Utilizando aprendizaje automático integrado entre múltiples cohortes, construimos una firma pronóstica IMRG robusta para el glioma. El IRAIN está marcadamente regulado a la baja, inversamente vinculado al grado y la supervivencia, y suprime la señalización de IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5, restringiendo la proliferación, migración y angiogénesis. Los hallazgos indican IRAIN e IMRG como biomarcadores y objetivos terapéuticos.
Artículo de investigación
El IRAIN de ARN largo no codificante impulsa la reprogramación inmunometabólica en el glioma a través del eje IGF1R-JAK-STAT-BIRC5
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El glioma es una malignidad agresiva con opciones terapéuticas limitadas y un pronóstico pobre. Su progresión está estrechamente vinculada a la reprogramación metabólica y la evasión inmunitaria, lo que subraya la necesidad de identificar reguladores moleculares que integran estos procesos. Aquí, establecimos una firma pronóstica robusta de genes inmunometabólicos relacionados (IMRG) y dilucidamos el papel del ARN largo IRAIN no codificante en la regulación del inmunometabolismo del glioma a través del eje IGF1R-JAK-STAT-BIRC5. Se analizaron datos transcriptómicos y clínicos de las cohortes TCGA, CGGA (693/325) y GEO (GSE43378). La expresión diferencial y el análisis ponderado de redes de coexpresión génica (β = 8) aseguraron una topología libre de escala, y un marco de validación cruzada leave-one-out que combinaba diez algoritmos de aprendizaje automático produjo 101 modelos pronósticos. La firma óptima de 17 genes del IMRG fue validada en todas las cohortes y predijo de forma independiente la supervivencia global. Los ensayos funcionales demostraron que la sobreexpresión de IRAIN inhibía IGF1R, suprimía la fosforilación de JAK2/STAT3 y regulaba a la baja BIRC5, promoviendo así la apoptosis y reduciendo la angiogénesis. La baja expresión de IRAIN se correlacionó con Tregs inmunosupresores y macrófagos M2 y con puntuaciones elevadas en microambiente tumoral, lo que sugiere un fenotipo inmunoevasivo. Estos hallazgos establecen a IRAIN como un regulador clave de la reprogramación inmunometabólica del glioma y validan la firma IMRG como una herramienta pronóstica fiable, destacando la vía IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 como un puente mecanicista que vincula la desregulación inmune y metabólica en el glioma y ofrece posibles objetivos para la terapia de precisión.
Introducción
El glioma representa la malignidad primaria más común del sistema nervioso central y sigue siendo uno de los cánceres humanos más mortales a pesar de los avances en neurocirugía, radioterapia y quimioterapia. Los gliomas de alto grado, en particular el glioblastoma multiforme (GBM), se caracterizan por una rápida proliferación, infiltración difusa y recurrenciainevitable 1,2. Recientemente, han surgido una variedad de enfoques terapéuticos eficaces, como intervenciones quirúrgicas, inmunoterapia yquimioterapia 3. La supervivencia mediana se mantiene aproximadamente entre 14 y 18 meses, incluso con la terapia máxima, lo que subraya la necesidad de nuevas estrategias terapéuticas y biomarcadorespronósticos 4.
La interacción entre el microambiente tumoral (TME) y las células cancerosas impulsa de forma crítica el crecimiento agresivo y la heterogeneidad molecular de los gliomas. Numerosos componentes inmunitarios, incluyendo la microglía, las células precursoras neuronales, las vasculares y las células inmunitarias adaptativas, están intrincadamente implicados en la configuración de laTME 5,6,7. En los últimos años se han visto avances notables en la inmunoterapia, inaugurando una era transformadora en oncología. No obstante, el bloqueo de puntos de control inmunitario (ICB) y otros enfoques inmunoterapéuticos han mostrado solo un éxito limitado en elglioma 8. El fracaso de la inmunoterapia en este contexto se debe a varias características intrínsecas del microambiente del glioma: baja carga mutacional tumoral, pronunciada heterogeneidad intratumoral, pobre permeabilidad de la barrera hematoencefálica, regulación a la baja de moléculas principales del complejo histocompatible y escasa infiltración de células T 9,10,11,12.
