Artículo de método

El ensayo de hemostasis de Nimega: medición simultánea fluorogénica de la generación de trombina y plasmina en un solo pozo

DOI:

10.3791/69701

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27 de febrero de 2026

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1Department of Hematology, Radboud university medical center, 2Hemophilia Treatment Center Nijmegen-Eindhoven-Maastricht, 3Enzyre BV, Noviotech Campus, 4Department of Laboratory Medicine, Radboudumc Laboratory of Diagnostics, Radboud university medical center, 5Department of Laboratory Medicine, Laboratory of Hematology, Radboud university medical center

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe el Ensayo de Hemostasis de Nimega, que permite la medición simultánea y temporal de la generación de trombina y plasmina para proporcionar una evaluación integrada de la coagulación y la fibrinólisis. El ensayo tiene como objetivo mejorar la caracterización del equilibrio hemostático en entornos de investigación y clínicos más allá del alcance de las pruebas hemostáticas convencionales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La trombina y la plasmina desempeñan un papel central en la hemostasia, regulando la coagulación y la fibrinólisis, respectivamente. Los ensayos hemostáticos convencionales suelen centrarse en componentes aislados o fases limitadas de hemostasia; Por ejemplo, el tiempo de tromboplastina parcial activada y el tiempo de protrombina evalúan solo el inicio de la formación de fibrina, mientras que los ensayos de actividad factorial evalúan la función de los factores de coagulación individuales. Aunque valiosos, estos ensayos carecen de una visión completa del proceso general de hemostásis secundaria y fibrinólisis, que se desarrolla dinámicamente a lo largo del tiempo. El ensayo de hemostasis de Nimega (NHA) aborda esta limitación permitiendo la medición simultánea y resuelta en el tiempo de la generación de trombina y plasmina en un solo pozo de microplaca. Utilizando dos sustratos sintéticos fluorogénicos con espectros distintos de excitación y emisión y sin reactividad cruzada, el ensayo permite cuantificar con precisión ambas enzimas en paralelo. La hemostasia se inicia en plasmas pobres en plaquetas utilizando factor tisular, calcio y activador de plasminógeno tisular, y la fluorescencia se registra cada 30 s durante 70 minutos a 37 °C. Se generan curvas de actividad enzimática utilizando estándares de calibración, a partir de los cuales se derivan parámetros como el tiempo de retraso, el potencial de trombina, el tiempo de lisis de fibrina y la altura del pico de plasmina. El ensayo captura de forma fiable la generación simultánea de trombina y plasmina con buena precisión intra e interensayos, y detecta la modulación de la coagulación y fibrinólisis por efectores como la heparina, la proteína C activada y el ácido épsilón-aminocaproico. En muestras clínicas, se observó una reducción significativa en la generación de trombina en pacientes con deficiencias en factores de coagulación, mientras que los pacientes con trastornos fibrinolíticos mostraron perfiles elevados de generación de plasmina. Al combinar mediciones de generación de trombina y plasmina, el NHA proporciona una visión completa del equilibrio hemostático más allá de los ensayos convencionales. Este enfoque integrado es prometedor para aplicaciones de investigación y clínicas, como la caracterización de fenotipos hemostáticos, la evaluación del riesgo de hemorragia y trombótica, y el seguimiento de intervenciones terapéuticas específicas. Este protocolo describe el procedimiento NHA que tiene como objetivo mejorar la comprensión y evaluación del equilibrio hemostático.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La hemostasia es el resultado de un equilibrio dinámico entre la coagulación y la fibrinólisis. La trombina y la plasmina son las enzimas clave que impulsan estos procesos: la trombina convierte el fibrinógeno en fibrina, mientras que la plasmina degrada la fibrina para disolver coágulos. La alteración de este equilibrio puede provocar hemorragias o eventostrombóticos 1,2. Sin embargo, las pruebas de laboratorio utilizadas para evaluar la hemostasia en la práctica clínica suelen centrarse en etapas aisladas de coagulación o fibrinólisis, proporcionando una visión limitada del equilibrio hemostático general. En pacientes con sospecha de tendencia a sangrado, se utilizan habitualmente pruebas de cribado rutinarias como el tiempo de protrombina (PT) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) para detectar deficiencias en factores de coagulación. Sin embargo, estos ensayos miden el tiempo hasta la formación inicial de la fibrina y no capturan la generación de trombina más allá del inicio de la coagulación, donde ocurre la mayor actividad de trombina relevante fisiológicamente 1,2,3. En consecuencia, pueden dar resultados normales en pacientes con deficiencias leves de factores decoagulación 3,4,5,6,7,8. Para identificar estas deficiencias específicas, se utilizan ensayos de actividad de factores de coagulación. Aunque son informativos para el diagnóstico, estos ensayos evalúan las proteínas individuales de forma aislada y no reflejan el equilibrio hemostático global. Como resultado, en pacientes con deficiencias leves, los niveles de factores suelen correlacionarse mal con el fenotipo dehemorragia 9,10. Esto complica la evaluación clínica del riesgo y la optimización del manejo del paciente, incluyendo el momento y la dosificación de la terapia, así como las intervenciones en respuesta a eventos trombóticos o hemorrágicos graves. Estas limitaciones ponen de manifiesto la necesidad de ensayos que ofrezcan una visión más completa del proceso hemostático a lo largo del tiempo y que puedan ayudar a cerrar la brecha entre los resultados de laboratorio y la presentación clínica.

