Preparación automatizada de muestras para el análisis multiplexado de modificaciones posttraduccionales de histonas unicelulares (sc-hPTM2)

Summary

Aquí presentamos un protocolo para automatizar el análisis de modificación posttraduccional de histonas unicelulares utilizando una estrategia de marcaje isotópico de dos plexos y la digestión con ArgC. Este flujo de trabajo permite un perfil cuantitativo, reproducible y de alta sensibilidad de la heterogeneidad de la cromatina y las respuestas epigenéticas a resolución de célula única.

Abstract

Las modificaciones postraduccionales de histonas (hPTMs) son reguladores centrales de la organización de la cromatina y la expresión génica. Su desregulación está implicada en el desarrollo, el cáncer y el envejecimiento. Aunque la espectrometría de masas es el método preferido para estudiar hPTM, la mayoría de los protocolos están diseñados para muestras masivas y no pueden resolver la variabilidad de célula a célula. Por tanto, extender el análisis PTM de histonas al nivel de célula única es esencial pero técnicamente desafiante, ya que las histonas son bajas en abundancia, ricas en lisina y fuertemente modificadas.

Aquí describimos un flujo de trabajo automatizado de proteómica de célula única para el análisis PTM de histonas utilizando el manejo de nanolíquidos. El sistema permite el procesamiento a escala de nanolitros de células individuales con un manejo mínimo y alta reproducibilidad. El flujo de trabajo incluye la digestión con ArgC Ultra proteasa, que corta los residuos de arginina y evita la necesidad de pasos de derivatización bloqueadores de lisina típicamente necesarios en la proteómica de histonas. Para permitir la comparación cuantitativa entre condiciones, aplicamos una estrategia de marcaje de dos plexos con anhídrido propiónico y su análogo deuterado, anhídrido propiónico-d10. Esta combinación de preparación automatizada de muestras, multiplexación isotópica y digestión ArgC Ultra da como resultado un protocolo simplificado y sensible para el análisis PTM de histonas unicelulares.

El método permite investigar la heterogeneidad de la cromatina y los efectos de perturbaciones epigenéticas a resolución de una sola célula. Para demostrar el flujo de trabajo, generamos esferoides a partir de células hepatocelulares de carcinoma HepG2/C3A y los tratamos con butirato de sodio, un inhibidor de la desacetilasa de histonas que induce la hiperacetilación.

Introduction

Las histonas son los componentes proteicos de los nucleosomas, las unidades repetidoras de la cromatina. Sus colas N-terminales son ricas en residuos de lisina y arginina y están altamente reguladas por modificaciones postraduccionales (PTM), como acetilación, metilación y fosforilación. Estas modificaciones influyen en la accesibilidad del ADN y, por tanto, controlan procesos como la transcripción, replicación y reparación. Los patrones alterados de PTM de histonas están fuertemente asociados con estados patológicos, desde el cáncer hasta la neurodegeneración y el envejecimiento ^1,2. Por esta razón, el análisis de la MTP de histonas ha despertado gran interés en la investigación en epigenética y proteómica. La espectrometría de masas (EM) proporciona análisis específicos de sitio y cuantitativos de modificaciones de histonas, pero las histonas presentan desafíos analíticos únicos. Su composición de aminoácidos, múltiples sitios de modificación y complejos patrones combinatorios los hacen más difíciles de analizar que las proteínas típicas. Los protocolos establecidos se basan en la derivatización química para bloquear los residuos de lisina antes de la digestión, mejorando la recuperación de péptidos y el rendimiento^{cromatográfico 3}. Aunque son efectivos en análisis masivos, estos protocolos de derivatización de varios pasos pueden introducir pérdidas problemáticas para entradas de celda única. El análisis de células individuales es cada vez más importante porque los sistemas biológicos son inherentemente heterogéneos. La histona a granel analiza señales medias en muchas células y, por tanto, no logra captar esta variabilidad. Las subpoblaciones celulares pueden diferir en sus estados de cromatina, y estas diferencias pueden impulsar el desarrollo, la reprogramación celular o las respuestas a^{fármacos 4,5}.

