Artículo de método

Mejorando las pantallas CRISPR-Cas9 en células CAR T: un método refinado para la preparación de bibliotecas

DOI:

10.3791/69721

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2 de enero de 2026

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1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desarrollamos un protocolo optimizado de cribado knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T primarias. Al reducir la retención de ADNgDNA mediante la digestión enzimática y la reducción de la extracción de casetes de ARNg, este enfoque minimiza los artefactos de PCR, asegurando una detección precisa de ARNsgDNA y una identificación robusta de dianas génicas funcionales.

Resumen

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Las terapias con receptor de antígenos quiméricos (CAR) con células T han demostrado una eficacia notable en varias malignidades hematológicas, pero su éxito no se ha replicado completamente en tumores sólidos. Además, incluso en los cánceres hematológicos, la recaída tras la infusión de células T CAR continúa comprometiendo los resultados a largo plazo. Estos desafíos ponen de manifiesto la urgente necesidad de desarrollar estrategias que mejoren la eficacia, persistencia y superación de la resistencia mediada por tumores y microambientes. Las plataformas de cribado con repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente intercaladas (CRISPR)-Cas9 proporcionan un enfoque potente para identificar sistemáticamente genes que regulan la función de las células CAR T. Al vincular perturbaciones genéticas con resultados fenotípicos, estos ensayos permiten descubrir vías que controlan la activación, proliferación, formación de memoria y citotoxicidad. Los flujos de trabajo estándar implican la transducción de un número considerable de células con una única biblioteca de ARN guía (sgRNA), edición mediada por Cas9, selección de células editadas y amplificación por PCR de casetes de sgRNA a partir de ADN genómico (gDNA) antes de la secuenciación. Sin embargo, la amplificación por PCR utilizando grandes cantidades de ADNg plantea desafíos significativos y a menudo no logra amplificar ni recuperar selectivamente los sgRNAs. Aquí describimos un protocolo optimizado de cribado knockout CRISPR-Cas9, que hemos probado en células CAR T humanas primarias. El método aquí incorpora un paso intermedio durante la preparación de la biblioteca de sgRNA que reduce la retención de gDNA mediante la digestión enzimática y el pulldown selectivo del casete de sgRNA, aumentando así la eficiencia de la primera amplificación por PCR. Esta modificación nos permitió recuperar información de sgRNA a través de nuestras pantallas de células CAR T, que habían permanecido esquivas en nuestros intentos anteriores usando protocolos tradicionales de amplificación PCR de 1 y 2 pasos. En conclusión, este flujo de trabajo optimizado facilita la preparación de la biblioteca de cribado CRISPR en muestras desafiantes y permite la identificación de determinantes genéticos clave que pueden ser dirigidos para mejorar la eficacia terapéutica.

Introducción

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La inmunoterapia ha revolucionado el tratamiento del cáncer, ofreciendo nuevas estrategias para aprovechar y modular el sistema inmunitario. Entre ellas, la terapia con linfocitos T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) ha surgido como uno de los enfoques más transformadores. Esta terapia implica la ingeniería genética de las células T del paciente ex vivo con un receptor sintético diseñado para reconocer un antígeno tumoral específico, aumentando así la actividadantitumoral 1. Las células CAR T han mostrado un éxito notable en malignidades hematológicas, con resultados que van desde remisiones de corta duración hasta una supervivencia prolongada libre de enfermedad con toxicidad mínima en pacientes que recibieron terapias dirigidas al CD19 o aBCMA2. Hasta la fecha, la FDA ha aprobado siete productos de células CAR T para cáncereshematológicos 3. A pesar de estos avances, persisten limitaciones significativas. Surgen desafíos derivados del propio producto de células T CAR, a menudo influenciados por el proceso de fabricación o la aptitud de las células T del paciente, que pueden verse afectadas por la progresión de la enfermedad, terapias previas o la edad. Los mecanismos de resistencia intrínsecos al tumor, como la regulación a la baja de antígenos, también pueden comprometer sueficacia 4. Además, el microambiente tumoral inmunosupresor supone una barrera adicional que limita severamente la persistencia y función de las células CAR T, especialmente en pacientes con tumorsólido 5. Por ello, existe una necesidad urgente de mejorar tanto la eficacia inicial como la a largo plazo de las terapias con células CAR T.

