Artículo de método

Caracterización de la secreción de vesículas extracelulares derivadas de adipocitos utilizando un modelo ratón reportero CD63-GFP in vivo e in vitro

DOI:

10.3791/69670

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5 de diciembre de 2025

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1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

En este artículo

Resumen

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El protocolo utiliza una línea de ratón reportera CD63-GFP específica para adipocitos para visualizar y cuantificar la secreción de vesículas extracelulares (EV) derivadas de adipocitos y demostrar su absorción por células progenitoras, revelando una vía paracrina dentro del tejido adiposo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los adipocitos son cada vez más reconocidos como células endocrinas activas que secretan cantidades sustanciales de EVs enriquecidos en proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Sin embargo, los mecanismos que rigen la secreción de EV y la dinámica de su liberación en diferentes contextos biológicos no se comprenden completamente. Para cubrir esta brecha, generamos una nueva línea de ratones reportero CD63-GFP específica para adipocitos, en la que la expresión del CD63 etiquetado con GFP es impulsada por el promotor de adiponectina, permitiendo el marcado selectivo y el seguimiento de los AdEVs in vivo. Utilizando este modelo reportero, examinamos la secreción de ADEVs y su entrega a los APCs dentro de los tejidos adiposos. La imagen confocal y la citometría de flujo revelaron que los VA son absorbidos activamente por los APC, lo que pone de manifiesto un mecanismo previamente poco valorado de comunicación paracrina dentro del microambiente adiposo.

Para complementar los estudios in vivo , se estableció un sistema in vitro que permite el monitoreo directo de la secreción de EV a partir de adipocitos diferenciados. Los APC se aislaron de tejidos adiposos blancos subcutáneos de ratones reporteros e indujeron a diferenciarse en adipocitos maduros. En estas células, las señales CD63-GFP se observaron como puntos discretos y se enriquecieron en la membrana plasmática cuando se inhibía la secreción de EV, lo que coincidía con la acumulación de vesículas al bloquear la liberación. En condiciones normales de crecimiento, los VE secretados en el medio de cultivo se concentraron y posteriormente se purificaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño, lo que permitió análisis funcionales y bioquímicos posteriores.

Esta plataforma puede aplicarse a APCs derivados de otros depósitos adiposos, como tejido adiposo blanco y marrón epididimático, o diferenciándolos en adipocitos específicos de depósito, permitiendo así comparar la secreción de EV entre diferentes tipos de adipocitos.

En conjunto, estos enfoques introducen una herramienta genética robusta y un sistema complementario in vitro para diseccionar la dinámica de la secreción y la selección de AdEV. Estos avances arrojan luz sobre la comunicación celular intra-adiposa y sentan las bases para comprender la influencia metabólica más amplia de los ADEV en la salud y la enfermedad.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tejido adiposo es cada vez más reconocido como un órgano endocrino dinámico con roles clave en la homeostasis energética de todo el cuerpo 1,2,3,4,5. Más allá de su función clásica como depósito de almacenamiento de lípidos, los adipocitos regulan la sensibilidad sistémica a la insulina, y las alteraciones en la masa adiposa —ya sean excesivas o deficientes— están relacionadas con la resistencia a la insulina y enfermedadesmetabólicas 6,7,8,9. Un mecanismo propuesto para contribuir a esta capacidad reguladora es la comunicación intercelular a través de factores secretados. Aunque las adipocinas están bien establecidas como señales endocrinas clave del tejidoadiposo 10,11,12,13,14,15,16,17,18, los adipocitos también liberan un número considerable de vesículas extracelulares (EV), partículas unidas a la membrana que contienen lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y metabolitos. Aún no está claro si los VE secretados por adipocitos (AdEVs) también contienen glicanos, como otros tipos de VE, 19,20,21,22,23,24. Se ha demostrado que los adipocitos son una fuente principal de EVs, ya que aproximadamente el 80% de los microARNs exosómicos circulantes se originan en modelos murinos, como se demostró usando ratones knockout específicos de Dicer bajo condicionesbasales 25. Se han reportado los roles de los VEeA en el metabolismo, la inflamación, la sensibilidad a la insulina y la adipogénesis, pero siguen siendo incompletoscomprendidos 26,27,28,29. Otras funciones potenciales, especialmente en la mediación de diafonía con otros tipos celulares y órganos, aún son en gran medida desconocidas. Laabundancia de 26 EVs sugiere que podrían desempeñar papeles importantes tanto en la señalización local como sistémica, pero la importancia biológica y los mecanismos de acción de los ADVs siguen en gran medida poco explorados. Esta carencia de conocimiento pone de manifiesto la necesidad de métodos robustos y especializados para estudiar la secreción y función de las AdEV.

