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Artículo de investigación

Mecanismo de la decocción de Jianpi Shengxue en el alivio de la mielosupresión inducida por ciclofosfamida en ratones

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DOI:

10.3791/69542

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2 de enero de 2026

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1Hunan University of Chinese Medicine, 2Department of Traditional Chinese Medicine /Integrative Oncology, Hunan Cancer Hospital/The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University

En este artículo

Resumen

Este protocolo explica sistemáticamente cómo la decocción de Jianpi Shengxue mitiga la mielosupresión inducida por ciclofosfamida mediante un enfoque integrado de farmacología en redes y experimentos en animales, revelando sus mecanismos multi-objetivo y su potencial como terapia adyuvante.

Resumen

El artículo tiene como objetivo investigar cómo la Decocción Jianpi Shengxue (JPSXD) alivia la mielosupresión inducida por quimioterapia mediante farmacología en redes y experimentos con animales. Para ello, se analizaron componentes y objetivos clave, y se construyeron la Red de Interacción Proteína-Proteína (PPI) y redes hierba-componente-objetivo. Gene Ontology (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) identificaron vías principales. Se estableció un modelo de mielosupresión inducido por ciclofosfamida (CTX) en 60 ratones C57/BL6. JPSXD se administró en diferentes dosis durante 7 días. Se evaluaron los hemogramas periféricos, citocinas (trombopoietina [TPO], eritropoietina [EPO], factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos [GM-CSF]), índice timo, morfología de la médula ósea, células CD34+ y expresión de AKT1, JAK2 y EGFR. El análisis de redes identificó 172 compuestos y 454 objetivos, destacando las vías PI3K-Akt y JAK-STAT. In vivo, CTX redujo los niveles de leucocitos y proteínas de señalización, mientras que JPSXD restauró los recuentos, aumentó AKT1, JAK2 y EGFR, y mejoró el índice del timo (p < 0,05). JPSXD de dosis medias y altas aumentó el TPO, EPO, GM-CSF, las células CD34+ y mejoró la estructura de la médula ósea, siendo la dosis alta el efecto más fuerte. En conclusión, JPSXD alivia la mielosupresión mediante la regulación multi-objetivo y múltiples vías, lo que respalda su potencial como terapia complementaria para la leucopenia inducida por quimioterapia.

Introducción

La quimioterapia es una piedra angular en el tratamiento de diversas malignidades, principalmente al inhibir la proliferación y supervivencia de célulascancerosas 1,2, prolongando así la supervivencia del paciente. Sin embargo, debido a la falta de selectividad en el tratamiento de tejidos normales, los fármacos de quimioterapia suelen causar daños graves en células y tejidos sanos, lo que provoca una serie de efectosadversos 3. Uno de los efectos secundarios más comunes y graves de la quimioterapia es la mielosupresión, caracterizada por una reducción en la producción de glóbulos sanguíneos, incluidos los glóbulos blancos (glóbulos blancos), glóbulos rojos (glóbulos rojos) y plaquetas (PLTs)2,4. La mielosupresión perjudica gravemente el sistema de defensa inmunitaria, aumentando el riesgo de infecciones, hemorragias, anemia y otras complicaciones. También disminuye significativamente la calidad de vida de los pacientes e incluso puede ser potencialmente mortal5. Por tanto, aliviar y prevenir la mielosupresión inducida por la quimioterapia es fundamental para mejorar la tolerancia de los pacientes a la quimioterapia y la supervivencia general.

Los tratamientos clínicos actuales para la mielosupresión implican principalmente factores de crecimiento hematopoyéticos como el factor estimulante de colonias de granulocitos [G-CSF], la eritropoyetina [EPO]) y la terapiatransfusional 6,7. Sin embargo, estos enfoques suelen asociarse a altos costes, posibles efectos secundarios y eficacia limitada. Como resultado, explorar métodos más seguros y efectivos para prevenir y aliviar la mielosupresión sigue siendo un foco principal de investigación. En los últimos años, la medicina tradicional china (MTC) ha recibido una atención significativa por su papel en el tratamiento del cáncer y en el manejo de los efectos secundarios inducidos por laquimioterapia 8,9. Se cree que muchas formulaciones de MTC tienen efectos tonificantes y reguladores del sistema inmunitario, como la decocción10 de Shengxuebao, las tabletas 11 de Dihuang Shengbai y los compuestos de ginsenósidos12, que no solo protegen las células normales y reducen los efectos secundarios tóxicos, sino que también mejoran la eficacia antitumoral.