La llegada de la edición génica CRISPR-Cas9 ha proporcionado herramientas poderosas para diseccionar la función génica mediante enfoques de cribado a gran escala. En estos ensayos, las células se transducen con una biblioteca de ARN de una sola guía (sgRNA), normalmente administrada por vectores lentivirales, asegurando un sgRNA por célula y una integración genómica estable. Tras la edición y selección mediada por Cas9 de las células transducidas, se extrae ADN genómico (gDNA) y los casetes de sgRNA se amplifican mediante PCR para la preparación de la biblioteca. La secuenciación de alto rendimiento permite entonces cuantificar las distribuciones de sgRNA entre diferentes fenotipos, identificando así genes que regulan positiva o negativamente el proceso bajo el estudio6.

El cribado CRISPR se ha aplicado ampliamente para explorar la biología de las células T y, más recientemente, para mejorar el rendimiento de las células CAR T. Los cribados a nivel genómico han identificado reguladores de procesos fundamentales de células T, incluyendo activación, proliferación y diferenciación. Por ejemplo, se identificó FAM49B como regulador de la señalización del receptor de célulasT 7, mientras que SOCS1, TCEB2, RASA2 y CBLB resultaron esenciales para la proliferación tras la estimulación8. Más allá de estas vías centrales, el cribado CRISPR también ha elucidado genes implicados en la memoria y el agotamiento de las células T. Los estudios in vivo identificaron Fli1 como candidato para mejorar las respuestas efectoras sin alterar la memoria o los precursores deagotamiento 9, y al remodelador de cromatina Arid1a como regulador cuya pérdida reduce el agotamiento de célulasT 10. Los reguladores de la diferenciación de T helper tipo 2 (Th2) también se han caracterizado con este enfoque11. Utilizando una biblioteca personalizada de sgRNA dirigida a 25 quinasas, se encontró que p38 promueve la expansión, la formación de memoria y la protección frente al estrés oxidativo ygenómico 12. De manera similar, el knockout por REGNASA-1 en células T CD8+ confirió un fenotipo efector de larga duración que mejoró el control tumoral en los modelos13 de melanoma y leucemia. Cribajes genómicos adicionales identificaron a Dhx37 como regulador de la activación y citotoxicidad de las célulasT 14, mientras que LTBR y otros genes fueron validados como potenciadores de la función de las células T en células CAR T y células Tγδ 15. Más recientemente, el cribado CRISPR se ha aplicado directamente en células CAR T, revelando nuevos objetivos como PRODH2, una enzima implicada en el metabolismo de la prolina que mejora la actividad antitumoralde CAR T 16, y TLE4 e IKZF2, cuya inactivación mejoró la eficacia de CAR T en los modelos17 de glioblastoma.

Un paso crítico en los cribados CRISPR es precisamente la amplificación selectiva de casetes de sgRNA a partir de cantidades extremadamente grandes de ADNg, un desafío difícil de superar dado el gran número de células utilizadas en los cribados CRISPR. La amplificación por PCR a partir de grandes cantidades de ADN transportado plantea varios desafíos técnicos, incluyendo el apiñamiento molecular que limita la difusión física de moléculas de ADN y polimerasa, la unión transitoria y inespecífica de los cebadores y la polimerasa al fondo del ADN, la amplificación fuera del objetivo que provoca el agotamiento de los cebadores, o la captura de Mg2+ por parte de la columna vertebral de fosfato de ADN, entre otrosdesafíos. 19, 20, 21. Estos suelen provocar fallos de PCR y/o sesgo. Para mitigar estos problemas, se han propuesto diferentes estrategias, incluyendo separar la amplificación de sgRNA de la adición de adaptadores en dos pasosde PCR 22, el uso de enriquecimiento de objetivos con oligos biotinilados y captura de perlasmagnéticas 23,24, o el diseño de plásmidos con sitios de restricción flanqueando el cassette de sgRNA para el enriquecimientode fragmentos 25.

