Mapeo espacial mejorado de capas musculares gástricas de ratón utilizando una técnica modificada de Swiss Roll

Summary

Este protocolo describe un método de inmunotinción de estómago completo modificado a partir de la técnica "Swiss roll" desarrollada originalmente para el intestino murino.

Abstract

Las tecnologías de "ómica" espacial ofrecen oportunidades sin precedentes para estudiar la biología y las interacciones de las células individuales del aparato neuromuscular gástrico en su entorno tisular nativo. Sin embargo, la aplicación exitosa de estos enfoques y la evaluación de diferencias estructurales y moleculares a lo largo del fondo de ojo, corpus y antro requieren muestreo consistente y orientación tisular. Aquí informamos de una técnica modificada de "Swiss roll" adaptada al estómago del ratón, que permite incrustar y visualizar todas las regiones anatómicas principales en una sola criosección. Este enfoque enfatiza la fijación plana y la colocación cuidadosa para generar secciones con orientación y calidad reproducibles. Este estudio también optimizó las condiciones de tinción por inmunofluorescencia para asegurar una visualización de alta calidad de los marcadores celulares. Este protocolo permite comparaciones integrales y lado a lado de las regiones gástricas, minimizando la pérdida de tejido y la variabilidad experimental. Al mejorar la preservación tisular y la orientación espacial, este método ofrece una herramienta práctica y escalable para investigadores que estudian biología gástrica tanto en contextos fisiológicos como patológicos.

Introduction

El estómago es un órgano complejo en forma de J que conecta el esófago con el^{duodeno 1}. Se divide en tres regiones anatómicas principales: el fondo de suelo, el corpus y el^{antro 1}. Cada región de la túnica muscular gástrica desempeña un papel fisiológico distinto, contribuyendo a funciones gástricas clave como la acomodación, la adherencia, la trituración de alimentos y el vaciado ^1,2. Estudiar los cambios en la fisiología gástrica y la patología requiere un análisis detallado de estas regiones y su arquitectura celular.

Para visualizar grandes extensiones de tejido, los investigadores suelen adaptar la técnica del "Swiss roll", desarrollada originalmente para el intestino^murino 3,4,5,6. Este estudio modificó la técnica del Swiss Roll para su uso con el estómago murino y así establecer un nuevo protocolo. El estómago se separa primero en sus regiones anatómicas y se fija en una orientación plana. Después, el tejido se enrolla cuidadosamente y se procesa para la criosección. Un laminado inadecuado puede dañar estructuras epiteliales frágiles, especialmente en el intestino, lo que provoca una mala calidad tisular para la inmunotinción. Preservar un tejido bien fijado, correctamente orientado y con estructuras celulares intactas es esencial para la obtención de imágenes de alta resolución. Este trabajo presenta un nuevo método para generar rollos suizos que incluyen todas las regiones gástricas dentro de un único criobloque. Además, se describe un protocolo optimizado de tinción por inmunofluorescencia para la túnica muscular gástrica, que permite una evaluación detallada de la función gástrica. Este protocolo proporciona una guía completa para obtener imágenes inmunofluorescentes de alta calidad mediante una cuidadosa preparación del tejido gástrico, procesamiento de rollos suizos y tinción. Al preservar la morfología intrincada de la túnica gástrica muscular, este método facilita una comprensión más profunda de su estructura y función tanto en salud como en enfermedad.

Protocol

Los experimentos con animales se realizaron siguiendo las directrices establecidas en la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales de la Clínica Mayo (A48315-15). Los programas e instalaciones de cuidado y uso animal de la Clínica Mayo han sido revisados y completamente acreditados por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional (AAALAC). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Técnica de rollo suizo para criosecciones gástricas fijas con paraformaldehído (PFA)