La Decocción Jianpi Shengxue (JPSXD) es una fórmula clásica de MTC que ejemplifica los principios terapéuticos de tonificar el Qi y nutrirla sangre 13. Esta fórmula es una modificación sofisticada de la Decocción Sijunzi combinada con Er Zhi Wan, integrando los efectos sinérgicos de múltiples hierbas para abordar la deficiencia de Qi ysangre 14. La fórmula consiste en ginseng (Ren Shen), astrágalo (Huang Qi), epimedium (Yin Yang Huo), atractylodes (Bai Zhu), ñame (Shan Yao), salvia (Dan Shen), rehmannia preparada (Shu Di Huang), semilla de dodder (Tu Si Zi), baúl de loba (Gou Qi Zi), ligustrum (Nv Zhen Zi), angélica (Dang Gui), cebada frita (Chao Mai Ya), molleja de pollo frito (Chao Ji Nei Jin), cáscara seca de mandarina (Chen Pi), semilla de coix (Yi Yi Ren) y varias otras hierbas. Cada hierba desempeña un papel específico en la fórmula, siguiendo el principio de la MTC de hierbas soberanas, ministras, asistentes y guías, lo que garantiza un efecto terapéutico equilibrado y dirigido.

La Decocción Sijunzi, una fórmula fundamental en la MTC, es reconocida por su capacidad para tonificar el Qi y fortalecer el bazo. Se ha utilizado ampliamente para tratar condiciones asociadas con la deficiencia de Qi y sangre, como fatiga, falta de apetito y debilitamiento de la inmunidad. Estudios farmacológicos modernos han demostrado que la Decocción Sijunzi mejora la función inmunitaria, promueve la hematopoyesis y mejora las capacidades de autorreparación delcuerpo 15,16. Sobre esta base, JPSXD incorpora hierbas adicionales para mejorar aún más su eficacia en la nutrición sanguínea y abordar deficiencias más complejas. Por ejemplo, la rehmannia y la angélica preparadas son hierbas clave que nutren la sangre17, mientras que el astrágalo y el ginseng actúan en sinergia para aumentar el Qi y mejorar la vitalidadgeneral 18.

Estudios recientes han destacado los posibles efectos antitumorales de JPSXD, sugiriendo que su enfoque multicomponente y multi-objetivo podría inhibir el crecimiento tumoral y mejorar la eficacia de los tratamientos convencionales contrael cáncer 19,20. La capacidad de la fórmula para modular las respuestas inmunitarias y mejorar la función hematopoyética la hace especialmente valiosa para apoyar a pacientes sometidos a quimioterapia o radioterapia, que a menudo experimentan deficiencia de Qi y sangre como efecto secundario deltratamiento 21. Además, la inclusión de hierbas como la salvia y el epimedium ha demostrado mejorar la microcirculación y potenciar los mecanismos de reparación celular, contribuyendo a los beneficios terapéuticos generales de lafórmula 22.

Estudios farmacológicos modernos han demostrado que cada hierba individual en JPSXD posee actividades farmacológicas relacionadas con la función hematopoyética, la antimielosupresión, la inmunomodulación y la antioxidación, así como la mejora microcirculatoria, proporcionando apoyo indirecto a la investigación para el uso de JPSXD en el alivio de la mielosupresión inducida por quimioterapia. La Tabla 1 resume los principales efectos farmacológicos de cada hierba junto con las referencias correspondientes, con especial atención a estudios que investigan la hematopoyesis, la actividad antimielosupresora, la inmunomodulación y las propiedades antioxidantes o que potencian la microcirculación. La compleja sinergia de componentes en JPSXD implica tanto interacciones cooperativas como antagónicas entre las hierbas, dirigiéndose a múltiples vías para lograr un efecto terapéutico holístico. Por ejemplo, mientras que el ginseng y el astrágalo trabajan juntos para tonificar el Qi, la salvia y la rehmannia preparada colaboran para nutrir la sangre y mejorar la circulación. Al mismo tiempo, hierbas como la piel de mandarina seca y la cebada frita ayudan a regular la digestión y a prevenir el estancamiento, asegurando que los efectos tonificantes de la fórmula sean absorbidos y utilizados eficazmente por el cuerpo. Este enfoque multifacético se alinea con la filosofía de la MTC de tratar la causa raíz de la enfermedad mientras aborda sus síntomas.