Aquí presentamos un método automatizado de preparación de muestras para el análisis multiplexado de histonas unicelulares PTM (sc-hPTM2). Este método se basa en el sistema CellenONE, que permite la dispensación precisa de células individuales y reactivos a escala de nanolitros de forma automatizada. Este método es una variación del método de preparación de muestras nano proteómica (nPOP), que introdujo por primera vez el uso de la preparación de gotas en una lámina^{de vidrio 6}. La plataforma nPOP cuenta con una proteómica avanzada automatizada de células individuales, pero su protocolo estándar de digestión triptética es subóptimo para las histonas debido a su alto contenido en lisina y a su extensa densidad de modificaciones. Aquí, adaptamos el sistema CellenONE para incorporar la derivatización de histonas de referencia con anhídrido propiónico e introducimos el marcaje isotópico, permitiendo una cuantificación precisa y completa de modificaciones post-traduccionales de histonas a resolución de célula única. Específicamente, simplificamos el protocolo utilizando ArgC Ultra proteasa para la digestión de proteínas. A diferencia de la tripsina, el ArgC solo se parte en los residuos de arginina y no requiere bloqueo de lisina. Esto elimina la necesidad de una estrategia de derivatización en dos pasos, simplificando el protocolo. Además, el método incorpora un esquema de marcaje isotópico de dos plexos usando anhídrido propiónico y anhídrido propiónico-d10, permitiendo analizar simultáneamente 2 células ^7,3. Tras la digestión y el marcado, se recuperan muestras de célula única y se analizan mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS)/MS utilizando adquisición independiente de datos (DIA). En nuestras manos, este método ha demostrado proporcionar un aumento tanto en la sensibilidad como en la reproducibilidad para la cuantificación de las PTM de histonas en comparación con la versión anterior^{de este método 8}.

Para demostrar el método, perfilamos la dinámica PTM de histonas unicelulares en esferoides derivados de células hepatocelulares de carcinoma HepG2/C3A. Tratamos estas esferoides con butirato de sodio, un inhibidor bien caracterizado de la desacetilasa de histonas que aumenta la acetilación de las histonas y sirve como referencia para^{la regulación 9,10} de la cromatina. Al comparar esferoides controlados y tratados con butirato de sodio a resolución unicelular, demostramos una prueba de principio de resultados representativos, destacando el potencial para aplicaciones más amplias en biología de la cromatina y epigenética del cáncer. Cabe destacar que, para el protocolo, nos referimos a una publicación anterior que describe el crecimiento y tratamiento de esferoides^{3D 10}, la adquisición de péptidos de histonas en espectrometría^{de masas 11} y el análisis de datos utilizando el software^{EpiProfile 12}.

Protocol

1. Buffers y reactivos

1. Medios de crecimiento celular para células HepG2/C3A: Prepare el Medio Modificado de Águila (DMEM, 4,5g/L de glucosa) de Dulbecco, que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS), aminoácidos no esenciales (1% v/v), L-glutamina (1% v/v) y penicilina/estreptomicina (0,5% v/v). El medio de cultivo se almacena a 4 °C.
2. Mezcla maestra: Preparar ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n-dodecil-β-D-maltosido (DDM) 0,03%, Ditiotreitol (DTT) 10 mM en agua de grado LC-MS.
3. Solución de AH: Preparar hidroxilamina al 1% (v/v) en agua de grado LC-MS.
4. Solución de lavado: Preparar 10 mL de una mezcla 50:50 de acetonitrilo/agua que contenga 0,1% (p/w) de ácido fórmico (todos de grado LC-MS).
5. Fase A Móvil (MPA) - 0,1% de ácido fórmico: Añadir 1 mL de ácido fórmico concentrado a 999 mL de agua de grado HPLC y mezclar bien.
6. Fase B móvil (MPB) - 80% acetonitrilo grado HPLC + 0,1% ácido fórmico: Añadir 800 mL de acetonitrilo grado HPLC a 199 mL de agua grado HPLC. A continuación, añade 1 mL de ácido fórmico concentrado a esta solución y mezcla.

2. Preparación de esferoides

1. Para la preparación de los esferoides, consulte Stransky S et ^al.11.
2. Cultivar células de carcinoma hepatocelular HepG2/C3A en un biorreactor tridimensional giratorio (3D) durante 5-7 días para promover una formación uniforme de esferoides hasta alcanzar un diámetro de ~400-600 μm. Utiliza DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% aminoácidos no esenciales, 1% de L-glutamina y 0,5% de penicilina/estreptomicina. Mantener los esferoides a 37 °C y un 5% de_CO2 hasta el tratamiento.
   NOTA: La Figura 1A representa el equipo utilizado para preparar los esferoides en el artículo de referencia.