Para cubrir esta brecha, generamos ratones CD63-GFP específicos para adipocitos (AdipCD63-GFP) cruzando ratones Adiponectin-Cre con ratones Stopfl/fl/CD63-GFP (cepa#:036865, JAX). Se utilizaron hermanos de camadaStop fl/fl/CD63-GFP, que no expresaron CD63-GFP en ausencia de Cre, como controles. La cepa reportera CD63-GFP se ha utilizado con éxito para rastrear EVs específicos de tipo celular in vivo, incluyendo EVs derivados de endoteliosy neuronas 30,31. Dado que la adiponectina se expresa únicamente en adipocitos maduros y no en células progenitoras de adipocitos (APCs)32,33, y CD63 es un marcador de los EVs34, los EVs GFP+ detectados en circulación y tejidos pueden identificarse específicamente como ADEVs. Por ello, en este estudio, los VE GFP+ detectados en los APCs se interpretan como ADEVs que han sido absorbidos por estas células progenitoras. Este sistema reportero permite el monitoreo directo de la liberación de vesículas y de posibles interacciones objetivo in vivo e in vitro, facilitando el estudio de los ADEV en otros tipos celulares de tejido adiposo. Es importante destacar que los VA son especialmente ricos en lípidos en comparación con los EV de otros tipos celulares, lo que los hace más flotantes, frágiles y difíciles de recuperar con los métodos tradicionales deultracentrifugación 35,36,37. Altas fuerzas centrífugas pueden dañar estas vesículas o provocar una pérdida y contaminación significativas de muestras, complicando el análisis aguas abajo. Para superar estas limitaciones, optimizamos un flujo de trabajo que combina múltiples pasos de centrifugación a baja velocidad con cromatografía de exclusión por tamaño, que minimiza el esfuerzo cortante, preserva la integridad de las vesículas y mejora la pureza y el rendimiento, permitiendo una cuantificación precisa y estudios funcionales. En conjunto, el sistema CD63-GFP y esta canalización optimizada de aislamiento proporcionan un enfoque accesible y reproducible para investigar la secreción y función de AdEV en la diafonía del tejido adiposo y la regulación metabólica sistémica.

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Protocolo

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De acuerdo con las directrices de cuidado y uso animal del Albert Einstein College of Medicine, los ratones machos fueron alojados en grupo a 22 °C con una humedad relativa del 30-70% en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, se les proporcionó acceso ad libitum a comida y agua, y se mantuvieron en un fondo C57BL/6J.

