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Artículo de investigación
Se evaluó una fórmula de enema herbal que combina Sanguisorba officinalis, Bletilla striata y Acacia catechu utilizando perfilado LC-MS/MS, acoplamiento S100β, un modelo de colitis DSS y glia entérica activada por LPS/IFN-γ. La fórmula activó S100β, suprimió la activación glial y redujo la expresión p-NF-κB/iNOS, indicando mejoría mediante el eje S100β-RAGE-NF-κB.
La activación de las células gliales entéricas (CEG) contribuye a la patogénesis de la colitis ulcerosa (CU). Este estudio examinó si el Líquido de Enema Dibai (DBE), un enema herbal que combina Sanguisorba officinalis, Bletilla striata y Acacia catechu, modula la inflamación impulsada por EGC. Los perfiles LC-MS/MS de los constituyentes de DBE y compuestos prioritarios se acoplaron a S100β. La eficacia se evaluó en la colitis murina inducida por dextrano sulfato sódico (DSS) utilizando el peso corporal, la longitud del colon, la histopatología y los niveles de citocinas (ELISA). Los marcadores de activación glial se midieron mediante inmunohistoquímica, colocalización por inmunofluorescencia, PCR cuantitativa (qPCR) e inmunoborramiento. Un modelo in vitro utilizó CRL-2690 de la glia entérica activada con lipopolisacáridos más interferón-γ, siendo la intervención suero de rata que contiene DBE (15%). El acoplamiento sugería una fuerte unión prevista de varios componentes DBE a S100β. DSS aumentó TNF-α e IL-1β, alteró las uniones estrechas y elevó S100β/GFAP tanto en niveles de ARNm como de proteínas, lo cual es compatible con hiperactivación glial; La DBE revirtió significativamente estos cambios. In vitro, la DBE redujo S100β, RAGE, iNOS (NOS2) y la NF-κB fosforilada p65. En conjunto, la DBE parece aliviar la CU inhibiendo la activación de la EGC y regulando a la baja el eje S100β/RAGE/NF-κB/iNOS, preservando así la integridad mucosa.
La colitis ulcerosa (CU) es un subtipo importante de enfermedad inflamatoria intestinal (EII) caracterizada por una inflamación mucosa crónica del colon, con una carga global creciente desde 1990, y la CU representa una proporción sustancial de los casos incidentes deEII 1,2. Las manifestaciones típicas incluyen dolor abdominal y diarrea con sangre, lo que provoca un considerable malestar físico y psicológico y costes considerablesde tratamiento 3. Aunque las opciones de tratamiento se han ampliado, la exposición prolongada a inmunomoduladores y biológicos que suprimen la inmunidad sistémica se asocia con un mayor riesgo de linfoma e infecciones oportunistas, y una parte de los pacientes sigue siendo refractaria ointolerante 4. La CU es ampliamente considerada como una condición mediada por el sistema inmunitario en la que la alteración de la homeostasis inmune mucosa es central para lafisiopatología 5. Sin embargo, la evidencia acumulada indica que los mecanismos inmunes mucosos por sí solos son insuficientes para explicar todas las características de la EII; el sistema nervioso entérico (SNE) contribuye a la inflamación intestinal, extendiendo el concepto de enfermedad a la neuroinflamación dentro de laEII 6.
Las células gliales entéricas (EGs), que superan en número a las neuronas entéricas en mamíferos adultos, son ahora reconocidas como reguladoras clave de la homeostasis intestinal y lainflamación 7,8. Los EGC modulan la función de barrera epitelial liberando mediadores como GDNF, TGF-β1, S100β y 15d-PGJ2, influyendo así en la permeabilidad y la integridadmucosa 9. Entre estos mediadores, S100β puede activar cascadas aguas abajo —incluida la vía RAGE/NF-κB— que conducen a lesiones de barrera y amplificacióninflamatoria 10,11. Los EGC también moldean las respuestas inmunitarias regulando el fenotipo de los macrófagos y la sensibilidad visceral mediante connexin-43 y M-CSF, y ejerciendo efectos supresores sobre las células T in vitro, destacando la activación de las EGC como un objetivo terapéutico manejable en la UC12,13.