3. Cultivo celular y tratamiento

1. Colocar ~10 esferoides en una placa de cultivo de tejido de 6 pozos que contenga 2 mL de medio de crecimiento.
2. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO₂ .
3. Trata los esferoides durante 24 horas con 5 mM de butirato de sodio o añade el mismo volumen de agua para el control (Figura 1B).

4. Aislamiento de celdas y preparación de suspensión de una sola celda

1. Tras 24 horas de tratamiento, incubar las células con 1 mL de triple a 37 °C durante 3-5 minutos.
2. Pipetea suavemente arriba y abajo hasta que el esferoide se descomponga y se obtengan células individuales.
3. Recoge las celdas en un tubo de 15 mL y lávalas, diluyendo hasta 10 mL con PBS 1x bien frío, centrifuga a 500 g durante 5 minutos a 4 °C y aspira el sobrenadante.
4. Resuspende las células en 1 mL de PBS 1x helado y añade tinción de células muertas verdes Sytox con una concentración final de 1 μM.
5. Incuba la célula con Sytox Green durante 20 minutos sobre hielo en un ambiente oscuro.
6. Lava la celda con 10 mL de PBS 1x bien frío, centrifuga a 500 g durante 5 minutos a 4 °C y aspira el sobrenadante.
7. Resuspende las células en 1 mL de PBS 1x helado y añade paraformaldehído (PFA) con una concentración final del 0,5%.
8. Incuba la célula con PFA durante 15 minutos sobre hielo.
   NOTA: Aunque Sytox green normalmente no es compatible con la fijación debido a la permeabilización de membrana, para las células que hemos probado la proporción de células Sytox green permanece igual hasta 8 horas después de la fijación sin signos de fuga de proteínas de histonas.
9. Lava la celda con 10 mL de PBS 1x bien frío, centrifuga a 500 g durante 5 minutos a 4 °C y aspira el sobrenadante.
10. Reconstituir las células a una concentración final de 200-500 células/μL.
    NOTA: Para las células pequeñas que no tienden a depositarse, se recomienda una concentración de 500 células/μL, mientras que para las células grandes que tienden a depositarse, se recomienda una concentración de 200 células/μL. Si la suspensión de la celda es propensa a la agregación, pásala por un colador de 40 μm antes de la aspiración para evitar que la tobera se obstruya. Si las células mayores a 40 μm son de interés y probablemente están presentes en una muestra, se puede usar un colador de 70 μm para eliminar agregados muy grandes.
11. Guarda las celdas sobre hielo hasta que se carguen en el instrumento para su clasificación.

5. Conexión de software e inicialización del sistema

1. Enciende el sistema cellenONE (Figura 2A), arranca el ordenador de control, inicia el software y abre el espacio de trabajo de usuario v2.0-nPOP2 ; todos los archivos de campo y las plantillas de ejecución necesarios para nPOP están precargados allí.
2. Asegúrate de que el enfriador del instrumento esté encendido y luego ajusta el valor de punto de rocío según la temperatura interna que el instrumento reporta actualmente.
3. Imprime el sistema con boquillas dispensadoras tipo 2 de recubrimiento PDC-70 (Figura 2B) instaladas en las ranuras 1 y 3, siguiendo las instrucciones en pantalla.
4. Ajusta el ancho de pulso y el voltaje de transmisión de cada boquilla a los valores especificados en el embalaje del fabricante.
   NOTA: Utilizar dos boquillas separadas mantiene la consistencia de dispensación: una entrega la suspensión de la celda, la otra los reactivos, por lo que cualquier residuo que se adhiera a la boquilla no comprometerá las gotas posteriores. Emplear ambas toberas durante el paso final de recogida también acelera la recuperación de la muestra.
   1. (PASO CRÍTICO) Para lograr la máxima eficiencia de captación, el offset z entre las dos toberas debería diferir en <50 μm. Determina esto definiendo la posición óptima de contacto para cada tobera y comparando las lecturas de altura Z en la pestaña de Configuración de Tobera.
5. Llena el depósito del humidificador con agua desionizada hasta la línea de relleno indicada.