1. Detección in vivo de AdEVs secretos mediante la absorción por APCs

  1. Preparación del tampón
    1. Amortiguador de digestión: Prepara DMEM tamponado con HEPES añadiendo 0,5 mL de 1 M HEPES y 0,5 g de albúmina sérica bovina pobre en ácidos grasos (BSA) a 50 mL de DMEM. Mezcla hasta que se disuelva.
    2. Lavar el tampón: Preparar PBS con 2,5 mM de ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) y suero fetal bovino al 4% (FBS).
    3. Prepara Liberasa y DNasa 1 estocada a 5 mg/mL y 5 KU/mL. Guarda a -20 °C. Descongela justo antes de usar.
  2. Recogida y digestión del tejido adiposo inguinal
    NOTA: Ratones control AdipCD63-GFP y CD63-GFP de cuatro meses fueron eutanasiados mediante inhalación de dióxido de carbono.
    1. Extirpe tejidos adiposos mediante técnica estéril y coloca 1 g de tejido en 0,5 mL de tampón digestivo, y tritura tejido finamente con tijeras estériles en piezas de no más de 1 mm.
    2. Suspender el tejido picado en 10 mL de tampón digerido que contiene 0,5 mg/mL de Liberasa y 50 U/mL de DNasa 1.
    3. Incubar a 37 °C sobre un agitador orbital (100 rpm) durante 30-60 minutos. Mezcla suavemente el tejido invirtiendo el tubo varias veces durante la incubación. Cuando la solución aparece turbia y no quedan fragmentos de tejido visibles, la digestión se considera completa.
  3. Aislamiento de los APC
    1. Diluye la suspensión con dos volúmenes del buffer de digestión y invierte suavemente el tubo 3-4 veces.
    2. Pasa por un filtro estéril de 100 μm para eliminar cualquier tejido no digerido.
    3. Centrifuga el filtrado a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    4. Descarta la parte del adipocito sobrenadante y etiqueta el pellet como fracción vascular estromal (SVF).
    5. Prepara un tampón de lisis fresco de 1× glóbulos rojos (RBC) con agua estéril. Lisa los glóbulos rojos del SVF incubándolos sobre hielo durante 5 minutos, protegido de la luz.
    6. Añade dos volúmenes de tampón de lavado y luego filtrado en centrifugadora a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    7. Seguir el protocolo de kit de aislamiento de progenitores del tejido adiposo (ratón), resuspender la SVF en 80 μL de tampón (PBS, pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) por gramo de tejido.
    8. Añade 20 μL de cóctel de agotamiento de progenitores no adipocitos por gramo de tejido.
    9. Mezcla e incuba durante 15 minutos a 2-8 °C en la oscuridad.
    10. Pasa la muestra por la columna LS y recoge el flujo directo.
    11. Centrifugar el flujo de paso (negativo para CD31, CD45, Ter119) a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C para obtener los APCs para el estudio.
  4. Detección de ADEVs secretados mediante la captación de APC mediante microscopía confocal
    1. Sembra 250 μL de APCs aislados (1 × 104 células/mL) de ratones AdipCD63-GFP o CD63-GFP sobre portaobjetos de cámara de 8 pozos recubiertos de colágeno y permite que las células se unan durante aproximadamente 6 horas.
    2. Fija las células con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos para preservar las estructuras celulares y EV para la imagen.
      NOTA: En estos ensayos, las señales de GFP marcan los AdEVs, y su detección en APCs mediante microscopía confocal indica la captación de AdEVs por estas células progenitoras.
    3. Lava las láminas tres veces con PBS, monta con medio antidesvanecimiento y captura señales GFP usando un microscopio confocal equipado con un objetivo de inmersión en aceite del 63×. Adquirir imágenes como pilas de la serie z con un paso de 0,5 μm, utilizando un láser de 488 nm para excitación GFP y detección de emisiones a 500-550 nm.
  5. Detección de VA secretados mediante captación de APC mediante citometría de flujo
    1. Cuenta APCs y diluye el tinte de viabilidad (por ejemplo, Zombie) 1:1000 en PBS 1X. Suspender las células a 1 × 106 por 100 μL. Incubar durante 20 minutos sobre hielo, protegidas de la luz.
    2. Lava las células una vez con el buffer de lavado. Centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    3. Suspender las células en un tampón de tinción brillante a 1 × 106 celdas por 100 μL.
    4. Bloquear la unión inespecífica con el reactivo bloqueador de los receptores Fc (por ejemplo, anti-CD16/CD32) 1:100 sobre hielo durante 10 minutos.
    5. Pre-centrifuga el anticuerpo Sca-1 a 6.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Luego añade 1 μL del anticuerpo Sca-1 al tubo APC e incuba durante 20 minutos en hielo, manteniendo el tubo cubierto con papel de aluminio.
    6. Lava dos veces con 1 mL de tampón de lavado y centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    7. Suspender las células en un tampón de lavado alrededor de 1 × 106 células por 500 μL para la clasificación de citometría de flujo. Adquirir datos para las células Sca1+ y GFP+ en un citómetro de flujo espectral equipado con un láser violeta de 405 nm (filtro 450/50 nm para Pacific Blue) y un láser azul de 488 nm (filtro de 530/30 nm para GFP). Analizar las muestras utilizando el software en ejecución del instrumento, con celdas Sca1+ con puertas de contenido, y el subconjunto GFP+ dentro de esta población analizado, como se muestra en la Figura 2.