La medicina tradicional china (MTC) ha sido cada vez más investigada en la CU y ha mostrado beneficios prometedores tanto en entornos clínicos comoexperimentales 14,15. El emparejamiento clásico de Sanguisorba officinalis (Diyu) y Bletilla striata (Baiji), junto con Acacia catechu (Ercha), ha sido documentado durante mucho tiempo para trastornos disentéricos en fuentes de materia médica y está incluido en la Farmacopea China para indicaciones hemostáticas, analgésicas y de cicatrización de heridas. Estudios contemporáneos reportan actividades antibacterianas, antiinflamatorias, antioxidantes y antiúlceras para estos botánicos, mientras que A. catechu también demuestra propiedades neuroprotectoras con catequina como constituyenteprominente 16,17. En comparación con la inmunosupresión sistémica convencional, una formulación que involucre vías neuroinmunes centradas en el ECG podría ofrecer eficacia complementaria con un mecanismo distinto y potencialmente menos riesgos sistémicos relacionados conel sistema inmunitario 18,19.
Este estudio evalúa si la preparación combinada de Diyu, Baiji y Ercha (DBE) mitiga la CU al suprimir la activación de la EGC. Se utiliza un enfoque integrado: perfilado LC-MS/MS no dirigido para priorizar constituyentes, acoplamiento molecular frente a S100β, validación en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano y ensayos mecanicistas en ECGs. El trabajo enfatiza un mecanismo neuroinmune —S100β/RAGE/NF-κB/iNOS— explorado en terapias previas de CU, y describe implicaciones prácticas para la selección de dosis, la optimización de formulaciones y los estudios traslacionales posteriores.
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Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Pekín [BUCM-2023-0912] y se llevaron a cabo conforme a las directrices institucionales y nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. No hubo sujetos humanos implicados.
Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Reactivos y materiales
Se utilizaron disolventes de grado analítico y reactivos de grado biológico molecular en todo el proceso. Toda la información comercial, incluidos fabricantes, números de catálogo y detalles de licencias de software, se proporciona en la Tabla de Materiales (xlsx). El agua para todas las preparaciones se desionizaba y filtraba. Todos los buffers se prepararon frescos o almacenados bajo las condiciones especificadas a continuación.
2. Configuración de equipos y software
Un sistema UPLC-MS/MS acoplado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar; una centrífuga refrigerada con rotor de cubo oscilante; una incubadora de CO₂ mantenida a 37 °C, 5% de CO₂ y ≥95% de humedad relativa; un lector de microplacas (450 nm); un termociclador PCR en tiempo real; aparatos de electroforesis y sección; y se utilizó un microscopio de fluorescencia con filtros fijos de excitación/emisión. El control de instrumentos y el análisis de datos se realizaban en MassLynx v4.2 para datos cromatográficos y espectrométricos de masa y en AutoDock 4.2 con AutoDockTools 1.5.7 para acoplamiento. El análisis de imagen se realizó en ImageJ/Fiji v1.53.
3. Preparación del Líquido de Enema Dibai (DBE)
La mezcla herbal compuesta por Diyu (50 g), Baiji (50 g) y Ercha (20 g) fue triturada de forma gruesa y remojada en 1.200 mL de agua desionizada a temperatura ambiente durante 30 minutos para asegurar una hidratación completa. La mezcla remojada se decocció a ebullición vigorosa durante 30 minutos con remociones ocasionales para evitar la adhesión. La decocción caliente se filtraba a través de gasas médicas estérils de varias capas en cristalería estéril para eliminar material insoluble. El filtrado se concentró al vacío en un baño maria que no excedía los 45 °C hasta obtener un concentrado correspondiente a una concentración final de stock de 1,98 g/mL (stock de alta dosis). Se prepararon soluciones de trabajo de dosis medias y bajas a 0,99 g/mL y 0,50 g/mL por dilución con agua desionizada estéril hasta volúmenes finales de 100 mL cada una. Cada solución se pasaba a través de una membrana de 0,22 μm en condiciones estériles, se dispensaba en recipientes estériles marcados y se almacenaba a 4 °C durante hasta siete días. Antes de su uso, las soluciones se mezclaban suavemente; una apariencia aceptable era clara o ligeramente opalescente sin partículas visibles.