6. Configuración previa a la ejecución en el manejador de líquidos

1. Selecciona la cantidad de láminas de vidrio (Figura 2C) a preparar. Esta elección define directamente el número total de células que se planea analizar.
2. Para un esquema de multiplexación de 2 plex (Figura 3A), carga una sola diapositiva con 320 celdas.

7. Dispensar un "foso" de dimetilsulfóxido (DMSO) alrededor de los bordes de la corredera

NOTA: La Figura 3B representa los pasos para preparar las muestras en el cellenONE partiendo del foso de DMSO. Como prevención adicional contra la evaporación de gotas, se dispensa DMSO a lo largo de los bordes de las láminas.

1. En la pestaña Principal, selecciona la carrera para 0_Dispense_DMSO_Moat.
2. Ve a la pestaña de Configuración de Destino , carga el archivo DMSO_Moat.fld desde la carpeta de esquema correspondiente y pon el número de campos en Y, coincidiendo con el número de diapositivas planeadas para procesar.
3. Alicuota de 150 μL de DMSO de grado LC-MS en un nuevo tubo PCR y colócalo en la posición 2 de la estación CellenWASH con la tapa del tubo orientada hacia la puerta del instrumento.
4. Abre la pestaña Ejecutar y haz clic en Iniciar Correr. El sistema aspirará 10 μL de DMSO y hará una pausa para confirmar por el usuario la estabilidad de la gota. Dispara tres gotas de prueba de autodrop (Figura 4A); si los tres están perfectamente formados, haz clic en Continuar Ejecutar.
5. Tras la dispensación, las boquillas se enjuaguan automáticamente y el instrumento captura imágenes en todas las láminas para el control de calidad. Revisa las imágenes para verificar una gota DMSO uniforme en cada diapositiva y para comprobar si faltan o no están en el objetivo (Figura 4B).

8. Dispensar DMSO

1. En la pestaña Principal , selecciona la carrera para 1_Dispense_DMSO.
2. Abre la pestaña de Configuración de Objetivos , importa el archivo de campo DMSO.fld (Figura 4C) desde el directorio de esquema correspondiente y configura Número de Campos a Y, coincidiendo con el recuento de diapositivas que planeas procesar.
3. Alicuota de 150 μL de DMSO de grado LC-MS en un nuevo tubo PCR y colócalo en la posición 2 de la estación CellenWASH con la tapa del tubo orientada hacia la puerta del instrumento.
4. Abre la pestaña Ejecutar y haz clic en Iniciar Correr. El sistema aspirará 10 μL de DMSO y hará una pausa para confirmar por el usuario la estabilidad de la gota. Disparar tres gotas de prueba de autodrop; si los tres están perfectamente formados, haz clic en Continuar Ejecutar.
5. Cuando termina la dispensación, el software enjuagua automáticamente las boquillas y captura imágenes en cada lámina para garantizar la calidad. Revisa las imágenes para verificar que hay una gota DMSO uniforme en cada lámina y para comprobar si faltan o no están en el objetivo.

9. Dispensación de celda

1. En la pestaña Principal , selecciona la carrera para 2_Dispense_Cells.
2. En la pestaña de Configuración de Destino , abre la subcarpeta Archivos de Campo Celdas del directorio del esquema de multiplexación elegido.
3. Como el experimento implica dos condiciones, elige el archivo de campo que coincida con la muestra que está a punto de ordenar: ya sea CellType_A.fld o CellType_B.fld.
4. Después de cargar el archivo, establece el número de campos a Y, para que sea igual al total de diapositivas de esta ejecución.
5. Desgasifica la suspensión de la celda del paso 4.11 con una bomba de vacío durante 10 minutos sobre hielo.
6. Transfiere 150 μL de la suspensión de la celda preparada a un CellenVIAL limpio, y luego coloque el vial en la ranura 1 del carrusel CellenWASH con su tapa apuntando hacia la puerta del instrumento.
7. Ve a la pestaña de Configuración de la boquilla > Hacer tarea y ejecuta Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 para aspirar la muestra del vial.
8. Permaneciendo en la pestaña de Configuración de la Boquilla , inicia el visor dispensador de celdas (Figura 5A) y ejecuta la rutina de mapeo para definir la zona de eyección y los objetos de puerta según el tamaño y la elongación. Los parámetros de aislamiento de célula única mostrados en la Figura 5A corresponden a los ajustes exactos usados para dispensar células de HepG2/C3A disociadas de esferoides.
9. Luego activa el modo fluorescente seleccionando T > F. Pon el modo de selección en negativo. Aumentar el rango de parámetros de aislamiento para tamaño e intensidad desde los valores mínimos hasta los máximos para asegurar que no se aislen células muertas.
10. Verifica con los parámetros de mapeo, abre la pestaña Ejecutar y haz clic en Iniciar Ejecutar, y luego sigue las indicaciones del software. Cuando termina la dispensación, el instrumento limpiará automáticamente las boquillas y capturará imágenes de diapositivas para revisar la ubicación y uniformidad de las gotas.
    NOTA: Durante la clasificación de celdas, se toman imágenes de cada celda individual que se aísla durante la ejecución (Figura 5B).
11. Cuando termine la clasificación de celdas, cierra la ventana de dispensación.
12. Mantener cualquier suspensión de celda sobrante en hielo hasta que termine la sección 9; El excedente puede utilizarse posteriormente para muestras a granel, construcción empírica de bibliotecas o estudios adicionales de validación.