En conclusión, JPSXD es una fórmula de MTC bien equilibrada y científicamente respaldada que encarna los principios del Qi y la desintoxicación sanguínea. Sus posibles aplicaciones para mejorar la inmunidad, promover la hematopoyesis y apoyar la terapia antitumoral la convierten en una valiosa adición tanto a las prácticas médicas tradicionales como modernas. Sin embargo, sigue faltando evidencia clínica de alta calidad que evalúe directamente la eficacia de JPSXD para aliviar la mielosupresión inducida por quimioterapia. Se necesita más investigación para esclarecer sus mecanismos subyacentes y optimizar sus estrategias de aplicación clínica. Por ello, este estudio pretende proporcionar pruebas de concepto sobre los posibles efectos terapéuticos de JPSXD desde una perspectiva mecanicista preclínica.

La farmacología en red, con su naturaleza sistémica e integradora, se ha utilizado ampliamente para identificar los principios activos de los medicamentos chinos y esclarecer sus mecanismos deacción 24,25. En este estudio, se empleó la farmacología de redes para analizar las posibles vías de señalización y los objetivos clave afectados por JPSXD en el contexto de la mielosupresión. Además, se estableció un modelo murino de mielosupresión inducido por ciclofosfamida (CTX) para evaluar indicadores relevantes y evaluar los efectos de JPSXD sobre la mielosupresión. También se realizó una validación preliminar de los principales objetivos y vías identificados mediante la farmacología de redes. Este es el primer estudio que integra sistemáticamente la farmacología de redes con experimentos en animales para esclarecer el mecanismo molecular por el cual JPSXD alivia la mielosupresión inducida por quimioterapia mediante la regulación multi-diana de las vías de señalización, como la vía PI3K-AKT, cubriendo así un vacío en la comprensión mecanicista de los efectos protectores hematopoyéticos de esta fórmula compuesta.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de estricta conformidad con el Reglamento de Administración de Animales de Laboratorio y las directrices éticas del Centro de Animales Experimentales del Hospital Oncológico de Hunan. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal del Hospital Oncológico de Hunan (Nº de aprobación: KNZY-202416). A lo largo del estudio, los investigadores hicieron todo lo posible por minimizar el número de animales utilizados y aliviar su sufrimiento.

Preparación animal
Un total de 60 ratones machos C57/BL6 de 10 semanas se obtuvieron de Hunan Slack Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. (Licencia nº: SCXK [Hu] 2021-0002). Todos los ratones fueron alojados en el Centro Experimental de Animales del Hospital Oncológico de Hunan bajo condiciones ambientales controladas: temperatura: 23 ± 2 °C, humedad: 50% ± 10%, y un ciclo de 12 horas luz/oscuridad (8:30-20:30). Los ratones tenían acceso improvisado a comida y agua. Antes de la experimentación, se aclimataban al entorno mediante manipulación diaria durante 5 minutos en un periodo de 3 días. Tras la aclimatación, los 60 ratones fueron estratificados por peso corporal y asignados aleatoriamente en seis grupos (n = 10 por grupo) utilizando una tabla de números aleatorios generada por ordenador. Los grupos incluían: control en blanco, modelo, control con solución salina normal (NS), JPSXD de dosis alta (40 mg/kg), JPSXD de dosis media (30 mg/kg) y JPSXD de dosis baja (20 mg/kg). El proceso de aleatorización aseguró que no hubieran diferencias significativas en el peso corporal medio entre grupos (p > 0,05). La secuencia de aleatorización fue generada y ejecutada por investigadores no involucrados en procedimientos experimentales posteriores para minimizar el sesgo.

Preparación de materiales
Seguridad y eliminación de residuos: Este estudio incluyó CTX, un agente quimioterapéutico altamente tóxico. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en estricta conformidad con el Reglamento sobre la Gestión de la Seguridad de Sustancias Químicas Peligrosas y los estándares de laboratorio de Bioseguridad Nivel 2. Las precauciones específicas incluían el uso de ropa protectora desechable, guantes de nitrilo, respiradores N95 y gafas protectoras por todo el personal. La preparación y administración de CTX se realizaban dentro de un gabinete de bioseguridad de Clase II. La preparación de la solución de inyección CTX se realizó en una campana extractora utilizando instrumentos dedicados para evitar la formación de aerosoles. Los objetos punzantes y los objetos contaminados con CTX, como jeringuillas y guantes, se desechaban en recipientes para objetos punzantes y resistentes a la punción. Otros materiales contaminados (por ejemplo, cama o tejidos animales) fueron inactivados por inmersión en hipoclorito de sodio al 10% durante 24 horas y posteriormente incinerados por un proveedor certificado de eliminación de residuos médicos. En caso de vertido de CTX, la zona se cubría inmediatamente con algodón absorbente y se neutralizaba con una solución de tiosulfato sódico al 1%. El incidente fue comunicado al supervisor de seguridad.