Cada vez hay más evidencia que sugiere que el microambiente tumoral (TME), que presenta disfunción metabólica, se caracteriza por condiciones ácidas, privación de nutrientes y la acumulación de metabolitos que suprimen las respuestas inmunitarias. Esta condición conduce posteriormente a la disfunción de las células inmunitarias que infiltran los tumores y disminuye la eficacia de lainmunoterapia 13. Simultáneamente, las células inmunitarias dentro de la TME experimentan cambios metabólicos dependientes del contexto que dictan su diferenciación y funciones efectoras. Por ejemplo, las células T activadas dependen de la glucólisis para una rápida proliferación, mientras que las células T reguladoras (Tregs) y los macrófagos asociados a tumores (TAMs), especialmente el subtipo M2, dependen de la fosforilación oxidativa y el metabolismo de los ácidos grasos para mantener su actividadinmunosupresora 14,15.
Por lo tanto, integrar las firmas inmunitarias y metabólicas ofrece un marco racional para clasificar mejor los gliomas y predecir el pronóstico del paciente. Los ARN largos no codificantes (lncRNAs) han surgido recientemente como reguladores versátiles de la arquitectura de la cromatina, la transcripción génica y la modificación post-transcripcional. Varios ARNnc han sido implicados en la patogénesis del glioma, influyendo en la proliferación, invasión y modulación inmune16. Entre ellas, el transcrito antisentido impreso IRAIN (ARN no codificante de proteínas impreso antisentido IGF1R) ha llamado la atención por su papel en la regulación del gen receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1R) mediante interacciones con la cromatina cis-actuante, que ha demostrado estar regulado a la baja y disminuir el control de la competencia cis, especialmente en células cancerosas como el cáncer de mama y las líneas celulares de leucemia, cáncer de laringe, y leucemia mieloide aguda, que conduce directamente a la regulación al alza deIGF1R 17,18,19. Dado que la señalización IGF1R activa las vías posteriores JAK-STAT y PI3K-AKT —ambas centrales para el crecimiento tumoral y la regulacióninmunitaria 20,21— las alteraciones en la expresión de IRAIN pueden afectar críticamente al inmunometabolismo tumoral. Sin embargo, el papel de la IRAIN en el glioma y su posible impacto en el panorama inmunometabólico aún no se han esclarecido. Abordar esta brecha de conocimiento podría proporcionar una visión mecanicista de cómo los ARN no codificantes coordinan la adaptación metabólica y la evasión inmunitaria en el glioma.
En este estudio, combinamos datos transcriptómicos de múltiples cohortes con validación experimental para explorar la regulación inmunometabólica en el glioma. Utilizando marcos integrados de aprendizaje automático entre las cohortes TCGA, CGGA (693/325) y GEO (GSE43378), identificamos una firma prognóstica robusta de 17 genes inmunometabólicos relacionados (IMRG) capaz de estratificar la supervivencia del paciente entre conjuntos de datos. Posteriormente nos centramos en IRAIN como posible regulador upstream de esta red, dada su interacción prevista con el eje de señalización IGF1R-JAK-STAT. Los ensayos funcionales revelaron que la sobreexpresión de IRAIN suprime la proliferación de gliomas y la angiogénesis al inhibir la expresión de IGF1R y la fosforilación posterior de STAT3, lo que resulta en una reducción de la expresión de la proteína antiapoptótica BIRC5 (también conocida como Survivin). En conjunto, estos hallazgos apoyan un modelo de trabajo en el que IRAIN funciona como un puente mecanicista que vincula la regulación inmunitaria y la reprogramación metabólica en el glioma. Hipotetizamos que la expresión desregulada del IRAIN promueve la progresión tumoral al alterar este equilibrio, fomentando así un microambiente inmunosupresor y confiriendo resistencia a la terapia.
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran tejidos humanos cumplieron con las directrices institucionales y la Declaración de Helsinki, y fueron aprobados por el Comité de Revisión Institucional de la Universidad Médica de Fujian (Aprobación nº 2021KYB089). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la extracción de tejidos.