4. UPLC - Análisis MS/MS de DBE
El polvo de cada componente medicinal se pesó con precisión a 50 mg y se extrajo con 1,0 mL de metanol al 80% (v/v) mediante agitación ultrasónica durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los extractos se devolvieron a temperatura ambiente tras la sonicación, centrifugados a 15.000 × g durante 10 minutos a 4 °C, y los sobrenadantes se filtraron a través de membranas de 0,22 μm hacia viales de automuestreo. La separación cromatográfica se realizó en una columna de fase inversa (2,1 × 100 mm, 1,8 μm; tipo C18 con capas polares al extremo) mantenida a 35 °C; la columna/marca y el número de catálogo se proporcionan en la Tabla de Materiales. Fase móvil A: 0,1% de ácido fórmico en agua; fase móvil B: acetonitrilo. Caudal: 0,30 mL/min; volumen de inyección: 10 μL. Gradiente: 5% B durante 0-2 min; 5→95% B de 2 a 20 minutos; 95% B durante 20-23 minutos; 95→5% B de 23,0 a 23,1 min; reeequilibrarse al 5% B hasta 26 minutos (la tabla completa del gradiente se proporciona en la Tabla 1).
La espectrometría de masas utilizó ionización por electrospray con conmutación positiva/negativa y adquisición independiente de datos mediante escaneos de baja y alta energía (MSE). Rango de masa: m/z 100-1.500; voltaje capilar: 2,0 kV; cono de muestreo: 20 V; temperatura de origen: 120 °C; temperatura de desolvación: 360 °C; gas cónico: 50 L/h; gas de desolvación: 600 L/h. La función de alta energía empleaba energía escalonada de colisión de 20-50 eV. Los datos se procesaban en MassLynx v4.2 con corrección de masa de bloqueo y parámetros estándar de detección de picos. Una lista completa de 105 componentes identificados (fórmulas moleculares, m/z observados, tiempos de retención y puntuaciones de confianza) se proporciona en la Tabla Suplementaria 1.
5. Acoplamiento molecular
El acoplamiento se realizó en AutoDock 4.2 bajo un protocolo de ajuste inducido. La estructura tridimensional de S100β (PDB 3HCM) se preparó eliminando moléculas de agua cristalográficas, añadiendo hidrógenos polares y asignando cargas de Kollman. Se construyeron estructuras de ligandos que representan constituyentes característicos de la DBE, se protonó a pH fisiológico y se minimizaron la energía. El sitio de unión se definía por las coordenadas del ligando nativo; Los residuos de aminoácidos dentro de 6 Å del ligando nativo se trataron como flexibles durante el acoplamiento. Las cajas de cuadrícula cubrían todo el bolsillo con un espaciado de 0,375 Å. Los parámetros del algoritmo genético lamarckiano eran: tamaño poblacional 150; evaluaciones energéticas de hasta 2,5 × 10⁶; 100 corridas independientes por ligando. Las poses finales se clasificaron por energía libre de enlace predicha y agrupadas por RMSD; se visualizaron patrones de interacción (enlaces de hidrógeno, contactos hidrofóbicos π-π) para comprobar la consistencia con complejos S100β conocidos.
6. Modelo animal de colitis inducida por DSS y tratamiento con DBE
Los ratones machos C57BL/6J (8 semanas, 20-22 g) se aclimataron al menos 7 días a 22 ± 2 °C, humedad relativa del 50%-60%, ciclo claro-oscuro de 12 horas, con comida y agua a voluntad. Los animales se asignaron aleatoriamente en seis grupos (n = 10/grupo): control, modelo de dextrano sulfato de sodio (DSS), control positivo de sulfasalazina (SASP) y tratamientos de DBE de dosis bajas, medias y altas. El personal responsable de la puntuación histológica y la cuantificación de imágenes quedó ciego ante la asignación por grupos.