El Ensayo de Hemostasis de Nimega (NHA) se desarrolló para abordar estas limitaciones permitiendo la medición simultánea y temporal de la generación de trombina y plasmina en plasmaspobres en plaquetas 8,9. Utiliza dos sustratos fluorogénicos sintéticos con espectros distintos de excitación y emisión para cuantificar ambas enzimas en el mismo pozo de microplacas sin reactividad cruzada. Las curvas de generación enzimática permiten derivar parámetros cuantitativos que reflejan la dinámica de la coagulación secundaria y la fibrinólisis, incluyendo el tiempo de retraso, la altura del pico de la trombina, el tiempo de lisis de la fibrina y la altura del pico de plasmina. El NHA ofrece varias ventajas sobre los ensayos existentes de generación de trombina, como el Calibrated Automated Thrombogram (CAT), Ceveron s100 y ST Genesia, que proporcionan información valiosa sobre la dinámica de la trombina pero no evalúan la actividad fibrinolítica 10,11,12,13. Los ensayos de lisis de coágulos, a su vez, capturan aspectos de la fibrinólisis, pero carecen de información sobre la generación14 de la trombina. Esto limita su utilidad para evaluar las complejas interacciones que determinan el equilibrio hemostático global. Aunque algunos enfoques desarrollados en laboratorio combinan mediciones de generación de trombina y plasmina, estos suelen requerir pozos separados o ensayos paralelos, limitando la alineación temporal y el rendimientode 15. Ensayos globales como la tromboelastografía (TEG) y la tromboelastometría rotacional (ROTEM) proporcionan información complementaria al capturar la hemostasia primaria, la coagulación secundaria y la fibrinólisis16,17. Los sistemas de cámara de flujo representan otro enfoque emergente pero experimental para evaluar la hemostasia total bajo condicionesde flujo 18. Aunque estos ensayos globales ofrecen un contexto fisiológico más amplio, generalmente son menos sensibles a trastornos hemorrágicosleves 19,20,21. Al medir simultáneamente la generación de trombina y plasmina en el mismo pozo de reacción, el NHA combina la sensibilidad de los TGA convencionales con la visión integrada de ensayos globales, permitiendo una evaluación directa de la hemostasia secundaria, fibrinólisis y sus interacciones.

