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Artículo de método

Desarrollo y validación de una metodología para establecer modelos de ratas obesas con páncreas graso típico

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DOI:

10.3791/69553

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11 de noviembre de 2025

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1Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture and Moxibustion, Yangzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, 3Department of Specialty Medicine, Ohio University, 4Research Department, Swiss University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio ofrece un método reproducible y estandarizado para establecer modelos de ratas obesas que exhiben obesidad simple, comúnmente caracterizada por páncreas graso. También incluye protocolos detallados para la toma de muestras de tejido pancreático y la inmunohistoquímica.

Resumen

La obesidad se ha convertido en una epidemia de salud mundial predominante, con casi la mitad de la población mundial ahora clasificada como con sobrepeso u obesidad. Una característica patológica clave en individuos obesos es la deposición ectópica de lípidos en tejidos no adiposos, incluido el páncreas, una condición denominada esteatosis pancreática o páncreas graso. En modelos de roedores inducidos por dieta alta en grasas (HFD), la esteatosis pancreática precede constantemente a la esteatosis hepática, lo que subraya la susceptibilidad particular del páncreas a la acumulación de lípidos. Esta participación temprana posiciona al páncreas como un órgano crítico para comprender la desregulación metabólica en la obesidad. Aunque las ratas obesas inducidas por la dieta (DIO) recapitulan los aspectos centrales de la progresión de la enfermedad humana, los modelos animales bien caracterizados que exhiben de manera confiable este fenotipo pancreático siguen siendo escasos en la literatura.

Una consideración metodológica importante en el modelado de la obesidad humana es el momento de la introducción de la HFD. Muchos modelos existentes inician la HFD durante el período de destete, lo que puede introducir efectos confusos de programación metabólica del desarrollo que no reflejan completamente la obesidad humana, que se desarrolla principalmente después del desarrollo. Por el contrario, el presente estudio establece un protocolo estandarizado en el que se introduce la HFD después del destete. Este enfoque imita con mayor precisión la trayectoria humana común del inicio de la obesidad en la edad adulta, evita las adaptaciones metabólicas tempranas y da como resultado una progresión fisiológicamente más relevante hacia la esteatosis pancreática.

Esta investigación proporciona un marco detallado y reproducible para generar un modelo de obesidad en ratas caracterizado por una patología prominente del páncreas graso. La metodología incluye una fase de aclimatación de 1 semana, un período de inducción de HFD de 14 semanas a partir del destete y la recolección sistemática de tejidos. Se describen dos vías de procesamiento tisular: congelación instantánea para análisis moleculares (p. ej., Western blotting) y perfusión-fijación de paraformaldehído para evaluaciones morfológicas (p. ej., IHC, H&E). Este modelo ofrece una plataforma sólida para investigaciones mecanicistas sobre la disfunción metabólica pancreática asociada a la obesidad.

Introducción

La obesidad simple se define como la obesidad que existe de forma independiente sin otras comorbilidades, atribuida principalmente al desequilibrio energético resultante de estilos de vida poco saludables, como patrones dietéticos inadecuados y actividad física insuficiente1. La obesidad contribuye significativamente al aumento de la incidencia de enfermedades no transmisibles entre las poblaciones más jóvenes, caracterizadas por altas tasas de prevalencia, inicio temprano y complicaciones multisistémicas, lo que la posiciona como un desafío crítico de salud pública mundial2. El páncreas graso es una afección caracterizada por la deposición ectópica de lípidos en este órgano no adiposo durante la desregulación metabólica. El páncreas graso refleja una interacción crítica entre el tejido adiposo y la fisiopatología pancreática. La acumulación excesiva de grasa pancreática desplaza los tejidos acinares e islotes normales, induciendo alteraciones funcionales duales en las capacidades exocrinas y endocrinas 3,4. Este proceso patológico interrumpe las proporciones de células α/β, promueve la desdiferenciación de las células β con la consiguiente pérdida de la función secretora de insulina5 y media el daño lipotóxico directo a las células β6. Al mismo tiempo, la proliferación de células α y la liberación desregulada de insulina exacerban la inestabilidad glucémica, acelerando la progresión a diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y sus complicaciones asociadas7.