Análisis de expresión y supervivencia génica
Los datos de secuenciación de ARN y la correspondiente información clínica se obtuvieron de múltiples bases de datos públicas. 1) cohorte TCGA: Los datos de RNA-seq (FPKM) para 175 muestras de glioblastoma multiforme (GBM) y 534 muestras de glioma de bajo grado (LGG) se descargaron del Atlas del Genoma del Cáncer (https://portal.gdc.cancer.gov/); 2) Controles normales: Se descargaron perfiles de expresión de 211 tejidos cerebrales normales y 662 tejidos gliomas de la base de datos Xena de UCSC (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) Validación externa: Los datos de CGGA693 y CGGA325 cohortes se obtuvieron del Atlas Genoma de Glioma Chino (http://www.cgga.org.cn); 4) Conjunto de datos GEO: El conjunto de datos GSE43378, que contiene datos de expresión y clínicos de 50 muestras de glioma, fue descargado del Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Todos los datos brutos de recuento se convirtieron en transcripciones por millón (TPM) y se transformaron enlogarítmicas 2. Para conjuntos de datos ya normalizados, se examinaron matrices de expresión para asegurar distribuciones comparables. Se excluyeron genes con valores de TPM < 1 de cada más del 80% de las muestras. La información clínica faltante (edad, estado IDH, codedeleción 1p/19q, metilación MGMT) fue eliminada mediante filtrado completo de casos. Los efectos por lotes entre conjuntos de datos se ajustaron utilizando el algoritmo ComBat implementado en el paquete R sva. Los valores de expresión se estandarizaron mediante la transformación de puntuación z dentro de cada conjunto de datos. Los análisis de supervivencia se realizaron utilizando los paquetes R survival y survminer. Los pacientes fueron dicotomizados en grupos de alta y baja expresión según el nivel mediano de expresión de IRAIN. Se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y se evaluó la significación estadística mediante la prueba log-rank. Se estimaron las razones de riesgo (HR) y los intervalos de confianza (IC) del 95% utilizando modelos de regresión proporcional a riesgos proporcionales de Cox.
Definición de conjuntos génicos inmunes y metabólicos
Los genes relacionados con el sistema inmunológico (IRGs, n = 2.483) se obtuvieron de la base de datos ImmPort (https://www.immport.org/shared/), y los genes relacionados con el metabolismo (MRGs, n = 948) de la Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/). El conjunto combinado de estos genes se definió como genes relacionados con el inmunometabólico (IMRG). Estas listas de genes sirvieron como referencia para análisis posteriores de expresión diferencial y de redes.
Expresión diferencial y análisis de redes de coexpresións génicas ponderadas
Se identificaron genes diferencialmente expresados (DEGs) entre el cerebro normal y los tejidos gliomas utilizando el limma del paquete R. Los datos de expresión se ajustaron con un modelo lineal seguido de moderación empírica de Bayes. Genes con |log₂ cambio en el plegamiento| > 1,5 y la tasa de falsos descubrimientos (FDR) < 0,05 se consideraron expresados de manera significativamente diferencial. El análisis ponderado de la red de coexpresión génica (WGCNA) se realizó utilizando el paquete R WGCNA. Las muestras atípicas se excluyeron mediante agrupamiento jerárquico. La potencia de umbral suave se estableció en β = 8 para lograr un índice de ajuste topológico libre de escala (R2 ≥ 0,85) manteniendo una conectividad media adecuada. Se construyeron matrices de solapamiento topológico (TOM) y se agruparon genes en módulos con un tamaño mínimo de 50 utilizando el algoritmo de corte dinámico de árbol. Los eigengenes del módulo se correlacionaron con rasgos clínicos, y se seleccionó el módulo más fuertemente asociado con el glioma (Pearson's r > 0,7, P < 1×10-10) para la identificación del gen central.