Medicamentos y reactivos: La inyección CTX se obtuvo de Baxter Oncology GmbH, Alemania (Lote nº: HJ20160467). El JPSXD fue preparado por el Departamento de Medicina Tradicional China del Hospital Oncológico de Hunan. Consistía en 15 hierbas tradicionales —Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Epimedium brevicornum, Atractylodes macrocephala, Dioscorea opposita, Salvia miltiorrhiza, Rehmannia glutinosa, Cuscuta chinensis, Lycium barbarum, Ligustrum lucidum, Angelica sinensis, malta frita, revestimiento de molleja de pollo, cáscara de mandarina seca y semilla de Coix— combinadas según las proporciones clásicasde compatibilidad 20. La decocción se concentró hasta una concentración final de 3 kg/L (es decir, 3 g/mL). Antes del gage, el concentrado se diluía con NS para alcanzar las concentraciones requeridas para cada grupo de dosis: 4 mg/mL para el grupo de dosis altas (40 mg/kg), 3 mg/mL para el grupo de dosis medias (30 mg/kg) y 2 mg/mL para el grupo de dosis bajas (20 mg/kg)26. El volumen de gavage se calculó como 0,1 mL por cada 10 g de peso corporal, resultando en un volumen final de administración de 0,2-0,25 mL por ratón (basado en un rango de peso de 20-25 g)27.

Kits ELISA: Se utilizaron kits ELISA comercialmente disponibles para el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), EPO y trombopoyetina (TPO) en ratones. Las muestras de suero se diluyeron 1:5 en un tampón PBS (pH 7,4) antes de la prueba. Los estándares se reconstituyeron en 100 μL por pozo.

Anticuerpo secundario: El IgG anticonejo de cabra conjugado con HRP se diluyó 1:5000 (concentración final: 0,04 μg/mL) en un tampón TBST que contenía 5% de leche seca desnatada y 0,05% Tween-20. La solución se preparó frescamente y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora.

Se utilizaron anticuerpos primarios para Western blot: GAPDH (policlonal de conejo), AKT (policlonal de conejo), JAK2 (monoclonal de conejo) y EGFR (monoclonal de ratón). Todos los anticuerpos se diluyeron en un tampón TBST que contenía un 5% de BSA: GAPDH (1:1000), AKT (1:1000), JAK2 (1:800) y EGFR (1:800). El volumen de incubación era de 100 μL por membrana.

Fijador de tejido: Se preparó una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% disolviendo polvo de PFA en PBS (pH 7,4). Los pañuelos se fijaron durante 24 horas.

Solución de tinción de hematoxilina y eosina (H&E): Se prepararon la solución de hematoxilina (0,1% de hematoxilina Harris) y la solución de eosina Y (0,5%) según los protocolos estándarde patología 28. La duración de la tinción fue de 5 minutos para hematoxilina y 3 minutos para eosina.

Buffer bloqueador de inmunofluorescencia: Se utilizó buffer PBS que contenía un 10% de suero de cabra y un 1% de BSA para el bloqueo, con una incubación de 30 minutos.

Amortiguador de dilución de anticuerpos para inmunofluorescencia: Los anticuerpos primarios (CD34+, TPO, EPO, GM-CSF) para la inmunofluorescencia se diluyeron en un tampón PBS que contenía un 1% de BSA, siguiendo la proporción de dilución recomendada por el fabricante (1:200), dando lugar a una concentración final de 2,5 μg/mL. El volumen de incubación fue de 50 μL por sección de tejido.

Inducción de un modelo animal
60 ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 10 por grupo): control en blanco, modelo, dosis alta, dosis media, dosis baja y control NS. Excepto el grupo de control en blanco, todos los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de CTX (20 mg/kg) una vez al día durante 3 días consecutivos para establecer un modelo de mielosupresión. Todos los ratones modelo mostraron leucocitos < 1,8 × 109/L, PLT < 85 × 10⁹/L y reducción del >55% en células nucleadas de médula ósea a las 24 horas tras la inyección final. Este protocolo se alinea con los modelos establecidos de mielosupresión inducidapor CTX 29,30. Tras la inyección, se monitorizó diariamente a los ratones para detectar su estado general, incluyendo el nivel de actividad, la apariencia del pelaje y los cambios en el peso corporal. Desde el inicio del modelado hasta el final del experimento, el peso corporal se registró a la misma hora cada día mediante una balanza electrónica. La tasa de cambio de peso corporal se calculó de la siguiente manera: (peso final / peso inicial) x 100%, para evaluar el estado fisiológico general y el posible efecto protector de JPSXD. Tras la inyección, los ratones fueron alojados en jaulas ventiladas individualmente (IVC), cada una claramente etiquetada como contaminada con CTX. La ropa de cama se cambiaba cada dos días y toda la ropa de cama usada se eliminaba conforme a los protocolos de residuos peligrosos descritos anteriormente.

