. La zona de sujeción contiene ranuras para fijar la cabeza y las extremidades de la rata y tres correas ajustables para adaptarse a diferentes tamaños de rata (Figura 2, Figura 3 y Figura 4).
      NOTA: La plataforma está modificada a partir de Chen3 y Tian4, con ranuras añadidas para las extremidades anteriores para simular la postura parética de los pacientes con ictus.
  3. Realiza la sujeción diaria.
    1. Selecciona aleatoriamente una ventana de 2 horas cada día (por ejemplo, de 9:00 a 11:00 o de 14:00 a 16:00) para evitar el sesgo circadiano.
    2. Asegura cada rata a la plataforma usando ranuras y correas; Ajusta la tensión para evitar que se esfuerce pero no la supresión respiratoria.
    3. Mantén la sujeción durante 2 horas seguidas durante 7 días consecutivos.
  4. Ratas domésticas en aislamiento.
    1. Transfiere ratas de los grupos PSD, FXT y YNJYP de alojamientos grupales (cinco ratas por jaula) a jaulas individuales al inicio de la restricción conductual.
    2. Mantener la vivienda individual hasta que se complete la contención conductual (día 14 después del MCAO).

6. Prueba de consumo de sacarosa (SCT)

NOTA: Selecciona al azar seis ratas de cada grupo a las 2, 4 y 8 semanas post-MCAO. Analiza todas las ratas en el orden SCT, OFT y FST.

  1. Prepara ratas para la prueba.
    1. Ayuno y priva a las ratas de agua durante 24 horas antes de la prueba.
    2. Asegúrate de que la temperatura de la sala de pruebas (23 ± 2 °C) y la iluminación coincidan con el entorno de la carcasa.
  2. Haz la prueba.
    1. Coloca dos botellas (de 150 mL cada una) en cada jaula: una con agua del grifo y la otra con solución de sacarosa al 1%.
    2. Después de 1 hora de beber libremente, anota los volúmenes de solución de sacarosa y agua consumida.
  3. Calcula la preferencia de sacarosa.
    1. Utiliza la fórmula: Preferencia por sacarosa (%) = (Volumen de solución de sacarosa consumido / Volumen total consumido) × 100%.
    2. Intercambia las posiciones de las dos botellas a mitad del periodo de consumo para eliminar el sesgo de posición.

7. Prueba en campo abierto (OFT)

NOTA: Selecciona el mismo lote de ratas de cada grupo utilizado para el FST a las 2, 4 y 8 semanas. Ayuno y priva a las ratas de agua durante 24 horas antes de la prueba para mantener condiciones fisiológicas consistentes.

  1. Prepara el aparato de campo abierto.
    1. Usa una caja cuadrada negra con el suelo dividido en 25 cuadrículas iguales.
    2. Mantén la sala de pruebas tranquila y tenuemente iluminada.
  2. Haz la prueba.
    1. Coloca cada rata en la cuadrícula central de la caja y pon un temporizador de 5 minutos.
    2. Registrar la actividad horizontal (número de cruces de cuadrícula con tres cuartas partes de las patas en una nueva cuadrícula) y la actividad vertical (número de traseros con dos cuartas partes de las patas fuera del suelo mediante observación manual usando fichas de mano).
    3. Registra el tiempo que pasas en las cuadrículas centrales y la frecuencia de acicalamiento (opcional, para obtener información conductual adicional).

8. Prueba de natación forzada (FST)

NOTA: Selecciona el mismo lote de ratas de cada grupo utilizado para el FST a las 2, 4 y 8 semanas. Ayuno y priva a las ratas de agua durante 24 horas antes de la prueba para mantener condiciones fisiológicas consistentes.

  1. Prepara el aparato de prueba.
    1. Llena un cilindro de cristal con la cantidad adecuada de agua, asegurándote de que el nivel del agua sea lo suficientemente alto para que la rata no pueda sostenerse tocando el fondo con las patas.
    2. Ajusta la temperatura del agua a 25 ± 1 °C.
  2. Haz la prueba.
    1. Coloca cada rata en el cilindro y déjala nadar durante 5 minutos.
    2. Registra el tiempo total de inmovilidad durante los 5 minutos.
    3. Define 'inmovilidad' como flotación pasiva (solo movimientos mínimos para mantener el morro fuera del agua) y 'actividad' como remar con las extremidades o arañar la pared.
  3. Cuida de ratas después de la prueba.
    1. Saca la rata del cilindro tras 5 minutos, sécala con una toalla y colócala bajo una lámpara de calor (30 ± 2 °C) durante 30 minutos para evitar hipotermia (Figura 5).

9. Análisis estadístico

  1. Organiza los datos como media ± desviación estándar (media ± DS).
  2. Analizar datos usando el software SPSS versión 20.0.
  3. Antes de realizar pruebas paramétricas, comprueba los datos para comprobar la normalidad (usando la prueba de Shapiro-Wilk) y la homogeneidad de las varianzas (usando la prueba de Levene). Los datos de cada grupo se ajustan a una distribución normal y satisfacen la homogeneidad de varianza.
    1. Utiliza análisis unidireccional de la varianza (ANOVA unidireccional) para comparar medias muestrales entre grupos, combinadas con las pruebas de menor diferencia significativa (LSD) y Student-Newman-Keuls (SNK). Utiliza el test de Welch cuando las varianzas son desiguales.
  4. Fija la significación estadística en p < 0,05.

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Resultados

En este estudio se establecieron un total de 5 grupos experimentales para la detección relevante. Tras el análisis estadístico de los datos conductuales de cada grupo de ratas, se encontró que en la cuarta semana del experimento, el tiempo de inmovilidad de las ratas del grupo PSD en la FST aumentó significativamente en comparación con las ratas del grupo ictus, y la diferencia entre ambos grupos fue estadísticamente significativa (P < 0,01); al mismo tiempo, la preferencia de las ratas ...

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Discusión

En el proceso de construcción del modelo de isquemia cerebral de rata, existen varios métodos de modelado diferentes, incluyendo el método de ligadura, el método de craneotomía, el método de asfixia y el método de oclusión por alambre. En comparación con los tres métodos de modelado: ligadura, craneotomía y asfixia, el método de oclusión por alambre demuestra ventajas significativas y únicas. Estas ventajas residen principalmente en tres aspectos clave: la naturaleza mínimamente invasiva...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Yuankai Su y Yonghao Sun escribieron el manuscrito, incluyendo la interpretación de los resultados y la sección de discusión. Huiling Tian realizó los experimentos y analizó los datos. Ning Ding y Xin Wang revisaron el manuscrito. Zitong Yang y Jingyao Zhao contribuyeron a la búsqueda de datos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ratas Sprague-Dawley machos adultosVital River Laboratory Animal Technology, Pekín, ChinaNo. SCXK2012-0001300– 320 g
Cápsulas de cloruro de fluoxetinaPatheon Francia, Jiangsu, China0943A
Gránulos de YNJYPel Departamento de Farmacia, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de PekínCasera
Caja abierta para prueba en campo abiertoCasera -
Pentofenobarbital sódicoSigma Corporation of AmericaP3761-5
El hilo de oclusiónBeijing Shadong Biotechnology Co., Ltd2838-A4
Depósito de agua para experimento de natación forzadaCasera -

Referencias

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