10. Dispensador de mezcla maestra de digestión

1. En la pestaña Principal , selecciona la carrera para 2_Dispense_Digest_10ulPickup.
2. Abre la pestaña de Configuración de Destino , carga Digest.fld desde la carpeta correspondiente del esquema multiplexado y establece Número de campos a Y para que sea igual al recuento de diapositivas de esta ejecución.
3. Prepara una mezcla maestra de digestión fresca y desgasifica la solución con una bomba de vacío durante 10 minutos sobre hielo (mezcla maestra: ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0,03%, DTT 10 mM en agua de grado LC-MS).
4. Pipete 20 μL de la mezcla maestra en una placa de 384 pozos y colócala dentro del sistema X1.
5. En la pestaña Ejecutar , haz clic en Iniciar Correr y sigue las indicaciones. Después de que el sistema aspire el reactivo, confirma la estabilidad de las gotas cuando se lo solicite.
6. Cuando termina la dispensación, el instrumento enjuagua automáticamente las boquillas y fotografía cada lámina; revisa las imágenes para verificar que cada gota recibió la mezcla digestiva de forma uniforme.
7. Incuba las láminas durante la noche para su digestión, manteniendo la humedad y el punto de rocío especificados. Cada gota contiene ~13,5 nL de mezcla digestiva. Realizar la digestión durante la noche a ~75 % de humedad relativa, manteniendo el punto de rocío 1-2 °C por debajo de la temperatura de la cámara para evitar la evaporación de gotas.

11. Incubación durante la noche

1. En la pestaña Principal , elige la carrera para 4_Incubation_16h.
2. Cambia a la pestaña Ejecutar , haz clic en Iniciar Correr.
   NOTA: Los instrumentos tomarán imágenes de las láminas cada 30 minutos para monitorizar el estado de las gotas. Si se secan o se hinchan durante la incubación, ajusta el punto de rocío según sea necesario.
3. Cuando termina la incubación, aparecerá un mensaje diciendo que la incubación ha terminado.
   NOTA: Las digestiones rápidas (≤4 h) pueden ser posibles con condiciones más altas de enzima a sustrato efectivo; Esto no se evaluó aquí, por lo que la condición validada permanece a 16 horas.

12. Evaporación

NOTA: Antes de pasar al paso del etiquetado, se recomienda comprobar el estado de las gotas para asegurarse de que no estén demasiado hinchadas con agua, ya que el agua podría interferir con la eficiencia del etiquetado. Para ello, se recomienda la fase de evaporación.

1. En la pestaña Principal , elige la carrera para 5_Evaporation.
2. Ve a Archivo, Control de la Unidad de Refrigeración, y bajo Control de punto de rocío ajusta la Temperatura de Control Fija a 23 °C.
3. Cambia a la pestaña Ejecutar , haz clic en Iniciar Correr. El secado durará 5 minutos y los instrumentos capturarán automáticamente las fotos de las diapositivas después del secado.
4. Inspecciona las fotos; Si las gotas están lo suficientemente secas, detén la fuga. Si no, haz clic en continuar y seca durante otros 5 minutos (Figura 6A).
5. Al final de la partida, vuelve al control anterior de punto de rocío.