Construcción de modelos pronósticos basados en aprendizaje automático
Se aplicó un marco integral de validación cruzada leave-one-out (LOOCV) que integra diez algoritmos de aprendizaje automático para construir y evaluar modelos pronósticos. En total, se implementaron 101 flujos de trabajo combinatorios utilizando la cohorte TCGA como conjunto de datos de entrenamiento. Los genes inmunometabólicos asociados al pronóstico (IMRG) se identificaron por primera vez mediante regresión de Cox univariante (P < 0,05). El modelo óptimo se determinó maximizando el índice de concordancia de Harrell medio (índice C) a través de tres conjuntos de datos de validación (CGGA693, CGGA325 y GSE43378). El modelo RSF-Enet resultante (α = 0,3) demostró el mayor rendimiento predictivo y mantuvo una generalizabilidad robusta entre cohortesindependientes 22.
TME e infiltración inmunitaria
Para caracterizar de forma exhaustiva el panorama inmunogenómico, empleamos un enfoque analítico de varios niveles. Primero, los niveles de infiltración inmune y estromática se cuantificaron utilizando el algoritmoESTIMATE 23. La expresión diferencial de moléculas clave de puntos de control inmunitarios, incluyendo PDCD1, CTLA4 y LAG3, se evaluó mediante análisis basado en limma, y se visualizaron las correlaciones entre los genes de puntos de control utilizando matrices de correlación. Se utilizaron perfiles de mutaciones somáticas de 903 muestras de glioma en la cohorte TCGA para calcular las puntuaciones de carga mutacional tumoral (TMB), inestabilidad de microsatélites (MSI) y disfunción y exclusión inmune tumoral (TIDE) para predecir posibles respuestas a la inmunoterapia. Posteriormente, los pacientes se estratificaron en cuatro grupos pronósticos según el estado combinado de TMB (alto/bajo) y las puntuaciones de riesgo (alto/bajo), y los resultados de supervivencia se compararon mediante análisis de Kaplan-Meier.
Análisis de enriquecimiento funcional
Se realizaron análisis de enriquecimiento de vías de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) utilizando el paquete R clusterProfiler. Se consideraron estadísticamente significativos los resultados de enriquecimiento con valores de P ajustados < 0,05. Se visualizaron procesos biológicos sobrerrepresentados, componentes celulares y funciones moleculares usando gráficos de puntos y diagramas de barras. Las redes de interacción proteína-proteína (PPI) se construyeron utilizando la base de datos STRING (≥ 0,4) y se visualizaron en Cytoscape. Los módulos funcionales dentro de la red PPI se identificaron mediante el algoritmo MCODE. Las redes de interacción y coexpresión gen-gen se analizaron más a fondo utilizando GeneMANIA (https://string-db.org; puntuación de confianza ≥ 0,4) y se visualizaron en Cytoscape. Los módulos funcionales dentro de la red PPI se identificaron mediante el algoritmo MCODE. Las redes de interacción y coexpresión gen-gen se analizaron más a fondo utilizando GeneMANIA (https://genemania.org), que integra información sobre interacciones físicas y genéticas, vías compartidas y patrones de coexpresión para inferir posibles asociaciones funcionales.
Especímenes clínicos
Se recogieron tejidos gliomas frescos (n = 6) y tejidos cerebrales no tumorales adyacentes (n = 6; localizados al menos a 3 cm del margen tumoral y confirmados histológicamente como libres de tumor) de pacientes sometidos a resección primaria de glioma en el Hospital Afiliado Zhangzhou de la Universidad Médica de Fujian. Ninguno de los pacientes había recibido quimioterapia ni radioterapia antes de la cirugía. Todos los diagnósticos patológicos fueron verificados de forma independiente por dos neuropatólogos según la clasificación de tumores del sistema nervioso central de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 2021. Inmediatamente después de la escisión, las muestras de tejido se enjuagaban con solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS) fría para eliminar la sangre residual, se congelaban rápidamente en nitrógeno líquido (-196 °C) y se almacenaban a -80 °C hasta la extracción de ARN.