En este estudio, presentamos un protocolo optimizado de cribado knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T humanas primarias. La biblioteca CRISPR utilizada es Brunello Kinome 1, una biblioteca que contiene 3052 sgRNAs únicos de 20nt de longitud dirigidos a 763 genes quinasas humanas (4 sgRNAs por objetivo). Las células T fueron aisladas mediante selección magnética positiva CD4+ y CD8+ de la fracción enriquecida con células mononucleares en sangre periférica (PBMC) de muestras de sangre de donantes sanos. Al activarse con anti-CD3 y anti-CD28, las células T fueron infectadas con la biblioteca de cribado CRISPR, y luego transducidas con el lentivirus CAR. Las células se expandieron y luego nucleofectaron para introducir la proteína Cas9. Se seleccionaron células portadoras de CRISPR con puromicina y se clasificaron células T CAR-positivas. Tras la extracción, el ADN genómico fue digerido con enzimas de restricción (ER), y los fragmentos que contienen sgRNA fueron absorbidos por captura de sonda de biotina y estreptavidina. A continuación, los sgRNA se amplificaron e indexaron selectivamente mediante dos PCRs consecutivas, y las bibliotecas resultantes fueron secuenciadas. Al incorporar un paso intermedio para reducir la acumulación de ADNG, pudimos recuperar y amplificar selectivamente nuestro sgRNA de interés, lo que nos permite estudiar el papel de las quinasas en las células T CAR.

Protocolo

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Este protocolo se llevó a cabo conforme a las directrices de la Universidad de Navarra. Todos los sujetos proporcionaron su consentimiento informado por escrito. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento y activación de células T

  1. Aislamiento PBMC
    1. Recoger muestras de sangre de donantes en tubos de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA), transferir muestras de sangre a tubos cónicos de 50 mL y diluir la sangre con PBS (dilución 1:1).
    2. Añadir 15 mL de medio gradiente de densidad al fondo de un tubo cónico de 50 mL (densidad para PBMCs: 1,07). Luego, añade cuidadosamente 25 mL de sangre diluida sobre la capa media de gradiente de densidad (la velocidad más lenta del controlador de la pipeta). Centrifugar durante 30 minutos a 800 × g sin freno.
    3. Recoge el anillo/capa de PBMC con una pipeta Pasteur en un tubo cónico de 50 mL y añade PBS a un volumen total de 50 mL para lavar. Centrifugar a 650 × g durante 8 minutos. Descarta el sobrenadante.
      NOTA: Comprueba la turbidez del sobrenadante para asegurarte de que no hay células allí. En caso de duda, divide la suspensión en el doble del número original de tubos cónicos de 50 mL, añade PBS hasta 50 mL y centrifuga de nuevo.
    4. Resuspende 50 mL de PBS. Contar con acridina naranja-propidio yoduro (AOPI) en un contador celular. Centrifugar a 650 × g durante 8 minutos.
  2. Selección magnética CD4 y CD8
    1. Preparar el tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS): PBS, EDTA 2,5 μM, BSA 0,5% y filtrar a través de 0,2 μm.
    2. Resuspende PBMCs en 80 μL de buffer FACS estéril por cada 10 ×10 6 celdas y añade 10 μL de microperlas CD4 y 10 μL de microperlas CD8 por cada 10 × 106 celdas. Incuba 20 minutos a 4 °C.
    3. Añade 10 mL de tampón FACS y centrifuga durante 8 minutos a 650 × g. Descarta completamente el sobrenadante.
    4. Resuspender en 500 μL por cada 1 ×10 8 celdas de FACS Buffer en un tubo cónico de 15 mL.
      NOTA: Una pista puede alojar 200 x 106 celdas.
    5. Utiliza el programa Possel para el aislamiento de AutoMac (clasificador de celdas magnéticas de alta velocidad).
    6. Suma hasta 10 mL de PBS, cuenta con AOPI en un contador de células fluorescentes y centrifuga a 650 × g durante 8 minutos.
    7. Resuspender células 1 x 106/mL en un medio de crecimiento de células T que contenga un 3% de suero humano (HS), 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 625 IU/mL de interleucina (IL)-7, 85 UI/mL de IL-15. Añade 10 μL de reactivo de estimulación de células T por cada 1 mL y mezcla bien. Placar 2 mL por pozo en una placa de 24 pozos (p24w) e incubar durante 24 horas a 37 °C.