13. Dispensar etiquetas

1. En la pestaña Principal , elige la carrera para 6_Dispense_PA_Labels.
2. Ve a la pestaña de Configuración de Destino , carga el archivo Labels.fld desde la carpeta de esquema correspondiente y pon el número de campos en Y, coincidiendo con el número de diapositivas planeadas para procesar.
3. Una cuota de 150 μL de DMSO de grado LC-MS en la ranura 2 de la estación CellenWASH.
4. Preparar una solución stock de los dos stocks de marcado para la derivatización multiplexada de histonas: anhídrido propiónico al 25% (v/v) en DMSO y 25% (v/v) anhídrido_{propiónico-d 10} en DMSO.
   NOTA: Desgasifica ambas soluciones antes de transferirlas a la placa para minimizar la formación de burbujas.
5. Dispensar 20 μL de cada reactivo de marcado en los pozos designados de una placa de 384 pozos y colocar la placa dentro del sistema X1. Cada gota recibe ~10 nL de reactivo de marcado (25% anhídrido propiónico o 25% anhídrido_{propiónico-d 10} en DMSO).
6. Cambia a la pestaña Ejecutar , haz clic en Iniciar Ejecutar y sigue las indicaciones.
7. Deja que las etiquetas reaccionen al deslizarse durante 1 hora.
8. Tras la dispensación, el instrumento enjuagua automáticamente las boquillas y fotografía cada portaobjetos. Revisa las imágenes para confirmar una distribución uniforme y la colocación correcta de las gotas en todas las láminas.

14. Dispensar HA

1. Prepara la solución de ácido hialurónico y desgásala antes de usarla.
2. Carga el frasco. Pipete 150 μL de la solución HA en un tubo PCR limpio, colócala en la ranura 2 de CellenWASH y orienta la tapa hacia la puerta del instrumento.
3. Selecciona el perfil de la carrera. En la pestaña Principal , elige 7_Dispense_Quench.
4. Configura el archivo de campo. Abre la pestaña de Configuración de Destino , carga HA.fld desde la carpeta correspondiente del esquema multiplexado y pon Número de campos en Y para que sea igual al conteo total de diapositivas.
5. Empieza la carrera. Navega a Ejecutar, haz clic en Iniciar Ejecutar y sigue las instrucciones en pantalla.
6. Incubar. Deja que el HA reaccione en las diapositivas durante 30 minutos.
7. Verifica la dispensación. Tras finalizar, el sistema limpia las boquillas y captura imágenes de cada diapositiva; revisa estas imágenes para confirmar la colocación y volumen uniformes de las gotas.

15. Recogida de muestra

1. Prepara la solución de lavado en el WashTray XL.
2. Prepara la bandeja de recogida. Dispensar 2 μL de DDM al 0,01% (p/w) en agua de grado LC-MS en cada pozo de una placa fresca de 384 pozos y colocar la placa dentro del manejador de líquidos.
3. Elige el trayecto de recogida. En la pestaña Principal , selecciona el perfil 8_Pickup_2plex.
4. Carga el archivo de campo. Abre la pestaña de Configuración de Objetivo , importa Pick-up.fld desde el directorio correcto del esquema multiplexado y establece Número de campos en Y para que coincida con el recuento de diapositivas.
5. Ejecuta la carrera. Cambia a la pestaña Ejecutar , haz clic en Iniciar Ejecutar y sigue las indicaciones. El instrumento recogerá cada gota, limpiará las boquillas e imaginará las láminas para revisarlas y confirmar que se ha recuperado cada muestra.

16. Procesamiento posterior a la recogida

1. Sella la placa de 384 pozos con lámina adhesiva y centrifuga brevemente para llevar las gotas al fondo de los pozos.
2. Retira el papel de aluminio y seca las muestras a baja temperatura en un concentrador de vacío.
3. Sella la placa con papel adhesivo y guarda la placa seca a -80 °C hasta que esté lista para el análisis LC-MS/MS.