Los ensayos de generación de trombinas ya han mostrado un potencial considerable para aplicaciones traslacionales, como el perfil individualizado de riesgo de sangrado y trombótico yel seguimiento terapéutico 22,23,24,25. En la investigación clínica, la NHA ha demostrado una reducción en la generación de trombinas en pacientes con hemofilia A, hemofilia B y deficiencias raras de factores de coagulación, así como una generación elevada de plasmina en condiciones hiperfibrinolíticas como la deficiencia de α2-antiplasmina 26,27,28,29. También se han observado diferencias en ambas vías en pacientes con hipofibrinogenemia, un trastorno asociado tanto con sangrado como con un mayor riesgo de trombosis. En esta población, niveles más bajos de fibrinógeno se correlacionaron con una generación reducida de plasmina, probablemente debido a la falta de sitios de unión al plasminógeno, mientras que los pacientes con antecedentes de trombosis mostraron un aumento en la generación30 de trombina. Además, el ensayo detecta los efectos de agentes terapéuticos, incluyendo anticoagulantes, procoagulantes y antifibrinolíticos8. En un estudio anterior, propusimos un enfoque de estandarización y normalización para mejorar la reproducibilidad y permitir la comparación de resultados entre ejecuciones y laboratorios, un paso esencial hacia la implementación clínica28. Este protocolo describe el procedimiento completo y el enfoque analítico del NHA para su implementación en investigación clínica o entornos traslacional.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos que involucraron muestras de plasma humano se realizaron conforme a las directrices institucionales y fueron aprobados por el comité de ética médica de Arnhem-Nimega. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes antes de la recogida de la muestra.

1. Preparación de tampones, reactivos y muestras de plasma

  1. Preparar soluciones de tampón
    1. Pesa 1,2 g de Tris (p.a.) y disuelve en 180 mL de NaCl al 0,9%.
    2. Ajusta el pH a 7,4 usando HCl.
    3. Lleva el volumen final a 200 mL con 0,9% de NaCl para obtener 50 mM de Trís-150 mM de NaCl (TBS).
    4. Alicuota el TBS en dos tubos de 50 mL.
    5. Utiliza los 100 mL cucharadas restantes para preparar el tampón que contiene calcio. Disolver 7,34 g de CaCl 2,2H 2O en 100 mL de cucharadas para obtener el tampón Tris-NaCl-CaCl2 (TBS-Ca, pH 7,4).
    6. Alicuota el TBS-Ca en dos tubos de 50 mL.
    7. Almacena ambos buffers a 4 °C y úsalo en un plazo de una semana.
  2. Preparar sustratos fluorogénicos
    1. Disolver 53,2 mg del sustrato de trombina (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) en 4 mL de tampón Tris-NaCl.
      NOTA: La caja contiene un folleto con un certificado de análisis. El volumen de tampón a añadir depende de la concentración especificada y debe ajustarse para que 1 μL de trombina humana añadida en un reactivo de 120 μL dé una concentración final de 76 nmol/L.
    2. Alicuota de 100 μL en tubos Eppendorf y se almacena a −80 °C.
    3. Descongelar una alicuota de substrato fluorogénico específico para trombina durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. Vórtice y mantente en hielo durante el experimento.
    4. Disolver el contenido de un vial de sustrato de plasmina (CBZ-L-Phe-Arg-rodamina) en 1.955 μL de DMSO.
      NOTA: La caja contiene un folleto con un certificado de análisis. El volumen de tampón a añadir depende de la concentración especificada y debe ajustarse para que 1 μL de plasmina humana añadida en un reactivo de 120 μL dé una concentración final de 200 nmol/L.
    5. Alícuota 60 μL en tubos Eppendorf y almacenada a −80 °C.
    6. Descongela una alicuota de sustrato fluorogénico específico para plasminas durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. Vórtice y mantenlo a temperatura ambiente durante el experimento.
      NOTA: Este sustrato está disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) y no debe enfriarse para evitar la precipitación.
  3. Prepara los reactivos de disparo
    1. Reconstituye la cefalina liofilizada añadiendo 1 mL de agua destilada. Vórtice completamente hasta que se disuelva completamente.
      NOTA: La cefalina se reconstituye para proporcionar fosfolípidos, esenciales para catalizar múltiples reacciones de coagulación que permiten una coagulación fisiológicamente relevante en el ensayo.
    2. Alicuota 60 μL en tubos Eppendorf (suficiente para 20 pozos) y almacenado a −20 °C.
    3. Descongela una aliquota antes de usarla y guárdala en hielo. Vórtice brevemente antes de pipetear.
    4. Reconstituir el contenido de un vial de factor tisular humano recombinante (TF) en 4 mL de agua destilada.
    5. Alícuota 60 μL en tubos Eppendorf y almacenada a −80 °C.
    6. Descongelar brevemente una alicuota de TF y vórtice.
    7. Prepara una dilución 1:500 de TF por dilución secuencial:
      1. Añadir 6 μL de TF a 54 μL de búfer TBS. Vórtice.
      2. Toma 6 μL de esta dilución y añade 54 μL de cucharadas. Vórtice.
      3. Toma 20 μL de esta segunda dilución y añade a 80 μL de cucharadas para alcanzar una concentración final de 0,28 pM. Vórtice.
    8. Reconstituir el contenido de un vial (20 mg) de activador de plasminógeno tipo tisular (tPA) en 20 mL de agua destilada para obtener una concentración final de 580.000 UI/mL (verificar concentración específica por lote).
    9. Alicuota 50 μL en tubos Eppendorf y almacenada a −80 °C.
    10. Descongelar brevemente un alicuota de tPA y vórtice.
    11. Prepara una dilución 1:50 de tPA añadiendo 20 μL de tPA a 980 μL de tampón Tris-NaCl, alcanzando una concentración final de 11.600 IU/mL. Vórtice.
  4. Preparar muestras de plasma
    1. Recoger sangre venosa en tubos de citrato de 3 mL que contienen un 3,2% de citrato, asegurando que se recojan al menos 2,7 mL (90% de llenado).
    2. No uses el primer tubo después de la venopunción; Deséchalo para evitar la activación por factor tisular.
    3. Invierte el tubo al menos 10 veces inmediatamente después de la recogida.
    4. Centrifugar en menos de 2 h a temperatura ambiente, primero a 2.500 × g durante 5 minutos, seguido de 10.000 × g durante 10 minutos.
    5. Utiliza una pipeta desechable para recoger el plasma justo encima de la capa celular.
    6. plasma alicuota en crioviales marcados, se congela rápidamente en nitrógeno líquido y se almacena a −80 °C.
      NOTA: Asegúrese de que la muestra esté libre de coágulos. Usa solo plasma fresco o descongelado una vez. Un tubo CTAD es suficiente para el análisis duplicado.