Administración intragástrica
Los ratones de los grupos de dosis alta, media y baja recibieron JPSXD mediante gavage en dosis de 40 mg/kg, 30 mg/kg y 20 mg/kg, respectivamente. El grupo control salino recibió un volumen igual de NS. Se prepararon soluciones de gavage a concentraciones de 4 mg/mL, 3 mg/mL y 2 mg/mL, respectivamente, y se administraron a un volumen de 0,1 mL por cada 10 g de peso corporal. Todos los ratones fueron cazados 2 veces al día durante 7 días consecutivos. El grupo control de solución salina recibió entre 0,2 y 0,25 mL por ratón de NS. No se trató a los grupos de blank ni modelo. La ausencia de tos o de esfuerzo durante el uso indicaba una técnica correcta de administración.

Extracción de sangre y preparación del suero
Altercer día tras la inyección de CTX, se recogieron 0,2 mL de sangre de la vena caudal para evaluar el éxito del establecimiento del modelo midiendo el recuento de células sanguíneas periféricas utilizando un analizador hematológico totalmente automatizado. A las 24 horas después del último ataque de JPSXD, se recogió sangre del seno orbitario de ratones seleccionados al azar (n = 10 por grupo). Una parte de la sangre se utilizó para un análisis completo del hemograma, mientras que el resto se procesó para la preparación del suero. Las muestras se centrifugaron a 3.000 x g durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante (una capa superior clara y amarilla pálida) se recogía como suero y se alicuaba para su almacenamiento a -80 °C en ensayos ELISA posteriores y pruebas de función hepática/riñón. Se observó que la capa de suero estaba claramente separada de la capa de células sanguíneas, sin signos de hemólisis ni turbidez. Los parámetros hematológicos medidos incluyeron los niveles de GLÓBULOS BLANCOS, GLÓBULOS ROJOS, PLT y hemoglobina (Hb).

Evaluación de la función hepática y renal
Se utilizó un analizador bioquímico totalmente automatizado para medir marcadores de función hepática sérica —alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST)— y marcadores de función renal: nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina (Cre). Todos los procedimientos seguían el protocolo operativo estándar del instrumento. Específicamente, se mezclaron 100 μL de suero con los correspondientes kits de ensayo (ALT, AST, BUN y Cre) y se incubaron a 37 °C durante 5 minutos. La absorbancia se midió en 340 nm. Cada muestra se analizó en duplicado y se utilizó el valor medio para el análisis.

Cálculo del índice de órganos
A las 24 horas de la administración final de la JPSXD, los ratones fueron eutanasiados mediante inhalación gradual de dióxido de carbono (CO2) (caudal: 20% volumen de cámara/min) seguida de luxación cervical como métodosecundario 31. Inmediatamente después de la eutanasia, el hígado, los riñones, el bazo y el timo fueron extraídos asépticamente a través de una incisión ventral en la línea media. Los órganos se diseccionaban suavemente para liberarlos de los tejidos conectivos y la grasa circundantes, y luego se enjuagaban con solución fisiológica normal (NS) helada para eliminar la sangre residual. Los órganos se secaron con papel de filtro prepesado bajo presión estandarizada (3 prensas suaves) y se pesaron inmediatamente sobre una balanza electrónica calibrada (precisión: ±0,1 mg) a temperatura ambiente (22 ± 1°C).

Todos los procedimientos se realizaron en una bandeja de acero inoxidable preenfriada para minimizar la autólisis. El índice de órganos se calculó dividido en peso del órgano (mg) por el peso corporal (g) para evaluar los efectos del JPSXD en órganos principales. Partes de cada tejido se reservaron para el análisis de Western blot, mientras que el resto de las muestras se fijó en un PFA al 4% para su posterior evaluación histológica.