La colitis experimental se indujo con 2,0% (v/v) de DSS en agua potable durante 7 días, seguida de 1,0% de DSS durante 3 días y después agua normal durante 4 días antes de la eutanasia. La DBE se administraba una vez al día mediante enema a 10 mL/kg utilizando un catéter flexible insertado 2,5 cm en el recto; Los animales se mantuvieron en posición vertical durante 30 minutos para minimizar las fugas. Las dosis diarias de DBE fueron de 12,35, 27,4 y 49,4 g/kg/día para los grupos bajo, medio y alto, respectivamente; El SASP se administró a 0,5 g/kg/día como control positivo. Se registraban diariamente el peso corporal, la consistencia de las heces y la sangre oculta fecal para calcular el índice de actividad de la enfermedad. En el punto final, los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico 50 mg/kg de peso psiquial; Se recogía sangre del seno retroorbital utilizando capilares heparinizados; Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical. El colon fue extirpado desde la unión ileocecal hasta el recto, extendido suavemente y la longitud se medía bajo una tensión mínima. Los segmentos representativos se fijaron con un 4% de paraformaldehído; el tejido restante se congelaba rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaba a −80 °C.
7. Preparación de suero que contenga fármacos
Los machos de ratas Sprague-Dawley fueron asignados aleatoriamente en grupos de control y DBE (n = 6/grupo). El grupo DBE recibió 12,34 g/kg/día por gavage oral una vez al día durante 7 días; los controles recibieron agua purificada de igual volumen. Veinticuatro horas después de la última dosis, los animales fueron anestesiados y se recogió sangre total de la aorta abdominal. El suero se separó tras coagular durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de centrifugación a 1.500 × g durante 10 minutos a 4 °C. Los sueros se inactivaron por calor a 56 °C durante 30 minutos y se filtraron a través de membranas de 0,22 μm en condiciones estériles antes de su almacenamiento. El suero se alicitaba en tubos estériles y se almacenaba a −80 °C. Se excluyeron muestras hemólisadas, identificadas por una absorbancia elevada cerca de 414 nm.
8. Examen histológico (H&E)
El tejido del colon fijado en paraformaldehído al 4% durante 24 horas se deshidrató mediante etanoles graduados, se eliminó en xileno e incorporó en parafina. Las secciones (5 μm) se cortaron, deparafinizaron, rehidrataron y teñieron con hematoxilina durante 5 minutos, se azularon en agua corriente durante 5 minutos y se contrateñieron con eosina durante 2 minutos. Las láminas se montaron con resina y se examinaron para detectar arquitectura de criptas, densidad de células de cáliz, continuidad epitelial e infiltración inflamatoria. Las alteraciones representativas se indicarán con flechas/puntas de flecha y se definirán en las leyendas de las figuras; Las barras de escala (por ejemplo, 200 μm) y los umbrales visuales predefinidos se especificarán en las leyendas.
9. Inmunohistoquímica (IHC)
Las secciones de parafina se sometieron a la extracción de antígenos en un tampón de citrato (pH 6,0) durante 15-20 minutos a 95-98 °C, la templación de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos y el bloqueo con suero normal al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada. Tras el lavado, las secciones se procesaron utilizando un sistema de detección de estreptavidina-peroxidasa, desarrollado con DAB durante 2 minutos (monitorización microscópica), contra-tintadas con hematoxilina, deshidratadas y montadas. Se incluyeron controles negativos que carecían del anticuerpo primario en cada tanda.