2. Preparación de instrumentos y configuración de software

  1. Prepara el lector de placas de fluorescencia
    1. Enciende el lector de placas y deja que se equilibre a 37 °C.
    2. Establece los siguientes parámetros básicos:
      1. Greiner 96-pozo, fondo plano, negro.
      2. Ajustes generales: Retardo de posicionamiento: 0,1 s; Número de ventanas cinéticas: 1.
      3. Ventana cinética: Número de ciclos: 140; Tiempo de inicio de la medición: 0,0 s; Número de flashes por pozo y ciclo: 10; Tiempo de ciclo: 30 s.
      4. Óptica: Óptica superior
      5. Configuración del filtro: Número de monocromáticos: 2. Filtro de excitación: 355 nm para trombina; 485 nm para plasmina. Filtro de emisión: 460 nm para trombina, 520 nm para plasmina. Ganancia: 600.
    3. Define la disposición con un máximo de 20 pozos por placa.
    4. Navega a Concentraciones/Volúmenes/Agitación y confirma los siguientes ajustes. Bomba 1 = 20 μL; Bomba 2 = 0 μL; Velocidad = 420 μL/s.
  2. Prepara el sistema de inyección
    1. Retira y enjuaga las agujas de inyección en un recipiente con amortiguador.
    2. Ajusta el volumen de enjuague a 2.500 μL y enjuaga las bombas con un buffer Tris/NaCl de 37 °C.
    3. Reajusta el volumen del enjuague a 500 μL.