1. Anestesiar a un ratón C57BL/6J (de 8-10 semanas) mediante inhalación de dióxido de carbono (CO₂) durante al menos 3 minutos, seguida de una luxación cervical para asegurar la eutanasia (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados).
2. Corta el esófago, el duodeno y la mesogastría ventral y dorsal para extraer el estómago.
3. Coloca el estómago en un recipiente recubierto de silicona que contenga solución salina fría protegida con fosfato (PBS). Fija el esófago, el fundo, el corpus y el duodeno para que sirvan como referencias de orientación (Figura 1A). La dirección de corte está indicada por una línea discontinua roja en la Figura 1A.
4. Retira cuidadosamente cualquier grasa adherida usando tijeras de varilla y pinzas.
5. Corta a lo largo del mesenterio ventral del duodeno y el estómago hasta el pin en el corpus, luego aplana suavemente el tejido (Figura 1B).
6. Utiliza una pipeta de transferencia llena de PBS para eliminar cualquier alimento residual del lumen gástrico.
7. Estira suavemente el abdomen abierto para lograr una orientación plana (Figura 1C).
   PRECAUCIÓN: Evita estirar en exceso (es decir, más del 110% de las dimensiones originales) para preservar la arquitectura del tejido.
8. Sumerge el estómago en PFA al 4% frío durante 2 minutos para fijar ligeramente el tejido y facilitar el rodamiento.
9. Vuelve a sujetar el pañuelo plano tras la breve fijación.
10. Recorta el estómago a lo largo del contorno discontinuo para crear una forma uniforme adecuada para enrollar (Figura 1C).
11. Coloque el tejido gástrico recortado sobre papel filtro humedecido con PBS (Figura 1D).
12. Enrolla el pañuelo en una configuración de rollo suizo y asegura que se inserte un palillo por el centro.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el lado mucoso esté orientado hacia arriba durante el proceso de enrollamiento. Sujeta el extremo duodenal con fórceps en una mano mientras guías el palillo con la otra, siguiendo pequeñas modificaciones en los métodos publicados.
13. Una vez enrollado, inserta una aguja de 30 G para asegurar su forma y dóblalo en un ángulo de 90° para estabilizar el estómago enrollado (Figura 1E).
14. Fija el tejido enrollado en un 4% de PFA a 4 °C durante 6 horas.
15. Transfiere el tejido fijo al 30% de sacarosa en PBS e incuba a 4 °C durante 12-16 horas para crioprotección y prevención de la formación de cristales de hielo.
16. Retira suavemente la aguja estabilizadora.
17. Incrustar el tejido en un compuesto a temperatura óptima de corte (O.C.T.) usando moldes base desechables y luego congelarlo sobre hielo seco (Figura 1F).
18. Una vez completamente congelado, guarda el moho a -80 °C.
    PRECAUCIÓN: Evita las burbujas de aire en el O.C.T., especialmente alrededor del tejido, ya que interfieren con la sección. Los bloques de tejido pueden almacenarse a -80 °C durante al menos un año.
19. Antes de seccionar, equilibra el bloque a -20 °C durante al menos 1 hora.
20. Seccionar el tejido a un grosor de 5 μm usando un criostato.
    PRECAUCIÓN: Un espesor de 5-12 μm es generalmente adecuado para las secciones gástricas^{murinas 7,8}, y puede ajustarse según las necesidades experimentales. Las secciones pueden almacenarse a -20 °C durante hasta 3 meses.

