Análisis diferencial del contenido de nutrientes y el metabolismo de Camellia oleifera en diferentes periodos de crecimiento

Resumen

Este artículo presenta un protocolo para proporcionar el primer informe sobre el contenido de nutrientes y las vías metabólicas relacionadas de las hojas de C. oleifera en tres etapas de crecimiento y desarrollo, y para proporcionar una base para comprender el mecanismo molecular de la senescencia foliar.

Resumen

Para indicar las variaciones en el contenido de nutrientes, la expresión génica asociada al metabolismo del nitrógeno y el metabolismo del almidón y la sacarosa en C. oleifera en diferentes periodos de crecimiento, se recogieron hojas del cultivar C. oleifera 'Dabieshan 1' en las etapas juvenil ( C. oleifera de 2 años), en la etapa temprana de fructificación ( C. oleifera de 6 años) y en las etapas de pico de fructificación ( C. oleifera de 10 años), que fueron seleccionados como materiales experimentales. La determinación del contenido de nutrientes y el análisis de la secuenciación del transcriptoma se realizaron en muestras de hojas en la fase temprana de floración, estudiando sistemáticamente el contenido de nutrientes y las vías metabólicas relacionadas de C. oleifera durante diferentes periodos de crecimiento. Los resultados distinguieron 9 genes homólogos relacionados con el metabolismo del nitrógeno y 24 relacionados con el metabolismo del almidón y la sacarosa, respectivamente, tras someter las hojas de C. oleifera recogidas tanto en la fase juvenil como en la etapa máxima de fructificación a la base de datos KEGG. Con el aumento de la edad de los árboles, se producen cambios en el metabolismo del nitrógeno y las vías metabólicas del almidón y la sacarosa en las hojas de C. oleifera. C. oleifera potenciaría tanto la vía fenilalanina-liasa como la biosíntesis de sacarosa. Estos llevaron finalmente a un aumento de los niveles de proteínas solubles y azúcares solubles en las hojas de C. oleifera . Este estudio aporta nuevas perspectivas sobre los mecanismos de los cambios en el metabolismo del nitrógeno, el almidón y la sacarosa, y el contenido de nutrientes durante la transformación de C. oleifera del crecimiento vegetativo al crecimiento reproductivo. Ofrece referencias teóricas para entender su periodo de fructificación y aplicar fertilizantes foliares para las plantas para promover la floración y la fructificación.

Introducción

Durante su etapa juvenil, C. oleifera suele poseer un tallo principal indiviso y experimenta principalmente crecimiento vegetativo, careciendo de la capacidad para procesos reproductivos como la diferenciación de capullos florales y la^{floración 1}. Al injertar plántulas de C. oleifera, es práctica común utilizar brotes de primavera que entran en la etapa adulta como váteros, ya que tienen la capacidad de inducir la^{floración 2,3,4}. Sin embargo, durante la primera fase de plantación, C. oleifera en su etapa juvenil puede tener dificultades para formar brotes florales y experimentar diferenciación de capullos debido al crecimiento vegetativo vigoroso, ya que las condiciones ambientales pueden limitar la formación de los brotes florales. No obstante, a medida que C. oleifera avanza en su etapa juvenil hasta su periodo primario de fructificación y finalmente alcanza su pico de frutificación, desarrolla gradualmente la capacidad de realizar la formación normal de capullos y floración. C. oleifera tiene la característica de una forma compleja, frutos y flores^{simultáneos 5}. En la etapa inicial de fructificación, C. oleifera puede producir algunas flores, pero cuando entra en la etapa de pico de fructificación, produce una mayor cantidad de flores. En la etapa pico de fructificación de C. oleifera, el crecimiento reproductivo se vuelve predominante, acompañado de mayores demandas de luz, temperatura, agua y nutrientes. Es evidente que los árboles frutales leñosos, como C. oleifera, tienen un largo periodo de crecimiento vegetativo antes de florecer, lo que limita la posibilidad de acortar el ciclo de cultivo y lograr una alta productividad temprana⁶.