3. Montaje del ensayo en formato microplaca

  1. Montaje de vibradores de microplacas
    1. Ajusta el agitador de microplacas a 37 °C y verifica la temperatura antes de usarla.
    2. Ajusta la intensidad del temblor a 1100 rpm.
    3. Utiliza este agitador en todos los pasos de mezcla del ensayo para asegurar una distribución homogénea de los reactivos y una actividad enzimática constante.
  2. Añadir reactivos a los pozos
    1. Descongelar plasma del paciente y plasma acumulado normal (NPP) en un baño maria a 37 °C durante hasta 10 minutos.
    2. Mezcla bien y verifica que el descongelamiento sea completo (sin crioprecipitado).
    3. Añadir 80 μL de plasma del paciente o NPP a los pozos preseleccionados. Usa una punta de pipeta nueva para cada muestra.
      NOTA: Incluir una muestra de NPP en cada ejecución de ensayo para tener en cuenta la variabilidad entre etapas (véase más adelante en el paso 5.6).
    4. Añade 2 μL de cefalina.
    5. Añade 2 μL de factor tisular (dilución 1:500). Mezcla brevemente con un agitador de platos.
    6. Añade 10 μL de buffer Tris-NaCl. Mezcla brevemente con un agitador de platos.
    7. Añade 4 μL de sustrato de trombina.
    8. Añade 2 μL de sustrato de plasmina. Mezcla brevemente con un agitador de platos.
  3. Pre-incubación
    1. Inserta la microplaca en el lector de placas.
    2. Deja que la placa se equilibre a 37 °C durante varios minutos.

4. Preparación e inyección del reactivo inicial

  1. Prepara el reactivo para la Bomba 1
    1. Combina 672 μL de tampón Tris/NaCl, 192 μL de tampón Tris/NaCl/CaCl₂ y 96 μL de tPA (del paso 1.2.5). Vórtice a fondo.
    2. Perfora dos agujeros en la tapa del tubo de reactivo.
    3. Introduce el tubo de la bomba por un orificio hasta el fondo del tubo.
  2. Preparar y comenzar el ensayo
    1. Usa el software para cebar la bomba con 500 μL del reactivo.
    2. Reinserta las agujas de inyección en sus posiciones designadas.
    3. Empieza inmediatamente la medición de fluorescencia.
  3. Inicio manual del ensayo
    NOTA: Este procedimiento de inicio manual ofrece una alternativa al flujo de trabajo de inyección automatizado descrito en los pasos 2.2, 4.1 y 4.2.
    1. Prepara el reactivo inicial tal y como se describe en 4.1.1 justo antes de usarlo.
    2. Retira la microplaca del lector de placas y añade rápidamente 20 μL del reactivo de arranque manualmente a cada pozo usando una pipeta calibrada o multicanal para un manejo más rápido.
    3. Devuelve inmediatamente la placa al lector y comienza la medición de fluorescencia sin demora.
      NOTA: Minimizar el tiempo entre la adición del reactivo y el inicio de la medición (<10 s por hilera) para reducir la variabilidad.
  4. Lectura cinética
    1. Registra la fluorescencia cada 30 segundos durante 70 minutos.
    2. Mantén la placa a 37 °C durante la medición.