17. Preparación de muestras a granel

1. Utilizando la suspensión sobrante de la sección 9, centrifuga las células y vuelve a suspender en 1x PBS para obtener una concentración de 2.000 células/μL. Esto debe realizarse tras la finalización del artículo 10.
2. Lisis térmica: congelar bruscamente la suspensión restante a -80 °C durante 10 minutos, luego aplicar choque térmico a 90 °C durante 10 minutos.
3. Deja que el tubo se enfríe hasta la temperatura ambiente.
4. Transfiere 25 μL del lisato a un tubo PCR y añade 5 μL de la mezcla digestiva previamente preparada.
5. Incubar durante la noche (≈ 16 horas) a 37 °C en un ciclador térmico.
6. Derivatización por etiqueta de luz: añadir 5 μL de una nueva etiqueta ligera al 25% (v/v) en acetonitrilo e incubar durante 1 hora.
7. Templación por reacción: añadir 5 μL de solución de hidroxilamina (HA) al 1% (p/p) e incubar durante 30 minutos.
8. Seque la muestra en un concentrador de vacío a baja temperatura y luego almacene a -80 °C hasta que esté lista para LC-MS/MS.

18. Configuración LC/MS y adquisición de datos

NOTA: Para recopilar los datos de este manuscrito, se instala un sistema LC-MS\MS con una columna analítica de Óptica Iónica de 75 μm diámetro interior x 25 cm x 1,7 μm.

1. Prepara las fases móviles para que funcionen en el HPLC:
   Fase A móvil (AMP): 0,1% de ácido fórmico en agua de grado HPLC
   Fase B móvil (MPB): 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo de grado HPLC
2. Programar el método HPLC para un gradiente activo de 30 minutos: 5-23% MPB en 25,7 min, 23-35% MPB en 2,6 min y 35-45% MPB en 1,7 min, a un caudal de 200 nL/min. Programa el automuestreador para volver a suspender la muestra en 0,1% FA + 0,01% DDM para recogida 'seca'.
3. Configurar el método de adquisición de MS para realizar adquisiciones independientes de datos (DIA):
   NOTA: Estos ajustes son específicos para una Thermo Exploris 480 equipada con FAIMS Pro Duo y pueden variar según tu instrumento. Se recomienda utilizar aquellos que son comunes en la proteómica unicelular DIA con rangos m/z similares a los que se describen a continuación.
   1. Configura el MS para que sea un escaneo completo de 300 a 1100 m/z con una resolución de 120.000, objetivo AGC del 300%, tiempo máximo de inyección de 246 ms y FAIMS CV de -50 V.
   2. Configura el MS/MS para que sea un escaneo DIA de 300-1100 m/z con una resolución de 60.000, ventana de aislamiento de 50 m/z, energía de colisión HCD del 27%, primera masa de 120 m/z, objetivo AGC del 1000%, tiempo máximo de inyección de 118 ms y CV FAIMS de -50 V.
4. Retira el sello de lámina de la placa de 384 pozos que contiene las pilas individuales. Reconstituir la muestra a granel a 100 celdas/μL en 0,1% FA + 0,01% DDM y transferir 10 μL a un pozo vacío, como P24. Luego, sella la placa con una alfombra de goma perforable y cárgala en el autosampler.
5. Ejecuciones en cola: ejecuta primero las muestras en volumen y luego los conjuntos de celdas individuales.

19. Análisis de datos

1. Ejecuta los datos en bruto con EpiProfile2.1 para obtener la salida con las abundancias de peptidoformas para las células marcadas con anhídrido propiónico.
   NOTA: Las muestras deben adquirirse en un instrumento termodinámico para poder utilizar EpiProfile 2.1 para el procesamiento de datos. Este software extrae aproximadamente 250 peptidoformas con su versión canónica, pero es editable dependiendo del organismo, modificaciones adicionales de interés, mutaciones, ^etc.12.
2. Ejecuta los datos en bruto con EpiProfile2.1_D5 para obtener la salida con las abundancias de peptidoformas para las células marcadas con anhídrido propiónico-d10.
3. Realiza el mapeo que vincula los metadatos con las salidas de Epiprofile mediante el programa quantQC.
4. Filtra las muestras fallidas comparando con las que no hay más.
5. Filtra peptidoformas que no estén en al menos el 50% de las muestras.
6. Filtrar peptidoformas cuya señal de intensidad de la célula individual no sea mayor que la señal del 150% en los espacios en blanco.
7. Obtén la tabla de resultados (Figura 7A) y procesa los datos según sea necesario.