Líneas celulares y cultivo celular
Se obtuvieron líneas celulares de glioblastoma humano SHG44, U251, A172 y T98G, así como células gliales humanas normales (HEB), de repositorios autenticados y se confirmó que estaban libres de contaminación por micoplasmas antes de su uso. Las células se mantuvieron en el Medio de Águila Modificado (DMEM, glucosa alta) de Dulbecco, suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina, a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Las células se pasaban cada 4-5 días al alcanzar una confluencia del 80-90%. Para establecer la sobreexpresión de IRAINs y controlar las líneas celulares, las células fueron transducidas con vectores lentivirales que llevaban el transcrito IRAIN de longitud completa o un vector vacío como control. Se seleccionaron clones estables usando puromicina (2 μg/mL) durante 14 días. La eficiencia de la sobreexpresión se confirmó mediante la PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) antes de los ensayos posteriores.
Ensayo de proliferación celular de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT)
Las células se sembraron en placas de 96 pozos con una densidad de 1 × 104 células por pozo en 100 μL de medio de cultivo completo. A las 24, 48 y 72 horas después de la siembra, se añadieron 20 μL de solución de MTT (5 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato) a cada pozo y se incubaron durante 4 horas a 37 °C. Luego se extrajo el sobrenadante y se añadieron 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para disolver los cristales de formazan. La placa se agitó suavemente durante 10 minutos para asegurar una solubilización completa. La absorbancia se midió a 490 nm usando un espectrofotómetro de microplacas. Se restaron las lecturas de fondo de pozos en blanco. La viabilidad celular se calculó en relación con el grupo de 24 horas o control (establecido en 1,0). Todos los experimentos se realizaron con seis réplicas técnicas y tres réplicas biológicas independientes. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DS), y la significación estadística se determinó mediante una prueba t de dos colas.
Citometría de flujo para apoptosis (Anexina V - tinción FITC/PI)
Las células se sembraron en una confluencia del 60-70% y se trataron durante 24 horas bajo las condiciones indicadas. Se recogieron células flotantes y adherentes usando tripsina libre de EDTA, se combinaron y se lavaron dos veces con PBS helado. Los pellets celulares se resuspendieron en un tampón de unión a Annexin V (10 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mMCaCl 2) a 1 ×10 6 células/mL. Para cada muestra, se incubaron 100 μL de suspensión con 5 μL de Annexin V-FITC y 5 μL de yoduro de propidio (PI; 50 μg/mL) en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la adición de 400 μL de tampón de unión, las muestras se mantuvieron en hielo y se analizaron en un ciclo de 1 hora en un citómetro de flujo (excitación de 488 nm; 530/30 nm para FITC y >585 nm para PI). Se incluyeron controles adecuados de tinción única y fluorescencia menos uno para compensación. Se registraron al menos 10.000 eventos por muestra. Los datos se analizaron mediante gating de cuadrantes: poblaciones vivas (Annexin V⁻/PI⁻), poblaciones apoptóticas tempranas (Annexin V⁺/PI⁻), apoptóticas tardías (Annexin V⁺/PI⁺) y necróticas (Annexin V⁻/PI⁺). Se reportaron porcentajes de células apoptóticas tempranas + tardías (media ± DS, n = 3).
PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
El ARN total se aisló utilizando un reactivo ácido fenol-guanidinio según el protocolo del fabricante. La pureza del ARN se verificó mediante espectrofotometría (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1), y la integridad se confirmó mediante electroforesis en gel (número de integridad del ARN ≥ 7). Un microgramo de ARN total fue tratado con DNasa I y transcrito inversamente en una reacción de 20 μL utilizando hexámeros aleatorios y cebadores de oligo(dT). La reacción se realizó a 25 °C durante 10 minutos, 50 °C durante 30 minutos y 85 °C durante 5 minutos. La PCR cuantitativa se realizó en un sistema de 10 μL que contenía 5 μL de 2× SYBR Green Master Mix, 0,3 μM de cebador y 1 μL de ADNc (≈ 20 ng de ARN equivalente). Las condiciones de ciclo térmico fueron de 95 °C durante 5 minutos, seguidas de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 30 s, y después un análisis de curva de fusión de 65 °C a 95 °C en incrementos de 0,3 °C. Todas las reacciones se realizaron en triplicado, junto con controles sin plantilla y con menos RT. Se excluyeron los valores de Ct > 35 o SD replicado técnico > 0,5. La expresión relativa se calculó usando el método 2⁻ΔΔCt, con GAPDH como control interno. Se reportaron valores medios ± de SD de tres réplicas biológicas independientes, y se analizaron diferencias de grupo mediante una prueba t de dos colas.