5. Análisis de datos

  1. Prepara los datos para el análisis
    1. Exporta los datos de fluorescencia cinética desde el lector de placas como una tabla con puntos de tiempo y valores de fluorescencia por pozo.
    2. Convierte los datos de fluorescencia en bruto en curvas de generación de enzimas calculando la primera derivada usando Excel u otro programa.
    3. Grafica las curvas de generación enzimática para cada pozo para visualizar la reacción enzimática.
      NOTA: Estas curvas representan la tasa de generación de trombina o plasmina a lo largo del tiempo y corresponden a la salida gráfica mostrada en las figuras.
  2. Analizar las curvas de generación de trombinas
    1. Identifica los siguientes parámetros de la curva de generación de trombinas (véase la Figura 1):
      1. Tiempo de retraso: El punto temporal en el que la curva de generación de trombina aumenta de forma constante y alcanza el 8% de la altura máxima de la trombina.
      2. Altura máxima de la trombina: El valor máximo de señal en el eje y (es decir, la tasa máxima de generación de trombina).
      3. Momento pico de la trombona: El tiempo desde el inicio del ensayo hasta la altura máxima de la trombina.
      4. Potencial de trombina (área bajo la curva de generación de trombina): El área bajo la curva desde el retraso hasta que la señal de trombina regresa a la línea base.
        NOTA: El potencial de trombina refleja la capacidad total generadora de trombina de la muestra bajo condiciones de ensayo.
  3. Analizar las curvas de generación de plasminas
    1. Identificar los siguientes parámetros a partir de la curva de generación de plasminas (véase la Figura 2):
      1. Tiempo de lisis de la fibrina: El tiempo desde el inicio de la generación de plasmina (es decir, el momento en que la curva de generación de plasmina aumenta de forma constante y alcanza el 8% de la altura máxima de la plasmina) hasta el momento en que se alcanza el pico de plasmina.
      2. Altura máxima de la plasmina: El primer máximo distinto en la curva, correspondiente al estallido inicial en la generación de plasmina, se determina en el punto donde la segunda derivada de la curva de generación de plasmina (basada en una media móvil de tres minutos) alcanza cero tras el inicio de la generación de plasmina.
      3. Potencial de plasmina (área bajo la curva de generación de plasmina): El área bajo la curva desde el inicio de la generación de plasmina hasta el momento del pico de plasmina.
        NOTA: Las fluctuaciones de señal sí ocurren después del pico inicial de plasmina y no se incluyen en el análisis de los parámetros de generación de plasmina.
  4. Extraer parámetros manualmente o usando software personalizado
    1. Utiliza Microsoft Excel, GraphPad Prism o un script personalizado (por ejemplo, en Python o R) para extraer parámetros cinéticos.
    2. Guarda los datos en bruto, las curvas trazadas y los parámetros calculados en un formato estructurado para archivar y consultar en el futuro.
      NOTA: Si usas macros, verifica la corrección de todos los parámetros visual y manualmente antes de confiar en la salida automatizada. Nuestro macro para conversión de datos está disponible bajo solicitud.
  5. Estandarización y normalización
    1. Establecer una referencia fisiológica midiendo 40 muestras individuales de donantes sanos en paralelo con la muestra de NPP utilizada para la normalización. Realiza este paso una vez por lote de NPP.
    2. Calcular los valores medios de los parámetros de generación de trombina y plasmina de los donantes sanos, y determinar su relación con los valores correspondientes de NPP obtenidos en la misma ejecución.
    3. Para cada muestra de paciente en una determinada ejecución, primero se normaliza el parámetro de generación de trombina o plasmina al valor de NPP medido en esa misma ejecución.
    4. Divide este resultado por la proporción saludable de donantes respecto a la NPP establecida previamente para el mismo lote de NPP (véase el paso 5.6.2). Esto da lugar a un valor relativo normalizado al individuo medio sano, con estandarización para variaciones entre recorridos usando NPP.
    5. Expresa los valores de los parámetros como porcentajes en relación con el valor medio de individuos sanos (definido como 100%). Presenta los resultados de muestras de pacientes en consecuencia.
      NOTA: Los valores relativos de los parámetros para cada muestra individual de paciente se calculan utilizando la siguiente fórmula, donde la ejecución a se refiere a la ejecución de la muestra del paciente, y la ejecución b se refiere a la ejecución de referencia en la que se midieron muestras de donantes sanos en paralelo con el mismo lote de NPP. Nuestro archivo de Excel que contiene los cálculos para la normalización de datos está disponible bajo solicitud.
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6. Generación de curvas de calibración