2. Detección y análisis de los AdEVs secretados in vitro

  1. Diferenciación de las APC en adipocitos maduros
    NOTA: Todos los cultivos se mantienen a 37 °C, 8% deCO2 , salvo que se indique lo contrario.
    1. Día 0: Cubre con gelatina al 0,2% durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT), aspira y siembra APCs recién aislados en DMEM/F12 + 15% FBS + 1% penicilina/estreptomicina (P/S) + 0,1% de primocina para alcanzar el 100% de confluencia antes de la diferenciación.
    2. Días 1-8: Sustituir por medio de diferenciación adipogénica MesenCult (50 mL totales: 45 mL de base + 5 mL de suplemento + 0,5 mL de GlutaMAX + 50 μL de Primocina), y cambiar a medio de diferenciación fresco en el día 4.
    3. Día 9: Lava los adipocitos dos veces con PBS, luego sustituye por medio maduro de cultivo de adipocitos (DMEM +1% BSA + 0,2% Primocina) y mantenlo durante 16 horas.
  2. Aislamiento y purificación de AdEV
    1. Pasar un cultivo de adipocitos de 15 mL generado arriba, primero a través de un filtro de 40 μm y luego uno de 30 μm.
    2. Centrifuga el filtrado a 500 × g durante 5 minutos, luego 2.000 × g durante 10 minutos para eliminar las células residuales y los restos.
    3. Pasa el filtrado por un filtro de 0,8 μm y luego concentra el medio de 15 mL a 0,5 mL usando una unidad de ultrafiltración de corte de 100 kDa (volumen de muestra de 15 mL) centrifugando a 4.000 × g durante 15 minutos.
    4. Carga la muestra en columnas de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) con un colector automático de fracciones y recoge fracciones F1-8.
    5. Concentrar las fracciones de EV recogidas utilizando una unidad de ultrafiltración de corte de 100 kDa (volumen de muestra de 4 mL) y proceder a la verificación del contenido de EV de cada fracción mediante western blot, instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas y microscopía electrónica de transmisión (MET).
  3. Validación, cuantificación y evaluación de tamaño/morfología de AdEV
    1. Análisis de Western blot de marcadores EV
      1. Concentra cada fracción de 400 μL a 25 μL, luego añade 50 μL de tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) suplementado con inhibidores de proteasa e fosfatasa. Desnaturalizar las muestras añadiendo un tampón cargado de 2× dodecilo sulfato de sodio (SDS) y resolver proteínas sobre un gel trisglicina al 4-12%.
    2. Análisis del tamaño, concentración y calidad de los EV utilizando un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas.
      1. Antes del análisis, diluir las muestras de EV con PBS estéril filtrado de 0,1 μm en una proporción 1:1000, asegurando que la concentración de partículas se mantenga dentro del rango óptimo de detección (aproximadamente 107-10 9 partículas/mL). Mezcla suavemente las muestras diluidas para evitar la formación de burbujas.
      2. Carga la muestra en el instrumento equipado con una cámara científica complementaria de semiconductores de óxido metálico (sCMOS) de alta sensibilidad, un módulo láser verde de 532 nm y un umbral de detección de 10 nm (hasta 1.000 nm)/ 10de 6 a10 9 partículas/mL.
      3. Realiza imágenes y cuantificación utilizando el paquete de software NS Xplorer, que aplica un algoritmo dinámico de concentración basado en volumen de observación.
    3. Examen de la morfología de los EV mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM)
      1. Enviar 50 μL de EVs, recogidos antes de la concentración, a la instalación central para la tinción negativa de los EVs. Aplicar los vehículos eléctricos a rejillas de cobre de 400 mallas solo de carbono que hayan sido limpiadas con plasma y limpiador de plasma.
      2. Tras una breve adsorción, enjuaga las rejillas con agua destilada, tiñe negativamente con acetato de uranilo al 1% (p/v) y elimina el exceso de tinte con papel filtro antes de secar al aire. Luego, se pueden fotografiar las rejillas usando un microscopio electrónico de transmisión operado a 120 KV.

3. Seguridad e información sobre residuos

  1. Manipula el paraformaldehído y el acetato de uranilo en una campana extractora con equipo de protección personal (EPP), ya que ambos son tóxicos. Recoge los residuos de acetato de uranilo en recipientes peligrosos etiquetados.
  2. Tratar todas las muestras biológicas como potencialmente infecciosas y eliminar los materiales según las políticas y protocolos de bioseguridad institucional aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC).