La investigación de la patogénesis del páncreas graso revela nuevos mecanismos subyacentes a la progresión de la enfermedad metabólica8. Si bien la investigación previa sobre la obesidad enfatizó la esteatosis hepática, la evidencia emergente identifica la deposición de lípidos pancreáticos como un evento temprano en la desregulación metabólica9. Este cambio de paradigma permite la construcción de un modelo de patología biorgánica para la obesidad simple, integrando esteatosis pancreática y hepática10. El estudio de su diafonía puede dilucidar vías críticas en todo el espectro de la enfermedad que abarcan el trastorno del metabolismo de los lípidos, la obesidad, la resistencia a la insulina y la diabetes, ofreciendo nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad11. En el proceso patológico del páncreas, la manifestación inicial es una deposición significativa de grasa pancreática, acompañada de una expansión sustancial de los adipocitos pancreáticos. Esto se observa predominantemente en la cara ventral de la cabeza, el cuello y las regiones del cuerpo del páncreas, y se localiza principalmente dentro de las áreas intersticiales entre las células acinares y de los islotes. Al mismo tiempo, se presenta inflamación crónica de bajo grado del páncreas, mientras que las funciones endocrinas y exocrinas permanecen en gran medida intactas en esta etapa12,13. La infiltración grasa extensa afecta aún más la función de las células β pancreáticas a través de la lipotoxicidad y suprime la actividad de la insulina. Durante esta fase, las células acinares son reemplazadas progresivamente por adipocitos, contribuyendo así al desarrollo de DM2 14,15. Aunque la diabetes mellitus no es un factor de riesgo independiente para el cáncer de páncreas, los pacientes con antecedentes de pancreatitis aguda y diabetes exhiben un riesgo significativamente elevado de desarrollar cáncer de páncreas16.

Los análisis anatómicos macroscópicos cuantifican la gravedad de la esteatosis pancreática y los patrones de infiltración, mientras que las evaluaciones de IHQ a nivel microscópico caracterizan la morfología de las células acinares, el posicionamiento nuclear, la frecuencia de vacuolización y la dinámica de la población celular17. Este enfoque multimodal, que abarca desde la observación anatómica macroscópica hasta la IHC de resolución celular, permite una estadificación completa de la patología pancreática a lo largo de la progresión de la enfermedad. El presente estudio detalla un protocolo estandarizado que abarca una aclimatación de 1 semana, una inducción de obesidad de 14 semanas en ratas adultas y un procesamiento optimizado del tejido pancreático para el análisis morfológico, estableciendo un marco sólido para investigar los trastornos metabólicos asociados a la esteatosis.

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Protocolo

El procedimiento de tratamiento animal fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Nanjing (202006A016) y cumplió con las directrices ARRIVE (Investigación con animales: Notificación de experimentos in vivo), las directrices éticas, las directrices sobre el funcionamiento de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y las directrices asociadas, la Directiva de la UE 2010/63 para la protección de los animales utilizados con fines científicos. Todos los animales de experimentación fueron anestesiados de acuerdo con los procedimientos aprobados de anestesia con roedores antes de la disección. El procedimiento se organizó en tres componentes distintos.

1. Establecer un modelo de rata obesa

  1. Animales y grupos de experimentación
    1. Seleccione ratas macho Sprague-Dawley (SD) de 4 semanas (80-120 g) de una cepa sensible a una dieta alta en grasas (HFD).
    2. Aclimatar a todas las ratas a una dieta de mantenimiento durante una semana, luego dividirlas aleatoriamente en dos grupos: el grupo de control y el grupo modelo.
    3. Reemplace la dieta de mantenimiento con HFD para el grupo modelo después de una semana, mientras mantiene el grupo de control con la dieta original. Mantenga a ambos grupos en sus dietas durante 14 semanas. La composición de HFD se detalla en la Tabla 1 y la formulación estándar de alimentos de mantenimiento se encuentra en la Tabla 2.
  2. Condiciones de alimentación y parámetros experimentales
    1. Parámetros ambientales: temperatura 22 ± 2 °C, humedad 50 ± 10%, ciclo luz/oscuridad de 12 h y libre acceso al agua y a los alimentos.
  3. Indicadores de seguimiento
    1. Registre el peso corporal y la ingesta de alimentos semanalmente a una hora fija.
      NOTA: Hacerlo por la noche puede minimizar el estrés y alinearse con los patrones de actividad diurna/nocturna18.
    2. Traza una curva de crecimiento del peso corporal utilizando los datos registrados.
    3. Defina el modelado exitoso de la obesidad como cuando el peso corporal supera el 20% del grupo de control de la misma edad.
IngredienteContenido (g/kg)Principales nutrientes proporcionados
Alimento en polvo ordinario365Aporte nutricional básico de hidratos de carbono, proteínas vegetales, grasas, complejos vitamínicos, minerales, etc
Manteca310Ácidos grasos saturados, Ácidos grasos insaturados
Caseína250Aminoácidos esenciales
Colesterol10Colesterol
Mezcla de celulosa y minerales60Fibra, calcio, fósforo, sodio, etc.
DL-Metionina Metionina/Metionina Aminoácidos3Aminoácidos esenciales
Levadura1Vitaminas B, β-glucano, etc.
NaCl1NaCl