Análisis de Western blot
Las células se lisaron sobre hielo en un tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato sódico, 0,1% SDS) suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa. Los lisados se incubaron durante 30 minutos sobre hielo con vórtices intermitentes y se despejaron por centrifugación a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Las concentraciones de proteínas se midieron mediante ensayo de BCA, se ajustaron a 1-2 μg/μL y se mezclaron 1:3 con tampón de Laemmli 4× (tampón final 1× que contenía 100 mM de DTT). Las muestras se desnaturalizaron a 95 °C durante 5 minutos. Se resolvieron cantidades iguales de proteína (50 μg) con un 12 % de SDS-PAGE a 100 V durante 90 minutos y electrotransferidas a las membranas PVDF a 250 mA durante 90 minutos. Las membranas se bloquearon con un 5 % de leche desnatada en TBST (0,1 % Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente (o 5 % de BSA para fosfoproteínas) y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 y β-actina (dilución típica 1:1000, β-actina 1:5000). Tras tres lavados de 10 minutos en TBST, las membranas se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:5000) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo y se desarrollaron utilizando sustrato quimioluminiscente. Las intensidades de las bandas se cuantificaron con ImageJ, se normalizaron a β-actina o proteína total, y se expresaron como media ± SD a partir de tres experimentos independientes.
Inmunocitoquímica
Las células cultivadas en cubiertas de vidrio estériles se enjuagaron dos veces con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras tres lavados de PBS, las células fueron permeabilizadas con 0,2% de Triton X-100 durante 10 minutos, bloqueadas con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% durante 1 hora, e incubadas durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-CD31 primario (dilución 1:200 en 1% de BSA). Tras tres lavados de PBS, las células se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor (dilución 1:500) durante 1 hora en la oscuridad, contrateñidas con DAPI (1 μg/mL, 5 min) y montadas en medio antifade. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia bajo idénticas configuraciones de exposición y ganancia. El porcentaje de área positiva en CD31 se cuantificó en cinco campos no solapados seleccionados aleatoriamente por muestra utilizando el software ImageJ. Este ensayo se realizó en modelos celulares en lugar de en secciones de tejido.
Análisis estadístico
Se realizaron análisis estadísticos utilizando la versión 4.3.0 de R junto con sus paquetes asociados. Para comparar variables categóricas, se empleó la prueba chi-cuadrado, mientras que las variables continuas se evaluaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon o la prueba T. La evaluación de variables continuas se realizó mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Los análisis de supervivencia se realizaron utilizando el paquete de supervivencia, que incluía la modelización de riesgos proporcionales de Cox y la generación de curvas de Kaplan-Meier, con umbrales de estratificación óptimos establecidos por el paquete survminer y la fórmula Riskscore = 
. El paquete CompareC se utilizó para evaluar los índices C de varias variables. La curva característica de funcionamiento del receptor (ROC), destinada a predecir variables categóricas binarias, se generaba utilizando el paquete pROC. Además, el área dependiente del tiempo bajo la curva ROC (AUC) para métricas de supervivencia se analizó utilizando el paquete timeROC. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con un enfoque bilateral. Se consideró estadísticamente significativo un nivel de significación de P< 0,05.
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Resultados
El IRAIN está regulado a la baja en el glioma y se asocia con características clinicopatológicas adversas
El proceso de análisis se ilustra en la Figura 1. La expresión de IRAIN se evaluó primero mediante qRT-PCR en astrocitos primarios, tejidos de glioma y líneas celulares de glioma. Los niveles de IRAIN se redujeron notablemente tanto en tejidos gliomas de bajo y alto grado como en las cuatro líneas celulares de glioma (SHG44, A172, U251 y T98G) en comparación con los a...