El nitrógeno es muy importante para cómo crecen y se desarrollan las plantas. Diferentes tipos de plantas tienen distintas cantidades de nitrógeno, e incluso dentro de la misma especie, existen disparidades significativas en el contenido de nitrógeno en distintos periodos de crecimiento. A medida que las plantas pasan a la etapa de crecimiento reproductivo, el nitrógeno se acumula gradualmente en órganos como flores, frutos y^{semillas 7}. El nitrógeno es esencial para enzimas, proteínas, hormonas específicas, ácidos nucleicos y otras sustancias vitales, orquestando así las actividades^{metabólicas.} El proceso de diferenciación de los capullos florales constituye un punto de inflexión clave, que hace la transición de las plantas de su fase vegetativa a la etapa reproductiva, e implica un proceso de desarrollo complejo. La acumulación de nutrientes sirve como base fundamental para la diferenciación de los capullos florales^{de las plantas 9}. El consenso actual sostiene que la diferenciación exitosa de los capullos florales depende de la acumulación de^{carbohidratos 10}. Durante la diferenciación de los brotes florales de los árboles frutales, las fluctuaciones en el contenido de azúcar soluble influyen directa o indirectamente en el proceso¹⁰. Las investigaciones han demostrado una estrecha correlación entre los niveles de carbohidratos en las hojas de Prunus salicina y la diferenciación de los brotes florales, ya que los niveles de azúcar soluble son más altos en la fase fisiológica de diferenciación de los brotes florales que en el periodo morfológico de los brotes florales, en el caso de P. salicina experimentó un rápido agotamiento de carbohidratos durante la diferenciación de los^{brotes florales 11}. No obstante, hay informes que indican que no se observa una fluctuación significativa en el contenido soluble de almidón en Ficus carica durante la diferenciación de los capullos^{florales 12}. Las plantas perennes acumulan almidón dentro del ovario durante el periodo primaveral de diferenciación de los capullos, mientras que las plantas que caen hojas almacenan almidón durante el periodo de latencia de los^{brotes 13}. Basándonos en la información anterior, podríamos concluir que existen diferencias en las trayectorias de los cambios en el contenido de carbohidratos entre diferentes especies durante la diferenciación de los capullos florales. Ying et ^al.14 analizaron los patrones de expresión de genes enzimáticos clave implicados en procesos meteorológicos básicos, como el metabolismo del nitrógeno y el metabolismo de la sacarosa y el almidón, en dos etapas diferentes de la diferenciación de los brotes florales en Vernicia fordii. Este análisis se combinó con los cambios dinámicos en los indicadores fisiológicos y bioquímicos de los brotes florales del tung, proporcionando una elucidación detallada de la acumulación, utilización, transporte y distribución de nutrientes durante la diferenciación de los brotes florales del tung ^8,14. Investigaciones de Lai Chengchun y colaboradores encontraron que la eliminación de dos hojas puede modular los genes expresados como sacarosa fosfato sintasa (SPS), invertasa neutra (NI), invertasa de pared celular (CWI) y α-amilasa (AMY), promoviendo así la síntesis de sacarosa y la posterior acumulación de almidón, proporcionando el marco nutricional esencial necesario para la maduración del fruto, la germinación de los brotes y la^{floración 13,15}.

Sin embargo, rara vez se reportó investigación sobre cambios en el contenido de nutrientes, metabolismo del nitrógeno y el metabolismo del almidón y la sacarosa en C. oleifera en diferentes etapas. La mayoría de los estudios se han centrado en la construcción de mapas de polimorfismo de nucleótido único (SNP), el desarrollo de marcadores SSR y la disección de las respuestas fisiológicas y moleculares de C. oleifera bajo condiciones de baja o alta^{temperatura 16,17,18,19,20}. Por ello, en este estudio se seleccionó el cultivar común de C. oleifera "Dabieshan 1", y se recogieron muestras de hojas de brotes de primavera en diferentes periodos de crecimiento (etapa juvenil, inicial de fructificación y etapa máxima de fructificación) de C. oleifera para análisis de secuenciación de nutrientes y transcriptomas. El objetivo era identificar diferencias en el contenido de nutrientes, el metabolismo del nitrógeno y el metabolismo de la expresión génica de sacarosa y almidón a lo largo de las distintas fases de los procesos de crecimiento y desarrollo observados en las hojas de C. oleifera. Aclarar las vías del metabolismo del nitrógeno, la sacarosa y el almidón, y sus relaciones con nutrientes relacionados puede sentar las bases para estudiar el mecanismo de diferenciación de los gemmas florales de C. oleifera y arrojar luz sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la floración de C. oleifera.