Tabla 1: Formulación especial de HFD para establecer DIO en modelos de ratas. La tabla detalla la composición específica de la HFD utilizada en este estudio para el grupo modelo, que se administró desde el final del período de aclimatación hasta la recolección de tejido.

IngredienteContenidoUnidad
Humedad12.196%
Proteína bruta (CP%)18.272%
Energía digestible (DE)3.186Mcal/kg
Energía Metabolizable (EM)2.939Mcal/kg
Energía Neta (NE)2.228Mcal/kg
Extracto de éter (EE%)4.417%
Fibra bruta (CF%)3.677%
Calcio (Ca%)0.991%
Fósforo total0.681%
(Porcentaje total)
Fósforo no fitato0.19%
Sal0.407%
Lisina1.118%
Lisina digestible0.813%
Metionina0.53%
Treonina0.779%
Triptófano0.221%
Cobre (Cu)22.06mg/kg
Hierro (Fe)173.69mg/kg
Manganeso (Mn)102.1176mg/kg
Zinc (Zn)60.3687mg/kg

Tabla 2: Fórmula de alimentación de mantenimiento estándar en ratas. La tabla presenta la formulación del alimento de mantenimiento estándar, que se proporcionó a todas las ratas durante la fase de aclimatación y al grupo de control durante toda la duración del estudio.