  1. Prepara la curva de calibración de la trombina
    1. Reconstituye la α-trombina humana liofilizada según las instrucciones indicadas en la hoja técnica del fabricante.
      NOTA: Por ejemplo, si la hoja técnica especifica la reconstitución en 100 μL de agua para obtener 3,34 mg/mL, esto corresponde a 0,334 mg en 100 μL.
    2. Diluye la trombina reconstituida 1:10 en el tampón Tris/NaCl.
      NOTA: Esto da como resultado una concentración de stock de aproximadamente 9,1 nmol/mL (0,0091 nmol/μL), basada en un peso molecular de 36.700 g/mol.
    3. Preparar una serie de dilución en el tampón Tris/NaCl para lograr concentraciones finales de trombina en el ensayo que oscilen entre 0 y 152 nmol/L.
    4. Pipetear trombina en pozos seleccionados que ya contienen tampón para alcanzar un volumen total de 100 μL por pozo.
    5. Prepara la solución de sustrato para la Bomba 1 mezclando 300 μL de tampón Tris/NaCl con 200 μL de sustrato de trombina del paso 1.2.2.
    6. Diluye aún más esta solución combinando 400 μL de la mezcla con 360 μL de tampón Tris/NaCl.
    7. Añade 20 μL de esta mezcla de sustrato a cada pozo de calibración, elevando el volumen total del ensayo a 120 μL.
    8. Mezcla suavemente la placa e insértala en el lector de placas. Ejecuta el ensayo cinético durante 25 ciclos, usando los mismos ajustes de fluorescencia descritos en la sección 2.
    9. Exporta los datos brutos de fluorescencia y determina la pendiente inicial (tasa de aumento de fluorescencia por ciclo) para cada concentración de trombina usando GraphPad Prism o software equivalente.
    10. Genera una curva estándar graficando la pendiente inicial frente a la concentración de trombina.
      NOTA: Asegúrese de que todos los buffers estén precalentados a 37 °C y manipule enzimas sobre hielo. Prepara siempre diluciones frescas y mezcla bien. La curva estándar resultante se utiliza para calcular la actividad relativa de la trombina en muestras desconocidas utilizando el macro descrito en la sección 5.
  2. Preparación de la curva de calibración de plasminas
    1. Reconstituir la plasmina liofilizada en agua destilada (por ejemplo, 0,543 mL) según las instrucciones del fabricante.
      NOTA: La plasmina tiene un peso molecular de 75.400 g/mol. La concentración resultante en stock es aproximadamente 24,3 nmol/mL (0,024 nmol/μL), asumiendo 1 mg en 0,543 mL.
    2. Prepara una serie de dilución en tampón Tris/NaCl para alcanzar concentraciones finales de plasmina en el ensayo que oscilan entre 66 y 532 nmol/L.
    3. Pipeta plasmina en pozos que contienen tampón Tris/NaCl para alcanzar un volumen final de 100 μL por pozo.
    4. Prepara la solución de sustrato para la Bomba 1 mezclando 680 μL de tampón Tris/NaCl con 80 μL de sustrato de plasmina/rodamina (prediluido 1:1 si es necesario) del paso 1.2.5.
    5. Añadir 20 μL de esta solución sustrato a cada pozo de calibración, llevando el volumen total a 120 μL.
    6. Mezcla suavemente la placa e insértala en el lector de placas. Ejecuta el ensayo cinético durante 25 ciclos usando los mismos ajustes de fluorescencia que se describen en la Sección 2.
    7. Exporta los datos brutos de fluorescencia y determina la pendiente inicial del aumento de fluorescencia para cada concentración de plasmina aplicando regresión lineal a la fase lineal de la curva cinética usando GraphPad Prism o software equivalente.
    8. Genera una curva estándar representando la pendiente inicial frente a la concentración de plasmina.
      NOTA: Debido a la variación de la actividad de plasminas de un lote a otro, la calibración debe repetirse con cada nuevo lote. Si se observa una actividad inesperadamente alta, se recomienda una dilución 1:2 del material antes de preparar la serie de calibración.
  3. Utiliza la curva de calibración para la cuantificación
    1. Utiliza las curvas de calibración generadas en la Sección 6 para convertir los valores de la pendiente de fluorescencia en actividad enzimática relativa.
    2. Utiliza solo la parte lineal de la curva de calibración para interpolar muestras desconocidas.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las curvas representativas de generación de trombina y plasmina obtenidas con el ensayo de hemostasis de Nimega (NHA) se muestran en la Figura 3. La intensidad de la señal de cada curva se expresa como porcentaje respecto a la muestra de plasma normal agrupado (NPP) medida simultáneamente. Una muestra con NPP se incluye en cada ejecución como control interno para verificar la validez del ensayo y asegurar la comparabilidad entre ejecuciones.

