Caracterización de la secreción de vesículas extracelulares derivadas de adipocitos utilizando un modelo ratón reportero CD63-GFP in vivo e in vitro

Resumen

El protocolo utiliza una línea de ratón reportera CD63-GFP específica para adipocitos para visualizar y cuantificar la secreción de vesículas extracelulares (EV) derivadas de adipocitos y demostrar su absorción por células progenitoras, revelando una vía paracrina dentro del tejido adiposo.

Resumen

Los adipocitos son cada vez más reconocidos como células endocrinas activas que secretan cantidades sustanciales de EVs enriquecidos en proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Sin embargo, los mecanismos que rigen la secreción de EV y la dinámica de su liberación en diferentes contextos biológicos no se comprenden completamente. Para cubrir esta brecha, generamos una nueva línea de ratones reportero CD63-GFP específica para adipocitos, en la que la expresión del CD63 etiquetado con GFP es impulsada por el promotor de adiponectina, permitiendo el marcado selectivo y el seguimiento de los AdEVs in vivo. Utilizando este modelo reportero, examinamos la secreción de ADEVs y su entrega a los APCs dentro de los tejidos adiposos. La imagen confocal y la citometría de flujo revelaron que los VA son absorbidos activamente por los APC, lo que pone de manifiesto un mecanismo previamente poco valorado de comunicación paracrina dentro del microambiente adiposo.

Para complementar los estudios in vivo , se estableció un sistema in vitro que permite el monitoreo directo de la secreción de EV a partir de adipocitos diferenciados. Los APC se aislaron de tejidos adiposos blancos subcutáneos de ratones reporteros e indujeron a diferenciarse en adipocitos maduros. En estas células, las señales CD63-GFP se observaron como puntos discretos y se enriquecieron en la membrana plasmática cuando se inhibía la secreción de EV, lo que coincidía con la acumulación de vesículas al bloquear la liberación. En condiciones normales de crecimiento, los VE secretados en el medio de cultivo se concentraron y posteriormente se purificaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño, lo que permitió análisis funcionales y bioquímicos posteriores.

Esta plataforma puede aplicarse a APCs derivados de otros depósitos adiposos, como tejido adiposo blanco y marrón epididimático, o diferenciándolos en adipocitos específicos de depósito, permitiendo así comparar la secreción de EV entre diferentes tipos de adipocitos.

En conjunto, estos enfoques introducen una herramienta genética robusta y un sistema complementario in vitro para diseccionar la dinámica de la secreción y la selección de AdEV. Estos avances arrojan luz sobre la comunicación celular intra-adiposa y sentan las bases para comprender la influencia metabólica más amplia de los ADEV en la salud y la enfermedad.

Introducción

El tejido adiposo es cada vez más reconocido como un órgano endocrino dinámico con roles clave en la homeostasis energética de todo el cuerpo 1,2,3,4,5. Más allá de su función clásica como depósito de almacenamiento de lípidos, los adipocitos regulan la sensibilidad sistémica a la insulina, y las alteraciones en la masa adiposa —ya sean excesivas o deficientes— están relacionadas con la resistencia a la insulina y enfermedades^metabólicas 6....

Protocolo

De acuerdo con las directrices de cuidado y uso animal del Albert Einstein College of Medicine, los ratones machos fueron alojados en grupo a 22 °C con una humedad relativa del 30-70% en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, se les proporcionó acceso ad libitum a comida y agua, y se mantuvieron en un fondo C57BL/6J.

1. Detección in vivo de AdEVs secretos mediante la absorción por APCs

1. Preparación del tampón
   1. Amortiguador de digestión: Prepara DMEM tamponado con HEPES añadiendo 0,5 mL de 1 M HEPES y 0,5 g de albúmina sérica bovina pobre e....

Resultados

Utilizando este protocolo de detección de ADEVs mediante captación de APC mediante microscopía confocal, aislamos APCs de los tejidos adiposos inguinales de ratones AdipCD63-GFP y Stop^fl/fl/CD63-GFP y los tiñimos con DAPI para la visualización de los núcleos. Al examinarse mediante microscopía confocal, las APC de ratones Stop^fl/fl/CD63-GFP no mostraron puntos detectables de GFP (Figura 1A). En cambio, las APCs aisladas de ratones AdipCD63-GFP mostraron numerosos puntos.......