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Discusión
El glioma sigue siendo una de las malignidades más letales del sistema nervioso central, caracterizada por una profunda heterogeneidad intratumoral y resistencia a la terapia convencional. A pesar de la resección quirúrgica combinada con quimiorradioterapia, la recurrencia y mortalidad siguen siendo altas, y la supervivencia mediana de los pacientes, especialmente de aquellos con glioblastoma, ha mostrado una mejora limitada en las últimasdécadas 4,24
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a todos los participantes e investigadores implicados en el proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx) y en las bases de datos TCGA, CGGA, por compartir los datos disponibles. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Provincial de Tecnología Sanitaria de Fujian (2024GG01010154) y el Proyecto de Escalada de Estaciones de Trabajo Doctorales del Hospital Zhangzhou (PDA202306). El financiador proporcionó fondos para nuestra investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Annexin V-PI Apoptosis Kit | Southern Biotechnology, Birmingham, ALABA, EE. UU. | NA | Utilizado para evaluar la apoptosis |
| AnnexinV-PI Apoptosis Kit | Biotecnología del Sur | 10010-02 | Utilizado para la evaluación de la apoptosis mediante citometría de flujo. |
| Anti-IGF1, Anti-IGF1R, Anti-JAK2, Anti-STAT3, Anti-Supervivencia, Anti-β-actina | Abcam | AB182408, AB108596, AB109085, AB76424, AB8227 | Anticuerpos utilizados para el análisis de Western Blot de las vías de señalización. |
| BiocManager | CRAN | 1.30.25 | Instalar y gestionar paquetes de Bioconductor en R & ge; 3.6. |
| Sistema Bio-Rad CFX96 | Bioconductor | 1.5.1 | Acceso programático a la proteína STRING– interacciones con proteínas. |
| Caret | CRAN | 0.4 | ROC/AUC dependiente del tiempo para modelos de supervivencia. |
| Atlas del Genoma del Glioma Chino (CGGA) | NA | CGGA693 y CGGA325 | Utilizado para la consolidación y validación del modelo |
| Clusterprofiler | Bioconductor | 2.18.0 | Analizar archivos MAF; calcular la carga mutacional tumoral (TMB) y el paisaje mutativo. |
| Corrplot | CRAN | 3.5.0 | Gráficos generales (diagramas de cajas, gráficos de violín, dispersión, líneas de tendencia). |
| Coxboost | CRAN | 7.3-60 | stepAIC para la selección de modelos Cox paso a paso. |
| Data.Table | CRAN | readr2.1.5 | Lectura rápida de archivos delimitados; Manejo robusto de UTF-8. |
| Dosis | Bioconductor | 3.17.0 | Anotación genética humana (mapeos de Entrez, Ensembl, SYMBOL). |
| Dynamictreecut | CRAN | 1.73 | Análisis ponderado de redes de coexpresión génica; pickSoftThreshold, TOM, detección de módulos. |
| Edger | Bioconductor | 3.56.2 | Expresión diferencial (modelos voom/lineales); Wilcoxon/Bayes empírico; Entradas de volcán/mapa de calor. |
| Enrichplot | Bioconductor | 3.26.2 | Enriquecimiento de ontología de enfermedades y ayudantes GSEA (usados con clusterProfiler). |
| Flashclust | CRAN | 1.63-1 | Corte adaptativo de ramas para la detección de módulos WGCNA. |
| GBM | CRAN | 1.12 | Componentes principales supervisados para el análisis de supervivencia. |
| Omnibus de Expresión Génica (GEO) | NA | GSE43378 | Utilizado para la consolidación y validación del modelo |
| GEOquery | Bioconductor | NA | Descarga y analiza conjuntos de datos GEO. |
| Ggplot2 | CRAN | 1.0.12 | Mapas de calor listos para publicación de firmas de expresión. |
| Glmnet | CRAN | 3.3.1 | Bosque de supervivencia aleatorio para resultados censurados y correctos. |
| Anticuerpos secundarios anti-conejo marcados con peroxidasa de rábano picante | Abcam | AB6721 | Anticuerpos secundarios para la detección en Western Blot. |