2. Recolección de tejidos

  1. Preparación preoperatoria
    1. Tratamiento en ayunas: 12 h de restricción de alimentos antes de la eutanasia para minimizar la interferencia del contenido intestinal con los análisis bioquímicos.
    2. Anestesia: Administrar isoflurano por inhalación para anestesia profunda (concentración de inducción 4%, concentración de mantenimiento 1,5-2%). La máquina de anestesia estaba equipada con un vaporizador de isoflurano y la concentración anestésica se mantuvo en 1,5-2. Como referencia para la preparación, el consumo físico de isoflurano líquido fue de aproximadamente 0,5 mL-0,8 mL por rata durante todo el procedimiento.
    3. Controlar la profundidad de la anestesia: Realice un seguimiento continuo de la frecuencia respiratoria y los reflejos corneales. Mantener un estado anestésico sostenido durante todo el procedimiento para prevenir la autolisis pancreática postmortem.
    4. Manejar anestesia insuficiente: Si la profundidad de la anestesia es inadecuada o la conciencia reaparece, administre inmediatamente uretano al 20% por vía intraperitoneal para anestesia suplementaria (50 mg / kg) y vuelva a verificar los signos vitales antes de continuar. Prepare una solución de uretano al 20% disolviendo el polvo de uretano en solución salina.
      NOTA: La anestesia con isoflurano es el método que cumple con los requisitos éticos del Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Medicina China de Nanjing. Para este procedimiento terminal, se puede usar la inyección intraperitoneal de uretano al 20% como una alternativa aceptable. Sin embargo, la evidencia existente sugiere que el isoflurano puede ofrecer un perfil de seguridad más alto que la ketamina en roedores19.
  2. Recolección de tejido fresco
    1. Desinfección de la piel: Rocíe etanol al 75% rápidamente sobre todo el cuerpo (1-2 s) para evitar la contaminación del cabello de los órganos abdominales.
    2. Fijación de posición: Coloque la rata en posición supina en la mesa de disección y fije las cuatro extremidades de forma segura con clavos de cabeza grande.
    3. Agarre la piel abdominal con fórceps en la mano izquierda y haga una incisión en la piel a lo largo de la línea media (desde el xifoides hasta el pubis) con unas tijeras en la mano derecha. Diseccionar sin rodeos la fascia subcutánea para separar el tejido conectivo y cortar el músculo recto abdominal y el peritoneo a lo largo de la misma línea media.
    4. Identificación del páncreas: Desplace suavemente el intestino hacia la izquierda para visualizar el estómago, el bazo y el duodeno. El bazo está unido a la cola del páncreas y el estómago está cerca del páncreas.
    5. Disección rápida: eleve suavemente el bazo con fórceps y aísle el páncreas cortando progresivamente sus uniones al bazo, el estómago y el mesenterio duodenal. Debido a su textura frágil, evite el pinzamiento directo del parénquima pancreático y preserve los conductos pancreáticos / vasos sanguíneos para evitar el desgarro del tejido.
    6. Preservación del tejido: Enjuague el páncreas diseccionado rápidamente con PBS helado (solución salina tamponada con fosfato 1×, PH 7.4) o solución salina para eliminar la sangre residual. Transfiera inmediatamente el páncreas a un tubo de congelación de 2 ml, sumérjalo en nitrógeno líquido dentro de los 30 s y guárdelo a largo plazo a -80 ° C.
    7. Eutanasia y eliminación de cadáveres Después de la recolección de tejidos, eutanasia todas las ratas experimentales por dislocación cervical. De acuerdo con las regulaciones del Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Medicina China de Nanjing, los cadáveres de animales se clasifican como desechos biomédicos patológicos (Código de desechos: 831-003-01). Selle todos los cadáveres de animales en bolsas herméticas de acuerdo con las regulaciones y guárdelos uniformemente en congeladores designados. La universidad llevará a cabo una eliminación centralizada y ambientalmente racional. Bajo ninguna circunstancia se deben desechar arbitrariamente los cadáveres.
      NOTA: Evite la exposición a temperatura ambiente para evitar la degradación enzimática de las biomoléculas20,21.
  3. Recolección de tejido de perfusión (los pasos restantes son los mismos)
    1. Exponga el corazón: levante el tejido de la piel de la rata con la mano izquierda y abra la cavidad torácica con la mano derecha para exponer completamente el corazón.
    2. Prepare el ventrículo izquierdo para la perfusión: Haga una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo (tamaño que coincida con el diámetro de la aguja de perfusión) y haga una incisión en la aurícula derecha para permitir la salida de sangre.
    3. Solución salina perfundida: Inserte la aguja de perfusión suavemente en el ventrículo izquierdo y perfunda lentamente 100 ml de solución salina a una velocidad de flujo de 10 ml / min hasta que el flujo de salida de la aurícula derecha se aclare.
    4. Fijador de perfusible: Cambie a 200 ml de fijador de paraformaldehído al 4%, caudal: 5 ml/min. Perfundir cada rata con 100 mL de solución salina, seguido de 200 mL de paraformaldehído al 4%. Este estudio utilizó una solución de PFA preparada comercialmente. Debido a la inestabilidad del PFA en solución, con un potencial de variabilidad significativo según la preparación y la frescura, la solución líquida debe protegerse de la luz y almacenarse a 4 °C. Use una alícuota abierta de inmediato para garantizar la eficacia. Si se prepara a partir de polvo, la solución debe estar recién hecha inmediatamente antes de su uso.
      NOTA: Use guantes, gafas protectoras y una bata de laboratorio; Actuar en una campana extractora porque el paraformaldehído es tóxico. De acuerdo con las regulaciones del Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Medicina China de Nanjing, los desechos de paraformaldehído se clasifican como desechos biomédicos químicos (Código de residuos: 831-004-01). Después de su uso, debe almacenarse en un contenedor de residuos específico etiquetado con el símbolo de riesgo biológico. La eliminación centralizada es llevada a cabo por la universidad. En ningún caso se desechará indebidamente.
    5. Confirme el éxito de la perfusión: Verifique la rigidez de la extremidad que indica una fijación efectiva.
    6. Coloque el páncreas en un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga 30 ml de solución de paraformaldehído al 4%. Fije el tejido guardando el tubo estacionario en la oscuridad durante 2-4 h.
    7. Transfiera el páncreas a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml que contenga 30 ml de solución de etanol al 70%. Mantenga el tubo estacionario y protegido de la luz durante aproximadamente 20-24 h22.
    8. Inclusión en parafina: Incruste los tejidos en cera de parafina. Almacene los tejidos incrustados a 4 °C o -20 °C.
      NOTA: Este estudio utilizó secciones de parafina. Las secciones congeladas son una alternativa válida, pero el rendimiento de los anticuerpos debe verificarse previamente para el tipo de sección específico para garantizar resultados óptimos.