Discusión

El protocolo descrito cubre una importante carencia metodológica al proporcionar un sistema robusto y reproducible para aislar y caracterizar los ADEV y su adopción por los APCs. En comparación con los VE de otras fuentes, los AdEV son más ricos en lípidos y flotantes, lo que hace que las técnicas clásicas de aislamiento de VE basadas en ultracentrifugación sean menos^{eficientes 35}. Sin embargo, la mayoría de los protocolos publicados para la purificación de ADEV a.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 M EDTA, pH 8,0	Fisher	AM9260G	500x dilución
10 veces PBS	Fisher Scientific	70-013-032	1000x dilución con agua
1 M HEPES	Gibco	15630080	Dilución 1000x
Kit de aislamiento de progenitores del tejido adiposo, ratón	Miltenyi biotec	30-106-639	Listo para usar
Filtro centrífugo Amicon Ultra, MWCO de 100 kDa	Sigma	UFC9100	Volumen de muestra de 15 mL
Filtro centrífugo Amicon Ultra, MWCO de 100 kDa	Sigma	UFC9100	Volumen de muestra de 4 mL
BSA	Sigma	A6003	Listo para usar
Anticuerpo de calnexina	Calnexina	ab22595	Dilución 1000x
Anticuerpo CD63	ABCAM	ab217345	500x dilución
CD81	Tecnología de señalización celular	10037s	500x dilución
Corning  BioCoat  Diapositiva de Cultura de Colágeno I	Sigma	CLS354630	Listo para usar
Corning  Colador celular	Sigma	CLS431750	40 & mu; m tamaño de poro
Corning  Colador celular	Sigma	CLS431752	100 & mu; m tamaño de poro
Anticuerpo COX IV	Tecnología de señalización celular	4844	Dilución 1000x
DMEM	Gibco	11965092	Listo para usar
DMEM/F-12, suplemento de GlutaMAX	Thermofisher	10565018	Listo para usar
Dnase 1	Sigma	D4513	Stock 5 KU/mL a -20 º ºC; C
Suplemento GlutaMAX	Gibco	35050061	Dilución 100x
Halt & trade; Cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas (100X)	Thermofisher	78444	Listo para usar
Anticuerpo HSP70	ABCAM	ab181606	Dilución 1000x
Invitrogen eBioscience 10X RBC Lysis Buffer (Multi-especies)	Fisher Scientific	50-112-9743	10 veces dilución en agua
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDP	Fisher Scientific	NC2042225	Listo para usar
Microscopio confocal LEICA STELLARIS 8	Microscopios Leica	N/A
Grado de Investigación Liberase TM	Sigma	LIBTM-RO	Estoque 5 mg/mL a -20 ºC; C
Filtro de jeringuilla Millex MCE	Sigma	SLAA025	0,8 & mu; m tamaño de poro
NanoSight Pro	Malvern Panalytical	N/A
Geles Mini de Proteína Tris-Glicina Novex, 4– 12%,	Thermofisher	XP04120BOX	Listo para usar
Buffer de muestra Novex Tris-Glycine SDS (2x)	Thermofisher	LC2676	Listo para usar
Anticuerpo anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) azul del Pacífico	BioLegend	108119	Dilución 25x
Solución de paraformaldehído (16%)	Fisher Scientific	50-980-487	diluir al 4% con PBS
pluriStrainer S / 30 & micro; m (Colador celular)	Fisher Scientific	NC0922459	30 & mu; m tamaño de poro
Solución Ponceau S	Sigma	P7170-1L	Listo para usar
Primocin	Invivogen	NC9141851	500x dilución
Reactivo Antifade de oro ProLong con DAPI	Tecnología de señalización celular	8961S	Listo para usar
Anticuerpo anti-ratón purificado CD16/32	BioLegend	101301	Dilución 100x
Buffer RIPA	Fisher Scientific	PI89900	10 veces dilución en agua
Citómetro de flujo espectral (Aurora 3)	Cytek Biosciences	N/A
Anticuerpo Syntaxin 4	Sistemas sinápticos	110042	5000x dilución
Tecnai 20 (Microscopio Electrónico de Transmisión)	FEI	N/A
Tergeo-EM	PIE Scientific LLC	N/A
Anticuerpo vinculina	ABCAM	ab18508	5000x dilución