| Líneas celulares de glioblastoma humano (SHG44, U251, A172, T98G) | Colección Americana de Cultivo de Tejidos | NA | Líneas celulares de glioblastoma humano para la investigación del glioma. Las células se cultivaron en DMEM + 10% FBS, 2 mM de L-glutamina. |
| Igraph | CRAN | 10.0.1 | Accede a conjuntos de genes de MSigDB (por ejemplo, MRGs metabólicos); Marcos ordenados y convenientes. |
| Software Image J | Media Cybernetics, EE. UU. | 152 | Utilizado para visualización |
| Vector lentiviral que codifica lncRNA-IRAIN | GeneChem, Shanghái, China y nbsp; | NA | Vectores lentivirales usados para la transfección de células de glioma y HEB para establecer clones estables. |
| Limma | Bioconductor | 3.48.0 | Corrección por lotes (ComBat) y análisis de variables sustitutas. |
| Maftools | Bioconductor | 1.52.0 | Harrell' s índice de concordancia (índice C) y utilidades de comparación de supervivencia. |
| Misa | CRAN | 4.1-8 | Modelos Cox penalizados: Lazo, Cresta y Red Elástica. |
| Msigdbr | CRAN | 0.0.5 | Soporte métodos de máquina vectorial para datos de supervivencia. |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | Se utiliza para ensayos de proliferación celular. |
| Células gliales normales (HEB) | Colección Americana de Cultivo de Tejidos | NA | Línea celular glial humana normal para estudios de comparación. Cultivado en DMEM + 10% FBS. |
| Org.Hs.Eg.Db | Bioconductor | 4.8.3 | enriquecimiento GO/KEGG y GSEA; soporta múltiples tipos de ID. |
| Mapa de preotijos | CRAN | 2.0.0 | Gramática de la ciencia de datos; Incluye DPLYR, Tidyr, Purrr, ggplot2 para manejar y planear. |
| Plsrcox | CRAN | 1.5 | Aumento basado en probabilidad para modelos Cox. |
| Membranas PVDF | Millipore | IPVH00010 | Membranas utilizadas para la transferencia de proteínas tras SDS-PAGE. |
| randomforestsrc | CRAN | 6.0-94 | Remuestreo unificado (incluyendo LOOCV), cuadrículas de ajuste y pipelines de modelos. |
| Readr | CRAN | NA | Recuperar matrices/fenotipos de UCSC Xena (por ejemplo, hubs TCGA/GTEx). |
| Gel SDS-Page (12%) | Bio-Rad | 185-5096 | Sistema utilizado para PCR cuantitativa. |
| Stringdb | Bioconductor | 1.20.3 | Visualización para resultados de enriquecimiento (dotplot, cnetplot, ridgeplot). |
| Superpc | CRAN | 1.7.7 | Regresión parcial de mínimos cuadrados adaptada a modelos de Cox. |
| Supervcomp | Bioconductor | 3.42.4 | Cuenta la normalización y la estimación de dispersión cuando es necesario (opcional, complementa limma voom). |
| Supervivencia | CRAN | 1.01-2 | Agrupamiento jerárquico rápido utilizado por WGCNA (opcional). |
| Supervivenciasvm | CRAN | 2.2.2 | Modelado de regresión generalizada potenciada (aumento de gradiente). |
| Survminer | CRAN | 3.8-3 | Modelos de riesgos proporcionales de Cox; Kaplan– Curvas Meier. |
| TCGAbiolinks | Bioconductor | T9039 | Acceso programático a datos TCGA; Descarga/prepare datos de expresión y clínicos. |
| El Programa del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) | NA | https://www.cancer.gov/tcga; 175 GBM y 534 LGG | Utilizado para la consolidación y validación del modelo |
| Tidyverse | CRAN | 1.17.6 | Manipulación de datos de alto rendimiento para matrices/tablas grandes. |
| Timeroc | CRAN | 0.5.0 | Visualización de KM y renderizado de tablas de riesgos. |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | Reactivo para la extracción de ARN de las células. |
| UCSC Xena | NA | https://xenabrowser.net/datapages/ | Utilizado para la consolidación y validación del modelo |
| Ucscxenatools | Bio-Rad | 4561044 | Utilizado para la separación de proteínas en el análisis de Western Blot. |
| WGCNA | CRAN | 0.95 | Matrices de correlación para genes de puntos de control y relaciones de características. |
Referencias
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