3. Tinción inmunohistoquímica (IHC) del páncreas

  1. Protocolo de seccionamiento y montaje
    1. Secciones de parafina: corte secciones de tejido con un grosor de 6 μm con un micrótomo y móntelas en portaobjetos de vidrio.
    2. Método de flotación: Flotar las secciones en un baño de flotación tisular a 40 °C para suavizar las arrugas.
    3. Recogida de tejidos: Monte las secciones en portaobjetos recubiertos con adhesivo (2-3 por portaobjetos) y séquelas en un calentador de portaobjetos a 80 °C.
    4. Secado de portaobjetos: Transfiera los portaobjetos con secciones montadas a un horno a 60 °C durante la noche después del seccionado.
  2. Protocolo de desparafinación y rehidratación
    1. Coloque los portaobjetos en una rejilla para portaobjetos y sumérjalos secuencialmente de la siguiente manera: xileno I, 7 min; xileno II, 7 min; etanol anhidro, 5 min; etanol al 90%, 5 min; etanol al 85%, 5 min; etanol al 75%, 5 min; agua destilada, 5 min; PBS, 5 min (tres veces).
      NOTA: Realice pasos de xileno en una campana extractora con guantes y gafas. Eliminar los residuos de xileno siguiendo el protocolo idéntico especificado para el paraformaldehído como paso 2.3.4.
  3. Protocolo de recuperación de antígenos
    1. Preparación de la solución de citrato de sodio: Preparar tampón de citrato de sodio (pH 6,0). Utilizamos una solución tampón de citrato de sodio preparada por nosotros mismos disolviendo un paquete del polvo en 1 L de agua.
    2. Microondas secuencialmente: Coloque los portaobjetos en un frasco de tinción de vidrio lleno de solución tampón de citrato de sodio para cubrir los portaobjetos, luego coloque el frasco en el microondas. Las muestras se sometieron a tratamiento por microondas bajo la siguiente secuencia: calor medio (600 W) durante 8 min, seguido de reposo sin calentar durante 8 min, y finalmente fuego bajo (300 W) durante 7 min.
    3. Enfríe naturalmente a temperatura ambiente: Deje que el recipiente se enfríe naturalmente a temperatura ambiente.
    4. PBS: Enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 minutos durante dos veces.
  4. Incubación en horno
    1. H2O2: Aplicar H2O2 al 3% en las secciones de tejido durante 10 min para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Aplique aproximadamente 50 - 80 μL de H2O2 a cada portaobjetos.
    2. PBS: Lave los portaobjetos en PBS durante 5 minutos tres veces.
    3. Complejo Strept-Avidina-Biotina-Peroxidasa (SABC): Aplique SABC gota a gota sobre el tejido y tiñe durante 30 min en una incubadora a 37 °C. Aplique aproximadamente 50 - 80 μL de SABC a cada portaobjetos.
    4. PBS: Lave los portaobjetos en PBS durante 5 minutos tres veces.
  5. Reproducción cromática
    1. 3,3'-diaminobenzidina (DAB): Aplique la solución cromogénica DAB a las secciones de tejido y controle hasta que se desarrolle una coloración marrón amarillenta. Tiñe las secciones durante aproximadamente 1-5 min. Ajuste la duración de la tinción en función de la especificidad del tejido y la temperatura ambiente. Para el tejido pancreático, se recomienda un tiempo de tinción de 2 min a 22 °C.
    2. Enjuague: Enjuague los portaobjetos inmediatamente bajo un chorro suave de agua destilada para detener la reacción.
    3. Sumergir: Sumerja los portaobjetos en agua destilada durante 5 minutos para eliminar los reactivos residuales.
  6. Tinción de hematoxilina
    1. Hematoxilina: Sumerja los portaobjetos en la hematoxilina durante 1 min. La solución de hematoxilina se prepara con agua pura en una proporción de 56 mg / ml.
    2. Enjuague: Enjuague los portaobjetos dos veces en agua destilada (5 s por enjuague).
    3. Diferenciación ácido clorhídrico-alcohol: Diferencie los portaobjetos en la solución de diferenciación ácido clorhídrico-alcohol durante 1 s.
    4. Sumergir: Sumerja los portaobjetos en agua del grifo durante 10 minutos para desarrollar una tinción nuclear azul estable.
  7. Deshidratación: Deshidratar los portaobjetos secuencialmente a través de las siguientes soluciones: etanol al 70%, etanol al 80%, etanol al 90%, etanol anhidro, xileno I y xileno II, durante 3 minutos en cada solución, respectivamente.
    NOTA: Realice pasos de xileno en una campana extractora con guantes y gafas.
  8. Sellamiento
    1. Monte las secciones con bálsamo neutro: Aplique bálsamo neutro al portaobjetos con un gotero de goma con bulbo. Cubra con un cubreobjetos. Evite comprimir el bulbo con fuerza para evitar la formación de burbujas. Aplique aproximadamente 50 μL de bálsamo neutro a cada portaobjetos.
    2. Secar al aire: Coloque los portaobjetos en una campana extractora durante la noche para permitir que la resina neutra se seque por completo.