10. Análisis de inmunofluorescencia (FI)
Las secciones incrustadas en parafina fueron desparafinizadas y sometidas a la recuperación de antígenos en el tampón EDTA (pH 8,0). Tras el enfriamiento, la unión inespecífica se bloqueó con albúmina sérica bovina al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra GFAP (1:500) y S100β (1:200), seguidas de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo (1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Los núcleos se contrateñieron con DAPI y las láminas se montaron en un medio anti-desvanecimiento. Las imágenes se capturaron usando objetivos idénticos, un tiempo de exposición fijo de 100 ms y una ganancia del detector de 1,0 en todos los grupos. La intensidad media de fluorescencia se cuantificó en ImageJ/Fiji v1.53 tras calibrar el tamaño del píxel, la resta de fondo (radio de la bola rodante 50 píxeles) y la normalización al área positiva para DAPI. Se analizaron al menos cinco réplicas biológicas por grupo y tres campos no solapados por réplica.
11. Cultivo celular y tratamientos
Células gliales entéricas de rata (designación CRL-2690) se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. La identidad celular se confirmó mediante perfiles de repeticiones cortas y en tándem, y los cultivos no tuvieron micoplasma. Se realizaron experimentos en los pasajes 5-15. Las células se sembraron en placas de 6 pozos a 2,0 × 10⁵ células por pozo en un medio de 2,0 mL/pozo y se dejaron adherirse durante 24 horas. Los grupos experimentales fueron: control no tratado, control vehicular, modelo, suero DBE e inhibidor.
Para la inducción del modelo, las células estuvieron expuestas a lipopolisacáridos (LPS, 1 μg/mL) más IFN-γ (20 ng/mL) durante 24 horas en medio completo; el valor correspondiente de U/mL para IFN-γ se indica en la Tabla de Materiales según la potencia específica del lote. Para el tratamiento con suero DBE, las células recibieron suero de rata inactivado por calor (56 °C, 30 min) y filtrado con 0,22 μm en medio completo durante 24 horas (el rango de dosis 5%-20% se utiliza para optimizar la viabilidad según lo especificado en la sección CCK-8). Para el tratamiento con inhibidor, se aplicó el inhibidor selectivo de S100β SBI-4211 (10-50 μM; 45 μM para lecturas clave) durante 24 horas. Los controles del vehículo igualaron el contenido de disolventes (0,1% DMSO (v/v)) con un medio por lo demás idéntico. Salvo que se indique lo contrario, los tratamientos se prepararon en medio precalentado (37 °C), y las células se enjuagaron 2× con PBS antes de la sustitución del tratamiento. Tras el tratamiento, se recogieron células para extracción de ARN, análisis de proteínas e inmunofluorescencia, como se detalla en las secciones posteriores. La replicación biológica fue n ≥ 5 cultivos independientes por condición.
12. Ensayo de viabilidad de células CCK-8
Las células se sembraron en placas de 96 pozos a 5 × 10³ celdas por pozo en un medio de 100 μL y se dejaron adherir durante la noche. El medio se sustituyó por suero tratado con DBE con medio al 5%, 10%, 15% o 20% (v/v) durante 24 horas. Se añadió reactivo CCK-8 (10 μL/pozo) y se incubaron placas durante 1 hora a 37 °C. La absorbancia se leyó a 450 nm con resta en blanco (medio + reactivo, sin células). La viabilidad se expresó como porcentaje del control del vehículo. Cada condición utilizó n ≥ 5 réplicas biológicas (cultivos independientes) con tres réplicas técnicas por cultivo.
13. ELISA para citocinas tisulares
El tejido del colon se homogeneizó sobre hielo en PBS (1:9, p/v) que contenía inhibidores de proteasas. Los homogeneados se clarificaron en 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C; se analizaron supernadantes para detectar IL-1β y TNF-α según los protocolos del kit. Los estándares y muestras se ejecutaron en duplicado, y las curvas se equiparon con un modelo logístico de cuatro parámetros (4PL) con R² ≥ 0,99; se aceptaron estándares calculados hacia atrás dentro del 85%-115% del valor nominal. La absorbancia se leía a 450 nm con una referencia de 620-650 nm cuando estaba disponible. Las concentraciones de citocinas se normalizaron al peso del tejido (pg/mg de tejido). Cada grupo incluía n ≥ 5 réplicas biológicas.
14. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)
El ARN total del tejido del colon (o de las células, según corresponda) se aisló con un kit de columna de espín de membrana sílice. La integridad del ARN se verificó mediante la inspección A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1 y la inspección con gel de agarosa. El ADN de primera cadena se sintetizó a partir de 1 μg de ARN con extracción genómica de ADN. qPCR utilizó mezcla maestra SYBR Green en un termociclador calibrado con el programa: 95 °C 30 s; 40 ciclos de 95 °C 5 s, 60 °C 30 s; curva de fusión de 65-95 °C en pasos de 0,5 °C/5 s. GAPDH actuó como control endógeno. La expresión relativa se calculó mediante 2⁻ΔΔCt tras verificar las eficiencias de los cebadores (90%-110%, a partir de pendientes de curvas estándar). Se incluyeron controles sin RT y sin plantilla. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 2. Cada grupo tenía n ≥ 5 réplicas biológicas y dos repeticiones técnicas por muestra.
15. Análisis de Western blot
Las proteínas del tejido del colon (o células) se extrajeron en un tampón RIPA con inhibidores de proteasa/fosfatasa y se cuantificaron mediante un ensayo de BCA. La proteína igual (30 μg/carril) se desnaturalizó, se resolvió en un gradiente SDS-PAGE del 4-20% y se transfirió a PVDF (0,45 μm; 0,2 μm para ≤ dianas de 20 kDa). Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5% durante 2 horas a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra GFAP (1:1.000), S100β (1:1.000), iNOS (1:1.000), NF-κB p65 (1:1.000), fosfo-NF-κB p65 (Ser536, 1:1.000), Ocludin (1:1.000), Claudin-1 (1:1.000) y GAPDH (1:5.000). Se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:5.000) durante 1 h a temperatura ambiente. Se desarrollaron señales con ECL; Los tiempos de exposición estaban limitados al rango dinámico lineal (10-90 s). Las transferencias se verificaron mediante tinción reversible de membrana antes del bloqueo. Las intensidades de bandas se cuantificaron en ImageJ/Fiji v1.53 tras la resta de fondo y se normalizaron a GAPDH. Pesos moleculares esperados: GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, Ocludin ~65 kDa, Claudin-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. Cada análisis incluyó n ≥ 5 réplicas biológicas.
16. Análisis estadístico
Los datos se analizaron en GraphPad Prism 8.0 y se presentan como media ± SEM. Para comparaciones de varios grupos, se utilizó ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc de Tukey; para comparaciones por pares, se aplicaron pruebas t de Student bicolas sin pares cuando era apropiado. Para diseños de curso temporal o de dos factores (por ejemplo, tratamiento × dosis o tratamiento × tiempo), se utilizó ANOVA bidireccional (medidas repetidas cuando corresponde) con corrección de Tukey o Dunnett, según lo especificado en las leyendas de las figuras. Las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene se utilizaron para examinar la normalidad y la homocedasticidad antes de las pruebas paramétricas; cuando se violaban las suposiciones, los datos se transformaban logarítmicamente o se analizaban con pruebas no paramétricas apropiadas (Kruskal-Wallis con el post hoc de Dunn; Mann-Whitney U por pareja). Los valores p exactos y las medidas de tamaño del efecto (η² para ANOVA, d de Cohen para pruebas t) se informan en las leyendas de las figuras cuando corresponde. Una p < de doble lado de 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Las leyendas de las figuras utilizan la siguiente notación para la significación: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 vs Control; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 vs DSS; Ns, no es significativo.