ELISA
Las concentraciones séricas de TPO, EPO y GM-CSF se midieron utilizando kits ELISA según las instrucciones del fabricante. Todos los pasos de centrifugación, incluido el lavado de muestras y la reconstitución de reactivos, se realizaron a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 minutos. Los pasos de lavado se realizaron utilizando tampón PBST (PBS que contiene 0,05% Tween-20), añadiendo 300 μL de solución de lavado por pozo y repitiéndose 3 veces. Tras el lavado, no quedaba líquido residual en el fondo de los pozos. Tras el desarrollo del color, se observaba un precipitado azul distintivo. La absorbancia se midió a 450 nm usando un microlector de placas tras terminar la reacción.

Teñido H&E
Tras la eutanasia, se extrayeron el timo y el fémur. El timo se pesaba para calcular el índice del timo (peso del timo [mg]/peso corporal [g]). Tras el pesaje, parte del timo se utilizó para el análisis de Western blot, mientras que el resto, junto con el fémur, se fijó en un 4% de PFA. Las muestras de fémur sufrieron deshidratación graduada por etanol (70%, 80%, 95% y 100% cada una durante 1 hora). La deshidratación adecuada se indicaba por un aspecto uniformemente blanco, sin ablandamiento ni deformación. Los bloques de tejido incrustados en parafina se seccionaron con un grosor de 4 μm utilizando un microtomo rotatorio equipado con cuchillas de carburo de tungsteno de alta precisión (Tipo H31). Las secciones se flotaban en un baño maria a 40 °C que contenía una solución de gelatina al 0,5% para eliminar arrugas, y luego se montaban sobre portaobjetos de microscopio. Todas las secciones mostraron morfología intacta, bordes lisos y translucidez uniforme bajo microscopía óptica, lo que confirmó una calidad óptima de sección. Se realizó teñido H&E, seguido de montaje con un medio acuosode montaje 28. Tras la tinción, los núcleos aparecieron azules y el citoplasma rosa, con una arquitectura celular bien definida bajo observación microscópica mediante microscopio invertido. Se realizó un análisis histomorfológico mediante software. Para cada sección teñida con H&E, se seleccionaron tres campos aleatorios con una ampliación de 200x. El software cuantificó automáticamente el número de células nucleadas por unidad de área tras la delimitación manual de la región de interés, y los resultados se expresaron como media ± desviación estándar (x̄ ± s).

Western blot
Los tejidos del timo (50 ± 2 mg/muestra) se homogeneizaron en un tampón RIPA helado que contenía un cóctel inhibidor de proteasa 1x en una proporción precisa de 100 mg de tejido por 1 mL de tampón, utilizando un homogeneizador motorizado de pelos de péril equipado con morteros libres de RNasa. La homogeneización se realizó sobre hielo con 15 pulsos (1 s pulso/2 s de pausa), seguida de una incubación de 30 minutos sobre hielo con vórtices cada 10 minutos. El homogenado se centrifugó a 12.000 x g durante 20 minutos a 4 °C, y el sobrenadante resultante se recogió para cuantificación de proteínas. El sobrenadante parecía claro y transparente, libre de precipitados ni capas lipídicas. La concentración de proteínas se midió utilizando un kit de análisis de proteínas BCA, con un rango de curva estándar de 0 a 2000 μg/mL. Se realizó Western blot para evaluar los niveles de expresión de AKT1, JAK2 y EGFR en el tejido timo, utilizando GAPDH como control interno. Tras la electroforesis y la transferencia de membrana, el marcador proteico (10-200 kDa) mostró bandas claras y las bandas objetivo alineadas con los pesos moleculares esperados (AKT1: 60 kDa, JAK2: 130 kDa, EGFR: 170 kDa, y GAPDH: 37 kDa).

El análisis densitométrico de las bandas Western blot se realizó mediante software. Antes del análisis, se inspeccionaron visualmente las bandas para confirmar la ausencia de difusión o difusión. El procedimiento de análisis incluyó: selección manual de regiones de bandas objetivo tras la importación de imágenes, con detección automática de bordes por parte del software, seguida de una rescusión local de fondo utilizando regiones adyacentes a las bandas para corregir los valores de gris. Después, se calculó la razón de valores de gris entre la proteína objetivo y el control interno para la cuantificación relativa. La fórmula de normalización utilizada fue:

Expresión relativa de la proteína objetivo = (valor gris de la banda objetivo −fondo local) / (valor gris del control interno −fondo local)