2. Tinción inmunofluorescente del tejido muscular gástrico

1. Utilizando un bolígrafo barrera hidrofóbico, dibuja una barrera repelente al agua alrededor de cada sección de tejido en el portaobjetos del microscopio.
2. Lava las secciones con PBS frío durante 5 minutos para disolver el compuesto residual de O.C.T.
3. Bloquea la unión inespecífica incubando las secciones con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente (RT; 21-23 °C).
4. Elimina el 1% de BSA usando succión y luego lava las secciones tres veces con PBS frío durante 10 minutos cada una a RT (21-23 °C).
5. Además, bloquea la unión inespecífica incubando las secciones con una solución bloqueadora de IgG ratón a ratón en PBS durante 1 hora a RT (21-23 °C), lo que reduce la unión de IgG endógeno y mejora la especificidad al usar IgG por anticuerpos de ratón.
6. Retira la solución bloqueante con succión y luego lava las secciones tres veces con PBS frío durante 10 minutos cada una a RT (21-23 °C).
7. Repite el bloqueo BSA durante 1 hora a RT (21-23 °C).
8. Incuba las secciones con anticuerpos primarios. Anoctamina-1 (ANO1), KIT, beta-tubulina clase III (TUBB3) diluida en BSA al 1% frío con 0,3% de Triton X-100. En un experimento aparte, utiliza la cadena pesada de miosina 11 (MYH11), E-cadherin y KIT. Incubar durante la noche (12-16 h) a 4 °C.
9. Elimina la solución primaria de anticuerpos mediante una succión suave. Lava las secciones con PBS frío tres veces durante 10 minutos cada una a RT (21-23 °C).
10. Incuba las secciones con anticuerpos secundarios. Alexa Fluor (AF) 488 anti-rabbit IgG, AF555 anti-ratón IgG y AF647 anti-cabra IgG (todas a 5 μg/mL; 1:400) en 1% de BSA durante 1 hora a RT (21-23 °C).
11. Retira la solución secundaria de anticuerpos mediante succión y luego lava las secciones tres veces con PBS frío durante 10 minutos cada una a RT (21-23 °C).
12. Tinte las secciones con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, a 1:300 de dilución) durante 1 hora a RT (21°-23 °C).
    PRECAUCIÓN: Los núcleos neuronales suelen mostrar señales DAPI más débiles que otros tipos de células gastrointestinales; Se recomienda una incubación mínima de 1 hora para una visualización óptima.
13. Enjuaga las secciones una vez con agua ultrapura para eliminar sales residuales.
14. Monta las correderas usando antifade mountant.
15. Sella las esquinas de la cubierta con esmalte de uñas no fluorescente. Elimina cualquier exceso de medio de montaje usando una succión suave. Luego, sella todo el perímetro de la capa de cobertura.

3. Imagen por inmunofluorescencia utilizando un microscopio confocal

1. Configurar la adquisición de pila Z multicanal en el software de imagen confocal configurando láseres y detectores para DAPI, AF488, AF555 y AF647, asegurando la separación espectral y evitando la saturación de señal.
   PRECAUCIÓN: Ajuste la potencia del láser y el tiempo de exposición individualmente para cada fluoróforo para evitar diafonías y mantener la señal dentro del rango dinámico en todos los canales (Figura 2A).
2. Establece los parámetros de exposición en el software de imagen confocal para evitar la saturación de píxeles y preservar el detalle de la señal en regiones de alta intensidad (Figura 2B).
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de que las señales en todos los canales permanezcan dentro del rango dinámico y no alcancen la saturación.
3. Para capturar todo el rollo suizo gástrico, se utiliza un ajuste de adquisición de imagen grande (por ejemplo, 6 × 6 campos) (Figura 2C); sin embargo, este ajuste debe ajustarse según el tamaño general y la tensión del tejido enrollado.
4. Adquiere imágenes 3D usando la adquisición de la serie Z en el software de imagen confocal. El flujo de trabajo detallado para la adquisición de dimensiones N (ND) se ilustra en la Figura 2D.
5. Selecciona la opción de pila Z para habilitar la imagen de la serie Z.
6. Define el rango Z colocando las posiciones focales superior e inferior abarcando todo el grosor de todo el estómago.
7. Enfoca la parte superior del abdomen y haz clic en el botón Superior para establecer el límite superior Z.
8. Ajusta el enfoque hacia la parte inferior del músculo gástrico y haz clic en el botón Inferior para establecer el límite Z inferior.
9. Establece el número de pasos del pile Z a 8 para cubrir toda la profundidad del músculo gástrico.
10. Haz clic en Ejecutar ahora para iniciar la adquisición de imágenes Z-stack.
11. Genera proyecciones de máxima intensidad para canales de fluorescencia individuales y fusionados para visualizar datos tridimensionales en una imagen bidimensional.