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Resultados

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Utilizando este protocolo de detección de ADEVs mediante captación de APC mediante microscopía confocal, aislamos APCs de los tejidos adiposos inguinales de ratones AdipCD63-GFP y Stopfl/fl/CD63-GFP y los tiñimos con DAPI para la visualización de los núcleos. Al examinarse mediante microscopía confocal, las APC de ratones Stopfl/fl/CD63-GFP no mostraron puntos detectables de GFP (Figura 1A). En cambio, las APCs aisladas de ratones AdipCD63-GFP mostraron numerosos puntos...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito cubre una importante carencia metodológica al proporcionar un sistema robusto y reproducible para aislar y caracterizar los ADEV y su adopción por los APCs. En comparación con los VE de otras fuentes, los AdEV son más ricos en lípidos y flotantes, lo que hace que las técnicas clásicas de aislamiento de VE basadas en ultracentrifugación sean menoseficientes 35. Sin embargo, la mayoría de los protocolos publicados para la purificación de ADEV a...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen ningún interés financiero que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Einstein Flow Cytometry Core por FACS y a la Analytical Imaging Facility por todo el análisis de imágenes. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones DK128839 de los Institutos Nacionales de Salud y P30CA013330 de apoyo de los centros oncológicos del NCI.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTA, pH 8,0FisherAM9260G500x dilución
10 veces PBSFisher Scientific70-013-0321000x dilución con agua
1 M HEPESGibco15630080Dilución 1000x
Kit de aislamiento de progenitores del tejido adiposo, ratónMiltenyi biotec30-106-639Listo para usar
Filtro centrífugo Amicon Ultra, MWCO de 100 kDaSigmaUFC9100Volumen de muestra de 15 mL
Filtro centrífugo Amicon Ultra, MWCO de 100 kDaSigmaUFC9100Volumen de muestra de 4 mL
BSASigmaA6003Listo para usar
Anticuerpo de calnexinaCalnexinaab22595Dilución 1000x
Anticuerpo CD63ABCAMab217345500x dilución
CD81Tecnología de señalización celular10037s500x dilución
Corning  BioCoat  Diapositiva de Cultura de Colágeno ISigmaCLS354630Listo para usar
Corning  Colador celularSigmaCLS43175040 & mu; m tamaño de poro
Corning  Colador celularSigmaCLS431752100 & mu; m tamaño de poro
Anticuerpo COX IVTecnología de señalización celular4844Dilución 1000x
DMEMGibco11965092Listo para usar
DMEM/F-12, suplemento de GlutaMAXThermofisher10565018Listo para usar
Dnase 1SigmaD4513Stock 5 KU/mL a -20 º ºC; C
Suplemento GlutaMAXGibco35050061Dilución 100x
Halt & trade; Cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas (100X)Thermofisher78444Listo para usar
Anticuerpo HSP70ABCAMab181606Dilución 1000x
Invitrogen eBioscience 10X RBC Lysis Buffer (Multi-especies)Fisher Scientific50-112-974310 veces dilución en agua
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPFisher ScientificNC2042225Listo para usar
Microscopio confocal LEICA STELLARIS 8Microscopios LeicaN/A
Grado de Investigación Liberase TMSigmaLIBTM-ROEstoque 5 mg/mL a -20 ºC; C
Filtro de jeringuilla Millex MCESigmaSLAA0250,8 & mu; m tamaño de poro
NanoSight ProMalvern PanalyticalN/A
Geles Mini de Proteína Tris-Glicina Novex, 4– 12%,ThermofisherXP04120BOXListo para usar
Buffer de muestra Novex Tris-Glycine SDS (2x)ThermofisherLC2676Listo para usar
Anticuerpo anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) azul del PacíficoBioLegend108119Dilución 25x
Solución de paraformaldehído (16%)Fisher Scientific50-980-487diluir al 4% con PBS
pluriStrainer S / 30 & micro; m (Colador celular)Fisher ScientificNC092245930 & mu; m tamaño de poro
Solución Ponceau SSigmaP7170-1LListo para usar
PrimocinInvivogenNC9141851500x dilución
Reactivo Antifade de oro ProLong con DAPITecnología de señalización celular8961SListo para usar
Anticuerpo anti-ratón purificado CD16/32BioLegend101301Dilución 100x
Buffer RIPA  Fisher ScientificPI8990010 veces dilución en agua
Citómetro de flujo espectral (Aurora 3)Cytek BiosciencesN/A
Anticuerpo Syntaxin 4Sistemas sinápticos1100425000x dilución
Tecnai 20 (Microscopio Electrónico de Transmisión)FEIN/A
Tergeo-EMPIE Scientific LLCN/A
Anticuerpo vinculinaABCAMab185085000x dilución

Referencias

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