Inmunohistoquímica
Se realizó tinción inmunohistoquímica en secciones fémures. Las rebanadas se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 10 minutos, seguidas de bloqueo durante 30 minutos. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C, y los anticuerpos secundarios se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la tinción, se observaron señales positivas distintas con bajo fondo y sin tinción inespecífica bajo un microscopio óptico. Las láminas se montaban utilizando un medio anti-desvanecimiento que contenía DAPI, que teñía los núcleos de azul. A continuación, se evaluó la expresión de CD34+, TPO, EPO y GM-CSF. Las imágenes de inmunohistoquímica se analizaron utilizando software de patología digital (Versión 2.1.0). Antes del análisis, se verificó que las imágenes estaban libres de sobreexposición o degradación de la señal. El procedimientode análisis 32incluyó:

Selección del modelo: Se utilizó un modelo preentrenado de segmentación de médula ósea (basado en U-Net) para identificar automáticamente las regionestisulares 33.
Establecimiento de umbral: Se definieron umbrales positivos de señal en función del grupo control negativo. Las regiones con intensidad cromogénica superior a la media de fondo en tres desviaciones estándar se clasificaron como positivas.
Definición de ROI: El software dividió automáticamente cada campo en regiones de cuadrícula de 500 × 500 μm y calculó el número de celdas positivas por unidad de área (recuento positivo de celdas/área de campo).
Exportación de datos: Se generó automáticamente un informe estadístico de densidad celular positiva.

Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS (Versión 22.0). Los datos se expresaban como x̄ ± s. Antes de las comparaciones entre grupos, la normalidad se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk, y la homogeneidad de las varianzas se evaluó con la prueba de Levene. Si se confirmaron tanto la distribución normal (p > 0,05) como la homogeneidad de varianza (p > 0,05), se utilizó ANOVA unidireccional para comparaciones de grupos. Se realizaron comparaciones múltiples post hoc utilizando el método de Diferencia Mínima Significativa (LSD); para controlar el error de Tipo I, todos los valores p post hoc se ajustaron usando la corrección de Bonferroni, considerándose estadísticamente significativos los p < 0,05 ajustados.

Si los datos no cumplían con las suposiciones de normalidad u homogeneidad de varianza (p ≤0,05 en cualquiera de las pruebas), se aplicaba la prueba de Kruskal-Wallis, seguida por la prueba de Dunn para análisis post hoc con corrección de Bonferroni. Todos los gráficos estadísticos y visualizaciones se generaron usando GraphPad Prism (Versión 9.0). El nivel de significación se estableció en α = 0,05. Todos los valores p reportados fueron valores ajustados. Se identificaron valores atípicos mediante la prueba de Grubbs (α = 0,05) y se excluyeron solo si eran claramente atribuibles a un error experimental. Todos los datos restantes se incluyeron en el análisis final. Los resultados se presentan como x̄ ± s.

Metodología de farmacología de redes
Este estudio empleó un enfoque de farmacología en redes para explorar los posibles mecanismos mediante los cuales JPSXD alivia la mielosupresión inducida por quimioterapia. En primer lugar, los componentes químicos de JPSXD y sus objetivos correspondientes fueron obtenidos de la Plataforma de Datos y Análisis de Sistemas de Farmacología de Medicina Tradicional China (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php). Los criterios de cribado se establecieron de la siguiente manera: biodisponibilidad oral (OB) ≥30% y semejanza farmacológica (DL) ≥0,18. Para compuestos no incluidos en la base de datos TCMSP, la predicción de objetivos se realizó utilizando la plataforma SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch/).

Para asegurar que los compuestos seleccionados cubrieran los principales componentes bioactivos del JPSXD, se hizo referencia a la Farmacopea de la República PopularChina 34. Específicamente, identificamos compuestos marcadores como ginsenósidos, astragalosido IV, icariina y ácidos salviánólicos revisando las secciones de Identificación y Ensayo de cada hierba. Estos compuestos, comúnmente usados como marcadores de controlde calidad 35, tienen estructuras químicas definidas y requisitos cuantitativos. Para mayor precisión, cruzamos las Notificaciones Generales y Apéndices de la Farmacopea para confirmar convenciones de denominación y métodos analíticos (por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento, HPLC). El análisis confirmó que los criterios de cribado (OB ≥30%, DL ≥0,18) capturaron eficazmente los compuestos principales de la fórmula36, incluyendo componentes farmacopeicos clave como los ginsenósidos Rg1 y Rb1 (de Panax ginseng), astragalosido IV (de Astragalus membranaceus) e icariina (de Epimedium brevicornum), lo que indica que los compuestos seleccionados son representativos y abarcan los principales ingredientes activos responsables de la tonificación de qi y sangre de JPSXD efectos.