Results

Utilizando el nuevo método, los rollos suizos gástricos murinos incluyeron las tres regiones principales del estómago: fundo, corpus y antro, junto con una pequeña porción del esófago y el duodeno en una sola sección. Incluir todo el estómago en una sola sección permite un análisis regional exhaustivo (Figura 1). La tinción por hematoxilina y eosina (H&E) de imágenes completas de los rollos suizos del estómago demostró una arquitectura gástrica bien conservada en todas las regiones, permitiendo una visualización clara de las capas mucosa, submucosa y muscular (Figura 3). La Figura 4 muestra una tinción inmunofluorescente representativa de células intersticiales de Cajal (ICC; células marcapasos que generan ondas lentas rítmicas subyacentes a la motilidad intestinal fásica; identificadas por KIT y ANO1), neuronas entéricas (neuronas del sistema nervioso entérico que coordinan la motilidad gastrointestinal; identificadas por inmunotinción TUBB3) y núcleos (DAPI). En la mucosa gástrica, la KIT también se expresa en las células de Paneth y caliz, como se informó^{previamente 9,10,11}. ANO1 también se expresa fuertemente en el epitelio gástrico, especialmente en las células epiteliales columnares del fondo de ojos, lo que es coherente con su papel en el transporte de cloruro y la secreción^{mucosa 11}. Además, TUBB3 se expresa en ciertas células endocrinas gástricas y células secretoras de moco, según datos del Atlas de Proteínas^{Humanas 12,13}. La Figura 5 muestra una tinción inmunofluorescente representativa de células musculares lisas marcadas por MYH11, células epiteliales de la mucosa gástrica marcadas por E-cadherin y ICC marcadas por KIT. MYH11 también se expresa en miofibroblastos en la mucosa gástrica, como se informó previamente^{en 14}. En conjunto, estos resultados de inmunofluorescencia confirman que nuestro protocolo preserva la arquitectura del tejido.

Figura 1: Preparación del "Swiss roll" del estómago de ratón para criosección. (A) Todo el estómago se coloca inmediatamente después de la extracción en un plato de disección recubierto de silicona negra lleno de solución fisiológica con suero amortecido con fosfato (PBS) para preservar la integridad del tejido. (B) El estómago se abre a lo largo del punto medio del duodeno. (C) El estómago se estira suavemente y se sujeta en el plato para que quede plano sin aplicar una tensión excesiva. Una línea discontinua roja está delineada a lo largo del papel para indicar dónde debe recortarse y facilitar el enrollado. (D) El estómago abierto y fijo se coloca sobre papel filtro humedecido con PBS en preparación para enrollarlo en una configuración compacta. La flecha roja muestra la dirección en la que se mueve el estómago. (E) Las piezas de tejido se incrustan en un compuesto a temperatura óptima de corte (O.C.T.) y se congelan sobre hielo seco en preparación para la criosección. (F) Los bloques congelados se almacenan a −80 °C y se crioseccionan a 5 μm de espesor para su análisis posterior. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Configuración de adquisición de ND y visualización de saturación durante la imagen de la pila Z. (A) Ajustes del láser y del detector configurados en el software de imagen confocal para imágenes espectrales multicanal. Se utilizan cuatro fluoróforos: 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Alexa Fluor 488 (AF488), Alexa Fluor 555 (AF555) y Alexa Fluor 647 (AF647), cada uno emparejado con láseres de excitación y detectores de emisión correspondientes. El gráfico espectral muestra las curvas de excitación y emisión, permitiendo ajustar el sistema para minimizar la diafonía y optimizar la detección de señales. (B) Los ajustes de exposición se ajustan individualmente para cada fluoróforo para evitar la saturación de píxeles y preservar el detalle en regiones de alta intensidad. (C) Configuración de adquisición de imagen grande (por ejemplo, 6 × 6 campos) permite visualizar todo el rollo suizo gástrico; El tamaño del campo de imagen debe ajustarse según el tamaño y la compacidad del tejido enrollado. (D) Ventana de adquisición de ND que muestra la configuración de parámetros de la pila Z. El rango Z se define seleccionando las posiciones superior e inferior del músculo gástrico, con ocho pasos configurados para capturar la profundidad completa del tejido para el análisis tridimensional (3D). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Imagen de un rotillo suizo de estómago de ratón teñido de hematoxilina y eosina. El escaneo de mosaicos demuestra la capacidad de visualizar todo el Swiss roll gástrico de una ratona C57BL/6J hembra de 8 semanas. Se indican regiones anatómicas principales, incluyendo el esófago (línea punteada roja), esfínter esofágico inferior (línea punteada morada), fundus (línea punteada negra), cuerpo (línea punteada azul), antro (línea punteada verde) y duodeno (línea punteada naranja). Barra de escala: 1000 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Imágenes confocales de un rollo suizo de un estómago murino entero: ANO1, KIT, TUBB3. Paneles superiores: Imágenes confocales cosidas representativas de un rollo suizo gástrico de una ratón C57BL/6J hembra de 8 semanas, mostrando inmunotinción para ANO1 (verde), KIT (cian), TUBB3 (amarillo) y núcleos (azules). Se visualiza todo el estómago enrollado, incluyendo el fondo de piel, el corpus y el antrum. Barras de escala: 1000 μm. Paneles inferiores: Vistas ampliadas de la región delimitada por el cuadro blanco discontinuo en los paneles superiores, que resaltan detalles celulares de las células intersticiales de Cajal (ANO1⁺ y ^KIT+; flechas amarillas) y neuronas entéricas (TUBB3⁺; flechas rojas). Barras de escala: 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Imágenes confocales de un rollo suizo de un estómago murino entero: MYH11, KIT, E-cadherina. Paneles superiores: Imágenes confocales cosidas representativas de un rollo suizo gástrico de una ratón C57BL/6J hembra de 8 semanas, mostrando inmunotinción para MYH11 (verde), KIT (cian), E-cadherin (amarillo) y núcleos (azul). Se visualiza todo el estómago enrollado, incluyendo el fondo de piel, el corpus y el antrum. Barras de escala: 1000 μm. Paneles inferiores: Vistas ampliadas de la región delimitadas por la caja blanca discontinua en los paneles superiores. Las líneas blancas de punteos delimitan el epitelio mucoso (E-cadherina) y la capa muscular (MYH11). Las flechas blancas indican células intersticiales ^KIT+ de Cajal (ICC). Barras de escala: 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