Protocolo

1. Materiales experimentales

C. oleifera Las hojas 'Dabieshan 1' se recogieron en tres etapas clave de desarrollo: la etapa juvenil, alrededor de los 2 años de edad; El sujeto progresa a una fase temprana de fructificación aproximadamente a los 6 años, alcanzando finalmente su periodo máximo de fructificación cuando tiene unos 10 años. Todas las plantas de C. oleifera en las tres etapas de desarrollo anteriores se plantaron utilizando plántulas cultivadas en macetas de la misma especificación de C. oleifera 'Dabieshan 1'. Las propiedades físicas y químicas del suelo en los terrenos forestales de C. oleifera se mostraron en la Tabla 1.

2. Resumen del sitio de la colección

Se recogieron materiales experimentales en la ciudad de Heping, situada en el corazón de la provincia de Anhui. El condado de Shucheng se encuentra dentro de la región central de la provincia, perteneciente a la zona periférica de las montañas Dabie. Las coordenadas son 31°11′N, 116°47′E, con una altitud media de 90 m. El suelo se clasifica como suelo marrón amarillo. La región presenta un patrón climático monzónico subtropical húmedo, que mantiene una temperatura media anual de 15,6 °C y suele registrar alrededor de 1.100 mm de precipitación al año, disfruta de aproximadamente 1.969 h de sol cada año y un periodo sin heladas de 224 días.

3. Recogida de muestras y pretratamiento

Las muestras se seleccionaron durante el periodo previo a la floración (finales de septiembre). Para cada etapa de desarrollo, se seleccionaron plantas de C. oleifera con crecimiento similar, consistente y fuerte. De cada planta, se retiraba la tercera hoja de arriba a abajo, que consistía en brotes de primavera de crecimiento moderado desde las direcciones este, oeste, sur y norte de la parte exterior de la corona de C. oleifera . Las muestras se marcaron con letras y números de serie: YAT1, YAS2 y YAT3 para las hojas de C. oleifera en la etapa juvenil, el sujeto progresa a una fase temprana de fructificación y el periodo máximo de fructificación, respectivamente. Estos se recogían y almacenaban en nitrógeno líquido. Se seleccionaron cinco árboles de muestra aleatoria de cada etapa como una réplica biológica, y se establecieron tres réplicas biológicas en todas las etapas. Los ejemplares seleccionados fueron llevados el mismo día al laboratorio y conservados a -80 °C.

4. Determinación del índice fisiológico

El contenido de azúcar soluble se determinó mediante el método colorimétrico anthrone²¹. El contenido de carbono orgánico se determinó mediante el método de oxidación de dicromato de potasio - título de sulfato^{ferroso 22}. El contenido de proteína soluble se obtuvo mediante el método Coomassie brilliant^{blue 23}. La concentración total de nitrógeno se cuantificó mediante el método^{de Kjeldahl 22}.

5. Se llevó a cabo el aislamiento de ARN completo, seguido de la construcción de una biblioteca de ADN complementario (ADNc) y la posterior secuenciación

El ARN total se extrajo de las hojas de C. oleifera en diferentes etapas utilizando el kit de extracción de ARN vegetal. La concentración total de ARN se determinó mediante un espectrofotómetro ultravioleta visible de espectro completo. La integridad y claridad del ARN fueron determinadas por un analizador biológico. Tras construir y validar la biblioteca de ADNc, se realizó la secuenciación transcriptómica utilizando una plataforma de secuenciación secuencia por secuencia de alto rendimiento. El procedimiento de secuenciación produjo lecturas individuales, cada una abarcando 100 pares de bases^{24, 25 y 26}. Los resultados de la alineación del proceso de secuencia fueron analizados estadísticamente utilizando el software^{RSEM 27}. Se identificaron genes de expresión diferencial (DEGs) en diversas etapas del desarrollo de C. oleifera utilizando el software de análisis diferencial^{DESeq 28,29}.

6. Ensamblaje de novo y anotación UniGene

Se utilizaron SeqPrep http://github.com/jstjohn/SeqPrep) y Sickle (http://github.com/najoshi/sickle) para filtrar los datos en bruto, incluyendo la eliminación de secuencias de baja calidad y adaptadores contaminados. Luego, las lecturas limpias obtenidas de cada muestra se ensamblaron usando el software^{Trinity 30,31}. Todos los transcritos ensamblados fueron sometidos a alineación BLASTX contra el Swiss-Prot, Clusters of orthologus groups for eucarioty complete genomas y bases de datos KEGG en orden secuencial. Se estableció un valor E típico de corte (valor E <10⁻⁵) para recuperar sus anotaciones de funciones. El KEGG se aplicó para analizar vías metabólicas^{relacionadas 32}.