17. Resultados esperados y control de calidad
Se espera que el DSS acorte la longitud del colon, eleve el índice de actividad de la enfermedad e induca daños histológicos (distorsión arquitectónica de la cripta, agotamiento de las células calicipadas, erosión epitelial). El tratamiento con DBE debe mejorar estos índices de forma dependiente de la dosis y reducir los marcadores de activación enterico-glial. Las manchas occidentales deberían mostrar bandas en los pesos moleculares mencionados anteriormente, con señales aumentadas en DSS y atenuación con DBE o SBI-4211; las exposiciones deben mantenerse dentro del rango dinámico lineal. La inmunofluorescencia para GFAP y S100β debería mostrar intensidades medias elevadas en DSS y una reducción tras el tratamiento con DBE. Los cromatógramas LC-MS/MS deben mostrar tiempos de retención estables (deriva ≤ 0,2 min) y precisiones de masa dentro de ± 5 ppm para iones de referencia, con iones fragmentos característicos para los componentes clave. Los controles negativos (por ejemplo, la omisión de anticuerpos primarios) no deben proporcionar ninguna señal específica. Los parámetros de adquisición de imágenes (objetivo, exposición, ganancia, gamma) deben permanecer fijos entre los grupos para permitir comparaciones cuantitativas válidas.
18. Notas de resolución de problemas
La turbidez o las partículas en las soluciones de DBE indican una filtración o precipitación inadecuadas; Repite la filtración de 0,22 μm y confirma pH 6,5-7,5. La mortalidad excesiva o la pérdida de peso severa durante la exposición al DSS sugiere una sobreinducción; reducir la concentración de DSS, verificar el peso molecular de los lotes y reemplazar diariamente las soluciones de DSS. La cuantificación inconsistente de inmunofluorescencia suele reflejar exposición variable; Fija el tiempo de exposición y la ganancia, e incluye una diapositiva de referencia para la calibración por lotes. Las bandas débiles de western-blot pueden reflejar ineficiencia de subcarga o transferencia; Verifica la cuantificación de proteínas, selecciona el porcentaje o gradiente adecuado en gel y confirma la transferencia mediante tinción reversible de membrana. Un mal ajuste ELISA (R² < 0,99 o un retrocálculo estándar fuera del 85-115%) justifica repetir la curva estándar y volver a analizar muestras diluidas. Para qPCR con una eficiencia de cebador fuera del 90-110%, reoptimiza la temperatura de recocido o la concentración de cebador antes del análisis.
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Los autores no tienen nada que revelar.
Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de Construcción de Disciplinas Médicas Clave de Alto Nivel de la Administración Nacional de Medicina Tradicional China (ZYYSZX-2023256).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AutoDock 4.2 | Software de acoplamiento molecular | - | El Instituto de Investigación Scripps |
| Sulfato de Dextrano Sódico (DSS) | Químico para inducir colitis en ratones | 9011-18-1 | Sigma-Aldrich |
| Líquido de enema Dibai (DBE) | Mezcla herbal para el tratamiento de la colitis ulcerosa | - | Universidad de Medicina China de Pekín |
| DMEM (Eagle Medium modificado de Dulbecco) | Medio de cultivo celular | 11965-092 | Thermo Fisher |
| Suero fetal bovino (FBS) | Suplemento para cultivo celular | 16000-044 | Thermo Fisher |
| Microscopio de fluorescencia | Instrumento para la imagen de inmunofluorescencia | - | Olimpo |
| Sistema LC-MS/MS | Espectrómetro de masas para análisis LC-MS | - | Corporación Waters |
| Lipopolisacáridos (LPS) | Inducidor de inflamación en cultivo celular | L2630 | Sigma-Aldrich |
| Ciclador térmico de PCR | Equipos para qPCR | T100 | Bio-Rad |
| Anticuerpo primario (S100) | Anticuerpo para la detección de proteínas S100 | ABC1234 | Abcam |
| Kit de ensayo de proteínas (BCA) | Kit de cuantificación de proteínas | 23225 | Thermo Fisher |
| Interferón Recombinante (IFN) | Citocinas para la activación de EGC en cultivo celular | - | Sigma-Aldrich |
| Anticuerpos secundarios (conjugados con HRP) | Anticuerpo secundario para inmunohistoquímica | XYZ5678 | Thermo Fisher |
| Sulfazalazina (SASP) | Control positivo para colitis ulcerosa | - | Sigma-Aldrich |
| Equipamiento Western blot | Sistema de electroforesis para análisis de proteínas | - | Bio-Rad |
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