Utilizando el nuevo método optimizado del Swiss-roll gástrico, los tres segmentos del estómago (fundo, corpus y antro), junto con el esófago y el duodeno, se incluyen en una sola lámina. Esta incrustación integral permite a los investigadores analizar cambios estructurales y moleculares en todo el estómago y reduce el coste de seccionar y teñir reactivos (Figura 1).

Exponer todas las regiones gástricas a las mismas soluciones de tinción simultáneamente durante la inmunotinción garantiza la consistencia y mejora la precisión. La inmunotinción de los rollos Swiss gástricos revela claramente las capas distintivas de la pared estomacal. Como se muestra en las Figuras 4 y 5, este método permite visualizar diferencias morfológicas entre los segmentos gástricos y permite la detección de ICC (KIT y ANO1)¹⁰, neuronas (TUBB3)¹⁵, células musculares lisas (MYH11), células epiteliales mucosas (E-cadherina) y núcleos.

Se pueden realizar modificaciones menores dependiendo de la condición del tejido y del propósito de la investigación. Por ejemplo, eliminar la grasa adherida extra puede ayudar a mantener la forma del rollo durante la fijación. Ajustar el grosor de la sección también puede ayudar a preservar la estructura tisular o mejorar la adhesión al portaobjetos. Otro posible refinamiento consiste en usar un molde metálico para un corte más consistente, como ocurre con los rollos suizos^{intestinales 16}. Aunque este protocolo se centra en criosecciones, puede adaptarse para tejidos incrustados en parafina. Mientras que la incrustación de parafina preserva la integridad estructural del tejido, la criosección permite un procesamiento más rápido y una mejor conservación de antígenos, haciéndola más adecuada para la inmunofluorescencia.