7. Anotación funcional de genes y análisis de genes expresados diferencialmente

Las abundancias génicas e isoformas se analizaron estadísticamente utilizando el software^{RSEM 27}. Se estableció un corte (P < 0,05, FDR < 0,01, |log2FC|>1) para identificar genes (DEGs) expresados diferencialmente. El número esperado de fragmentos por kb de transcrito por millón de fragmentos mapeados (FPKM) es actualmente el método más utilizado para estimar los niveles de expresión^{génica 28}. Se calcularon los valores FPKM de todos los genes de las tres diferentes etapas de crecimiento y desarrollo (YAT1, YAS2 y YAT3). Se realizó un análisis jerárquico por agrupamiento para examinar los niveles diferenciales de expresión génica. Mientras tanto, la vía KEGG se preparó para identificar DEGs significativamente enriquecidos en vías metabólicas en P≤ corregido por Bonferroni a 0,05 en comparación con todo el transcriptoma usando KOBAS²⁹.

8. Métodos analíticos

Los datos se presentaron usando Excel para calcular valores medios y desviaciones estándar. El análisis de varianza (ANOVA) se utilizó para análisis estadístico mediante el software SPSS, y la prueba de múltiples rangos de Duncan se empleó para evaluar diferencias significativas en el contenido de nutrientes entre las tres etapas. Después, se determinaron diferencias significativas entre grupos mediante comparaciones múltiples post-hoc mediante el método de Diferencia Mínima Significativa (LSD). Se generaron gráficos y tablas utilizando el software Origin para visualizar hallazgos experimentales y analíticos. No se denotó ninguna significación estadística por 'ns' (P > 0,05). Las diferencias estadísticamente significativas se denotaron por '*' (P < 0,05), '**' (P < 0,01), '***' (P < 0,001) y '****' (P < 0,0001), respectivamente.

Resultados

Comparación del contenido de compuestos nitrogenados en las hojas de C. oleifera en diferentes periodos de crecimiento

El nitrógeno fue fundamental para facilitar el crecimiento y desarrollo de las plantas, ejerciendo una profunda influencia en sus procesos reproductivos. Por lo tanto, comprender el contenido total de nitrógeno en las plantas tiene una importancia considerable para los esfuerzos de ...

Discusión

Los azúcares solubles actúan como fuentes esenciales de energía y componentes estructurales en las plantas, alimentando diversas actividades fisiológicas y procesos^{biosintéticos 10}. Las alteraciones en el contenido de azúcar soluble influyen directa o indirectamente en el proceso de transformación de capullos vegetativos en brotes florales en árboles^{frutales 10}. Algunas investigaciones han encontrado que la necesidad de abundantes azúcares ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bioanalizador 2100	Agilent Technologies, Inc. (EE. UU.)	—	Utilizado para evaluar la integridad y claridad del ARN
Software DESeq	Código fuente	3.2	Utilizado para análisis de expresión diferencial
Kit EASYspin Plus (Aislamiento total de ARN)	Aidlab Biotechnology Co., Ltd. (China)	RN 28 (Aidlab)	Utilizado para la extracción total de ARN de hojas de C. oleifera
Plataforma de secuenciación HiSeq 2000	Illumina (China)	—	Usado para secuenciación transcriptomática, longitud de lectura 100 pb
Método Kjeldahl/Kjeltec 2300	Foss Tecator (Suecia)	—	Para la concentración total de nitrógeno (Bao 2007)
Método para la determinación de proteínas solubles	Ácido sulfúrico concentrado	6104-58-1(Aladdín)	Método desarrollado por Chen Jianxun (Chen et al. 2015)
Método para la determinación del azúcar soluble	Anthrone	90-44-8 (Macklin)	Zhang Zhilang' s (Zhang et al. 2003)
Oxidación de dicromato de potasio - método de titulación de sulfato ferroso	Dicromato de potasio Sulfato Ferroso	NA (aladdín) 7782-63-0 (aladdín)	Para la determinación del carbono orgánico (Bao 2007)
Software RSEM	Código fuente	1.2.3	Utilizado para análisis estadístico de alineación de secuencias
Espectrofotómetro Thermo Scientific NanoDrop 2000C	ABI (EE. UU.)	—	Utilizado para determinar la concentración de ARN