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El ensayo de hemostasis de Nimega (NHA) es un ensayo fluorogénico de doble enzima que permite la medición simultánea y temporal de la generación de trombina y plasmina en plasmas pobres en plaquetas. Al capturar ambos procesos en un solo pozo, el método facilita el análisis cinético de alta resolución de hemostasis secundaria y fibrinólisis. Esta doble lectura ofrece ventajas metodológicas claras sobre los ensayos convencionales y se ha aplicado con éxito en el estudio de deficiencias de...

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Divulgaciones

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W.L. van Heerde es fundador y empleado de Enzyre BV y copropietario de Van Heerde Holding BV, que es accionista de Enzyre. Enzyre ha recibido financiación para investigación por contrato de Takeda y Novo Nordisk. W.L. van Heerde también ha recibido apoyo de subvenciones de viaje de SOBI y CAF-DCF. Los autores restantes declaran no tener intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los objetivos de EuroBloodNet.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales
Cloruro de calcio (CaCl2.2H2O)Merck1.02382
Cefalina (kit de reactivos C.K. Prest 5 APTT)Stago00847Estable durante 6 meses a -20 °C. 
Agua destiladaAnota la fecha de apertura. Úsalo dentro del día siguiente a la primera apertura.
Dimetilsulfóxido (DMSO)Merck1.02950.0500
Alfa-trombina humanaLaboratorios de Investigación de EnzimasHT 1002aLa caja contiene un folleto con un certificado de análisis. El volumen de buffer a añadir depende de la concentración especificada y debe ajustarse para que 1 y micro; L de trombona humana añadida en 120 & micro; El reactivo L produce una concentración final de 76 nmol/L.
Plasmina humanaLaboratorios de Investigación de EnzimasHPlasLa caja contiene un folleto con un certificado de análisis. El volumen de buffer a añadir depende de la concentración especificada y debe ajustarse para que 1 y micro; L de plasmina humana añadida en 120 y micro; El reactivo L da lugar a una concentración final de 200 nmol/L.
Plasma normal agrupadoPreparación internaNo aplicableEstable durante 3 horas tras descongelarlo si se mantiene en hielo.
Plasma del pacienteNo aplicableNo aplicable
Sustrato de plasmina (CBZ-L-fenilalano-L-amida de arginina)-rodamina-morfolino ureaSymeresEstable durante 6 meses a -80 °C. 
Factor tisular humano recombinante (TF): InnovinDade BehringB4212Estable durante 6 meses a -80 °C. 
Activador de plasminógeno tipo tejido recombinante (tPA): Alteplasa/ActilisaBoehringer IngelheimEstable durante 12 meses a -80 °C. 
Tris(hidroximetil)aminometano (H2NC(CH2OH)3)Merck1.08382.2500
Tampón Tris-NaCl, pH 7,4 (TBS)Preparación internaNo aplicable
Tampón Tris-NaCl-CaCl2, pH 7,4 (TBS-Ca)Preparación internaNo aplicable
Sustrato de trombina Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-metilcumarinaSymeresEstable durante 6 meses a -80 °C. 
Equipo
Fluorímetro / lector de microplacas Fluostar Optima con control de temperatura e inyectores de reactivosBMG Labtech
Placa microtitulada de 96 pozos, poliestireno, fondo plano, negro, superficie de unión media (equivalente a Microlon)Greiner BIO-ONE655076
Balance analítico (balance de carga superior)
Puntas de pipeta azules (para 100-1000 y micro; L)
Tubos de extracción de sangre de citrato 3mL (3,2% citrato)BD Vacutainer
Cubo de hielo
Máquina de hielo
Incubadora / agitador de microplacas
Agitador magnético
Rack de tubos para microcentrífugas
Tubos microcentrífuga, cerrables
Medidor de pH
Puntas de la pipeta 0,1-10 y micro; L, no estéril
Pipetas (2, 10, 20, 100 y 1000 y micro; L)
Destornillador (usado como sonda)
Mezclador de tubos
Baños María
Puntas de pipeta amarillas (para 20-200 y micro; L)

Referencias

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