4. Análisis de Western blot (WB)

  1. Descomposición de tejidos
    1. Tome 200 mg de tejido pancreático de rata, colóquelo en un tubo de molienda de 2 ml que contenga 1 ml de tampón de lisis y 3 pequeñas bolas de acero. El tampón de lisis está compuesto por un cóctel completo de inhibidores de proteasa y un tampón de lisis RIPA. La proporción de mezcla es de 1 comprimido de inhibidor de la proteasa: 50 ml de tampón de lisis RIPA.
    2. La molienda se realizó utilizando un molino de bolas con los siguientes parámetros: frecuencia: 30/s; tiempo: 30 s; 10-15 veces. Hasta que no se vean partículas blancas a simple vista.
    3. Transfiera el sobrenadante proteico superior a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, no tome espuma. Centrifugarlo con 16900 x g 30min, 4 °C.
      NOTA: Se prepararon homogeneizados para el análisis de Western blot a partir de todo el páncreas.
  2. Cuantificación de proteínas: Cuantifique la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proporción de mezcla para la solución de trabajo BCA es la Solución A: Solución B = 50:1.
  3. Electroforesis de proteínas:
    1. Agregue las muestras de proteína pancreática preparadas (se cargó un volumen de 6 μL en cada carril) al gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida-Young PAGE, Bis-Tirs, 10 × 8, para electroforesis.
    2. Funciona a 70 V durante 0,5 h y, a continuación, a 110 V durante 1 h con el sistema Mini-PROTEAN Tetra. Diluya el líquido tampón de ejecución de electroforesis MOPS al 20× con agua pura a una concentración del 1×.
  4. Transferencia de membrana
    1. Diluir el concentrado de transferencia eBlot L2 5× a 1× concentración de trabajo con agua pura. Este búfer de transferencia de 1× se puede reutilizar hasta 3 veces. Diluir el concentrado de equilibrio eBlot L2 5× a 1× concentración de trabajo con agua pura.
    2. Corte una membrana de PVDF (membrana de transferencia Immobilon-P) al tamaño adecuado (por ejemplo, 7,5 cm × 5,5 cm). El tamaño de poro es de 0,45 mmm.
    3. Vierta aproximadamente 30 ml de metanol en una caja de incubación con 90 × 60 × 32 mm. Sumerja la membrana de PVDF en el metanol durante 5 s para activarlo.
    4. Vierta aproximadamente 30 ml de la solución de equilibrio 1x preparada en otra caja de incubación limpia. Retire con cuidado el gel de las placas de electroforesis y colóquelo en la solución de equilibrio.
    5. Transfiera la membrana de PVDF activado del metanol y colóquela también en la caja de incubación que contiene la solución de equilibrio. Asegúrese de que la membrana esté colocada debajo del gel para un contacto adecuado. Permita que ambos se equilibren.
    6. Siguiendo las instrucciones del fabricante del aparato secante, coloque el "sándwich" de transferencia en este orden de arriba hacia abajo: esponja, gel, membrana de PVDF, esponja. Asegúrese de que no queden burbujas de aire atrapadas entre las capas. Coloque correctamente la pila de transferencia ensamblada en la cámara del aparato secante. Conecte la fuente de alimentación y ejecute la transferencia en modo estándar durante 15 minutos.
  5. Bloquear
    1. Prepare dos cajas de incubación, una que contenga aproximadamente 15 ml de TBST (solución salina tamponada con Tris-Tween20) y la otra con aproximadamente 15 ml de solución bloqueadora de BSA al 5%.
    2. Preparación de la solución TBST: Disuelva una bolsa de solución salina tamponada Tris en 2 L de agua pura, luego agregue 2 ml de Tween 20.
    3. Coloque la membrana de PVDF en la solución TBST, asegurándose de que el lado que estaba en contacto con el gel quede hacia arriba.
    4. Lave la membrana de PVDF en un agitador a 40 rpm a temperatura ambiente durante 3-5 min.
    5. Transfiera la membrana de PVDF al tampón de bloqueo. Bloquearlo en una coctelera a 20 rpm, a temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Incubación de anticuerpos primarios
    1. Lave la membrana de PVDF en una caja de incubación que contenga TBST, lave la membrana tres veces durante 5 minutos cada una en un agitador a 40 rpm a temperatura ambiente.
    2. Incubar con anticuerpo primario durante la noche (14-18 h) a 4 °C (1:40000, anticuerpo policlonal Vinculin) en otra caja de incubación de anticuerpos en un agitador a 20 rpm.
    3. Asegúrese de que el anticuerpo se diluya con una solución bloqueante de BSA al 5%, preparada de acuerdo con la proporción especificada en la sección.
  7. Incubación secundaria de anticuerpos
    1. Coloque la membrana de PVDF en una caja de incubación que contenga 15 ml de solución TBST. Lavar la membrana tres veces durante 5 min cada una en un agitador a temperatura ambiente, agitando a 40 rpm.
    2. Prepare el anticuerpo secundario diluyendo el anticuerpo ligado a HRP IgG anti-conejo a 1:2000 en tampón de bloqueo BSA al 5%.
    3. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador a 20 rpm23.
    4. Lave la membrana de PVDF tres veces con solución TBST durante 5 min cada una, siguiendo el método descrito anteriormente.
  8. Detección
    1. Prepare la solución de sustrato de trabajo mezclando AccuWest ECL Plus, Raegent A y AccuWest ECL Plus, Raegent B en una proporción de volumen de 1:1 directamente en una caja de incubación. Realice todos los pasos posteriores protegidos de la luz.
    2. Incube la membrana de PVDF en la solución durante 5-10 s, luego detecte inmediatamente las bandas inmunorreactivas utilizando reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL): Vilber Fusion FX6 MINI. El tiempo de exposición típico oscila entre 5 y 10 s.