Este método tiene sus limitaciones. Un estómago agrandado, fibrótico o calcificado, comúnmente observado en afecciones como inflamación, obesidad, diabetes o envejecimiento, puede ser más difícil de enrollar y puede suponer dificultades para una tinción óptima 17,18,19,20. A pesar de esta limitación, esta técnica ofrece grandes ventajas sobre la incrustación tradicional específica de región. Procesar todas las regiones gástricas bajo condiciones idénticas mejora la consistencia, reduce la variabilidad y conserva tanto tiempo como reactivos.

Este enfoque es especialmente útil para estudios sobre cambios específicos de región. También soporta el análisis espacial de múltiples tipos de células y puede combinarse con cuantificación basada en imágenes. En conjunto, este método de Swiss-roll gástrico optimizado proporciona una plataforma práctica y escalable para un análisis integral del tejido gástrico en salud y enfermedad.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5SF Pinzas	HERRAMIENTAS CIENTÍFICAS FINAS	11252-00
albúmina sérica bovina	SIGMA-ALDRICH	A7906
Fuente de luz LED ColdVision MC-LS	SCHOTT	MC-LS
Confocal software	Nikon	Software de imagen Nikon NIS-Elements
Crioseal XYL	Epredida	9312-4
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dilactato)	Thermo Fisher Scientific	D3571
Platos de disección, grandes	Sistemas Vivos  Instrumentación	SKU: DD-90
Anti-cabra para burros AF647 pAb	Tecnologías de la vida	A21447	Lote: 1739289 RRID:AB_2535864
Anti-ratón Donkey AF555 pAb	Tecnologías de la vida	A31570	Lote: 1774719 RRID:AB_2536180
Anti-conejo Donkey AF488 pAb	Tecnologías de la vida	A21206	Lote: 2668665 RRID:AB_2535792
E-cadharina (dilución 1:400)	BD Biociencias	610181	lote: 25510 RRID:AB_397580
Eosina	ELITechGroup	$SS-071C
Pinzas recubiertas de epoxi	HERRAMIENTAS CIENTÍFICAS FINAS	11210-10
Etanol	SIGMA-ALDRICH	459828-4L
TUBO FLEXIBLE 1,5 mL	Eppendorf	22364111
Esponjas de gasa	Fisherscientific	22-362-178
Tijeras finas endurecidas	HERRAMIENTAS CIENTÍFICAS FINAS	14090-09
Hematoxilina	Epredia	7211
KIT (0.2 & micro; g/mL; dilución 1:1000)	R& Sistemas D	AF1356	Lote: IEO0217101 RRID: AB_354750
SPRAY DE SOLUCIÓN DE LENTES DE 1 OZ	Nikon	77013066
Vidrio de la cubierta del microscopio	Fisher Scientific	12541016
Portaobjetos de microscopio	CardinalHealth	M6133A
Minutien Pins	HERRAMIENTAS CIENTÍFICAS FINAS	26002-20
MYH11 (dilución 1:400)	Tecnologías Biomédicas	BT-562	RRID:AB_10013421
Esmalte de uñas	COLORES PECAMINOSOS	7.33855E+11
Aguja 30 g x 1/2 pulgada.	BD Biociencias	305106
Paraformaldehído	SIGMA-ALDRICH	158127-500G
Hojas de filo simple Personna	La Compañía de Cuchillas de Rasurar	76247-652
Solución de bloqueo IgG para ratón con ratón ReadyProbes (30x)	Thermo Fisher Scientific	R37621	Lote: 3226230
Montaje antifundido de diamante SlowFade (Soporte de montaje)	Thermo Fisher Scientific	S36972
Sistema de tinción de 10 láminas StainTray	Simport Scientific	M918-2
Microscopio estereoscópico 0,8x-5x	Nikon	SMZ645
Sucrose	SIGMA-ALDRICH	S9378-1KG
Superficie-Amps X-100 (Triton X)	Thermo Fisher Scientific	28314
TMEM16A (ANO1: dilución 1:400)	Abcam	ab53212	Parcela: GP3295656-1 RRID: AB_883075
Pipeta de transferencia	Halcón	357575
TUBB3 (dilución 1:400)	Tecnología de señalización celular	4466	Parcela: 5 RRID: AB_1904176
Xilenos	Fisher Scientific	X3P-1GAL	MUCHO 206238