Results

Para demostrar la aplicación de nuestro flujo de trabajo de proteómica de histonas unicelulares utilizando nuestro sistema, analizamos esferoides de células HepG2/C3A tratadas con 5 mM de butirato de sodio durante 24 horas. Tras la adquisición de LC-MS/MS, se procesaron los datos en bruto con EpiProfile tanto para el marcaje ligero (anhídrido propiónico) como para el marcaje pesado (anhídrido propiónico-d10), obteniendo datos normalizados que representan las abundancias de los péptidos y las marcas de histonas. ...

Discussion

La capacidad de medir modificaciones postraduccionales de histonas a nivel de célula única representa un paso fundamental para comprender la verdadera heterogeneidad de la regulación de la cromatina. Los métodos tradicionales de masa han proporcionado conocimientos invaluables sobre la distribución media de hPTM en los tejidos, pero enmascaran la variabilidad célula a célula que cada vez se reconoce más como biológicamente significativa⁵. Los enfoques pro...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos microcentrífugas de 1,5 mL	Bio-Rad	2239480
1000 y micro; Puntas de pipeta de calibre ancho en L	Fisher Scientific	14222703
200 y micro; Puntas de pipeta de calibre ancho en L	Fisher Scientific	14222730
Placa PCR de 384 pozos Lo Bind	Eppendorf	30129547
Colector de vacío de 96 pozos	Millipore	MAVM0960R
Acetonitrilo, grado Optima LC-MS/MS	Fisher Scientific	A955-1
Láminas adhesivas de placas PCR	Thermo Fisher	AB0626
Acetonitrilo anhidro	Fisher Scientific	AA42311AK	Solución de stock de etiquetas para granel
Arg-C Ultra, grado espectrometría de masas	Promega	VA1831
Agua de grado de cultivo celular	Corning	25-055-CV
CellenVIALs	SCIENION	/	El número de catálogo viene acompañado de una cita
DMSO, anhidro	Thermo Fisher	D12345	Solución de stock de etiquetas
DTT	Sigma	D0632-5G
Eagle's Medium Modificado (DMEM) de Dulbecco	Fisher Scientific	MT17205CV
Suero fetal bovino	Fisher Scientific	MT35010CV
Ácido fórmico	Termodinámica	28905
Ácido fórmico 98%– 100% para LC-MS LiChropur	Sigma	5330020050
La solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Puro)	Thermo Fisher	11344041
Acetonitrilo de grado HPLC	Fisher Scientific	A955-4
Agua de calidad HPLC	Fisher Scientific	W5-4
Solución de hidroxilamina 50% en H2O	Sigma	438227-50ML
L-glutamina	Fisher Scientific	MT25015CI
Detergente n-Dodecil-beta-Maltoside (DDM)	Fisher Scientific	BN2005
Aminoácidos no esenciales	Fisher Scientific	MT25025CI
Espectrómetro de Masas Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldehído 16% de solución acuosa de grado EM	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15710-S
PDC-CM (recubrimiento tipo 2)	SCIENION	/	El número de catálogo viene acompañado de una cita
Penicilina-estreptomicina	Fisher Scientific	MT3002CI
Solución fisiológica tamponada (PBS), 10x, pH 7,4, libre de RNasa	Thermo Fisher	AM9625
Dimetilsulfóxido de perforación (DMSO), grado LC-MS	Thermo Fisher	85190
Pistola de pipeta	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Anhídrido propiónico ≥ 99%	Sigma	240311-50G
Anhídrido propiónico-d10 & ge; 98 átomo % D, ≥ 99% (CP)	Sigma	615692-1G
Centrífuga refrigerada	Termodinámica	75-217-420
Deslizadores de vidrio recubiertos SciCHIP H1	SCIENION	/	El número de catálogo viene acompañado de una cita
Concentrador de vacío SpeedVac (placas de 96 pozos)	Termodinámica	15308325	Savant SPD1010
Capucha estéril	Termodinámica	1375
Pipetas serológicas estériles	Fisher Scientific	1367549
Tinción de células muertas verdes SYTOX, para citometría de flujo	Thermo Fisher	S34860
TrypLE Express Enzyme (1X), sin fenol rojo	Thermo Fisher	12604013
Vórtice	Sigma	Z258415
Baños María	Fisher Scientific	FSGPD10