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Resultados

Describimos un protocolo reproducible para establecer un modelo simple de obesidad que exhibe de manera confiable el páncreas graso (Figura 1). Todo el proceso, desde la alimentación animal y la recolección de tejidos hasta la posterior validación molecular, se resume esquemáticamente en la Figura 1. Se registraron los cambios de peso semanales del grupo modelo (n = 5) y del grupo control (n = 5), y no hubo diferencias significa...

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Discusión

Como principal impulsor del síndrome metabólico, la obesidad no complicada representa la manifestación inicial de la desregulación sistémica del metabolismo de los lípidos. Sin intervención, puede progresar a DM2 y complicaciones diabéticas graves, lo que subraya la necesidad de una corrección metabólica temprana30. La esteatosis pancreática (páncreas graso), un marcador temprano de depósito de lípidos ectópicos en la obesidad, redefine el páncreas como un órgano ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Herederos e Instructores para la Herencia de la Experiencia Académica de la Séptima Hornada de Expertos en Medicina Tradicional China de Renombre Nacional; El Proyecto del Fondo de Jóvenes Científicos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [subvención número 82305376]; Proyecto de apoyo a jóvenes talentos de ciencia y tecnología en la provincia de Jiangsu en 2024 [número de subvención JSTJ-2024-380].