Posteriormente, se recuperaron los objetivos génicos asociados a la mielosupresión de la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org/) y los resultados se descargaron en una hoja de cálculo. Se seleccionaron genes con una puntuación de relevancia ≥44 para análisis posteriores. La intersección de los fármacos objetivo y los genes relacionados con enfermedades se visualizó mediante un diagrama de Venn, y los genes superpuestos se importaron a la base de datos STRING (https://string-db.org/). El organismo se estableció en humano, y las fuentes de interacción se limitaron a Experimentos y Bases de Datos con una puntuación mínima requerida de interacción > 0,7. La red de interacción proteína-proteína (PPI) resultante fue analizada posteriormente para detectar características topológicas y identificar objetivos centrales y visualizada utilizando Cytoscape 3.10.2.

Basándose en los objetivos principales identificados, se realizaron análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) utilizando la base de datos DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). Los parámetros se establecieron como: recuento ≥5, puntuación EASE ≥0,05 y valor p < 0,01. Los resultados del enriquecimiento se visualizaron a través de la plataforma Microbiological Letter (http://www.bioinfo-cloud.org/). El análisis de vías aclaró aún más las principales vías de señalización y los marcadores regulatorios implicados, revelando así los posibles mecanismos mediante los cuales JPSXD mitiga la mielosupresión inducida por quimioterapia.

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Resultados

Análisis de farmacología de redes
Identificación de compuestos activos y objetivos
Primero identificamos los compuestos marcadores principales de cada hierba en JPSXD basándonos en la literatura paraasegurar una selecciónexhaustiva 34. Específicamente, consultando las entradas farmacopédicas de las hierbas relevantes (por ejemplo, Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Angelica sinensis), elaboramos una lista de los cons...

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Discusión

En medio del aumento de la incidencia global del cáncer, la comunidad médica se enfrenta a dos desafíos: no solo el tratamiento del cáncer en sí, sino también el manejo de los efectos secundarios asociados, entre los que la mielosupresión es una reacción adversa particularmente comúny grave 43. Este estudio investigó sistemáticamente el papel y los posibles mecanismos de JPSXD en el alivio de la mielosupresión inducida por CTX en ratones, empleando una combinación...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el proyecto Integral de Enfoque en Medicina Occidental y Tradicional China Tradicional-DCA Intervention Mode para la Prevención de Infecciones Postoperatorias en Pacientes Mayores con Malignidades Gastrointestinales, con el número de proyecto A2023053, financiado por la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Hunan.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4% Paraformaldehído (PFA)Sigma-AldrichP6148
AKT (pan) Rabbit mAbTecnología de señalización celular#4691
Lavadora automática de microplacasBioTek (Agilent)ELx405
Analizador de autohematología BC-2800vetMindrayBC-2800vet
Microtomo de criostatoThermo Fisher ScientificCryoStar NX50
Inyección de ciclofosfamidaBaxter Oncology GmbHN/A (Lote: HJ20160467)
Microscopio E100NikonE100
Anticuerpo EGFR (A-10)Santa Cruz BiotecnologíaSC-373746
Máquina de IncrustaciónLeicaEG1150
Kit ELISA de EPO (ratón)R& Sistemas DMEP00B
Anticuerpo policlonal GAPDH RabbitProteintech10494-1-AP
Kit GM-CSF (ratón) ELISAR& Sistemas DMMC00B
Cabra Anti-Conejo IgG conjugado con HRPJackson ImmunoResearch111-035-003
H& Kit de tinción ESigma-AldrichHT10
Centrífuga refrigerada de alta velocidadThermo Fisher ScientificSorvall ST 16R
Trituradora de tejidos de alto rendimientoServicebioKZ-II
Bolígrafo de inmunohistoquímicaLaboratorios VectorH-4000
JAK2 Rabbit mAbAbcamab108596
Decocción Jianpi Shengxue (JPSXD)Farmacia del Hospital Oncológico de HunanFormulación personalizada
Lector de microplacasBioTek (Agilent)Sinergia H1
Solución salina normalBaxter2B1324X
Microtomo rotatorioLeicaRM2016
Procesador de tejidosLeicaASP300S
Kit TPO (ratón) ELISAR& Sistemas DMTP00B
Mezclador de vórticesServicebioMX-F

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Mielosupresión por ciclofosfamidafarmacología de redesred de interacción proteicaenriquecimiento KEGGontología génicavía PI3K-Aktvía JAK-STATcélulas CD34 positivasleucopenia inducida por quimioterapia

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