Los diagramas de flujo se produjeron utilizando FigDraw, Biorender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material
Tubo microcentrífugo de 1,5 mLBiosharp Bioingeniería Co. LtdBS-15-MWB
Tubo de congelación de 2 mlLABSELECTCV-002-200-EXWB
Tubo de molienda de 2 mlWuhan Servicebio Technology Co., LtdHT-200-MWB
3% H2O2Booster Electronics Technology Co., Ltd.20A23CIHC
4% de paraformaldehídoBiosharp Bioingeniería Co. LtdBL539AOperación de disección por perfusión del páncreas
Solución BSA al 5%Biofroxx4240GR100IHC
Tubo de centrífuga de 50 mL y nbsp;Biosharp Bioingeniería Co. LtdBS-500-MPreservación de tejidos
AccuWest ECL Plus, Raegent ANanjing Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
AccuWest ECL Plus, Raegent BNanjing Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
etanol anhidroShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.10009257IHC
Anti-IgG de conejo, anticuerpo vinculado a HRPTecnología de Señalización Celular.Inc,7074WB
Cóctel inhibidor de la proteasa cOmpleteHoffmann-La Roche Ltd 82256300WB
CoberturaCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD10212450CIHC
Solución cromogénica DABBooster Electronics Technology Co., Ltd.AR2017-1IHC
PinzasShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.SP0007-MDisección de rata SD
diapositivas de cristal CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD188105IHC
Tarro de vidrio para tintesShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.FG010IHC
HematoxilinaShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST2067-20gIHC
Dieta alta en grasasSuzhou Shuangshi Laboratorio Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabla1alimentación de animales experimentales
Alcohol de ácido clorhídricoShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0163MIHC
isofluranoShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10Ratas anestesiadas
metanol Biofroxx67-56-1WB
MOPS Corriendo líquido amortiguador 20 y 20 veces;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C36842504WB
Balsámico neutralBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G8590IHC
Resina neutraShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.G8590IHC
Solución PBSJiangsu Keygen Biotech Corp., LtdKGL2206-500Preservación de tejidos
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA  Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, EE. UU.ZB382867
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA  hermo Fisher Scientific Inc, Waltham, EE. UU.ZB382867WB
Cóctel inhibidor de proteasasHoffmann-La Roche Ltd 82256300
Membrana PVDF (Membrana de Transferencia Immobilon-P, Millipore, 0000380346) Merck Millipore0000380346WB
Búfer de lisis RIPABiosharp Bioingeniería Co. LtdBL504A, 70096436WB
SABCBooster Electronics Technology Co., Ltd.20C03AIHC
Solución salinaSHANXI SHENGAO ANIMAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. & nbsp;270071460Preservación de tejidos
Ratas machos SDJiangsu GemPharmatech Co., Ltd. & nbsp;D000017ratas
Citrato de sodioMerck Life ScienceS1804IHC
Alimentación de mantenimiento estándarSuzhou Shuangshi Laboratorio Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabla2alimentación de animales experimentales
el resto concentra eBlot L2 5 veces;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97212410 WB
el concentrado de transferencia eBlot L2 5 veces;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97211504WB
Tris Buffer Salino, Polvo y Pólvora;Biosharp Bioingeniería Co. LtdBL602AWB
Preadolescentes 20BiofroxxEZ681A3EA8WB
UretanoSigma-Aldrich Co., Ltd.U2500-100GRatas anestesiadas
Anticuerpo policlonal de vinculinaProteintech Group, Inc,26520-1-APWB
xilenoCorporación Reagente de NankínC0430530223IHC
Young PAGE, Bis-Tirs, 10 y más veces; 8Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C33152505WB
Equipo
Máquina de anestesiaShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.Modelo R5805Ratas anestesiadas
molino de bolas Retsch Technology GmbH - MicrotracMM400WB
CentrifugadorasEppendorf SE5418RWB
Secador biológico de tejidos informatizadoCompañía de Instrumentos Kedi de Jinhua de Zhejiang.SC2013-G-KITIHC
reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y nbsp;VILBER BIOIMAGEN00170961WB
microtomo Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, EE. UU.HM325IHC
MicroondasShanghai Boxun Industry Co., Ltd. 97000IHC
Sistema Mini-PROTEAN TetraBio-Rad Laboratories, Inc.1658004WB
HornoShanghai Jinghong Scientific Co., Ltd.DNP-9082IHC
Agua puraSichuan UPT Ultra-Pure Technology Co., Ltd.ULUP-TEZIHC

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