2. Producción de células CAR T y cribado CRISPR

  1. Espinfección de la biblioteca y transducción de CAR
    1. Añade la cantidad correspondiente de la biblioteca CRISPR de lentivirus (por ejemplo, la biblioteca Brunello Kinome 1). Véase la Tabla Suplementaria 1), determinada en un ensayo de titulación y 8 μg/mL de polibrene.
    2. Espinfecta por centrifugación a 700 x g durante 1 hora y 30 minutos a 32 °C.
    3. Sustituir el medio por un medio fresco de crecimiento de células T que contenga 3% de HS, 1% P/S, 625 IU/mL de IL-7, 85 IU/mL de IL-15 ([célula] final = 106 células/mL).
    4. Tras 6 horas, añadir la cantidad correspondiente de vector lentiviral CAR a una multiplicidad de infección (MOI) de 3 e incubar durante 4 días.
  2. Electroporación Cas 9
    1. Recoge células CAR T, lávate una vez con PBS y cuenta las células con AOPI en un contador de células fluorescentes.
    2. Preparar Cas9 de 4 μM en un buffer de electroporación.
    3. Resuspender las células CAR T en 50 μL por 5 × 106 celdas. Mezcla y añade cuidadosamente 50 μL de suspensión de celda en cada pozo de una tira de cuveta multipozo sin formar burbujas. Luego, usando una punta de pipeta, elimina cualquier burbuja posible y pasa la punta por los bordes del pozo.
      NOTA: Si queda algún pozo en una cubeta, añade el mismo volumen de buffer de electroporación. Este es un paso crítico: si la máquina detecta una burbuja o una diferencia de volumen, dará un error.
    4. Utiliza el programa EXPANDIR LA CÉLULA T 3 a las células CAR T nucleofectas.
    5. Deja las células de las cubetas en una incubadora a 37 °C durante 40 minutos.
    6. Resuspender las células nucleofectadas en un medio de crecimiento de células T que contenga 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (célula final = 106 células/mL) e incubar a 37 °C durante 3 días.
  3. Selección de puromicina
    1. Cuenta con AOPI en un contador de células fluorescentes.
    2. Ajusta a 1 x 106 células/mL con un medio de crecimiento de células T que contenga IL7 e IL15.
    3. Añade puromicina (2,5 μg/mL) al medio.
    4. Contar las células cada 2 días durante 6 días y ajustar a 1 x 106 células/mL con un medio de crecimiento celular que contenga 3% de HS, 1% P/S, 625 UI/mL de IL-7, 85 UI/mL de IL-15 y 2,5 μg/mL de puromicina.
    5. Comprobar porcentaje de COCHE.
  4. Clasifica las poblaciones de células CAR T y almacena muestras (pellets de células secas) a -80 °C.

3. Aislamiento del ADNG

NOTA: Evitar cualquier pérdida celular o de ADNg durante el proceso, ya que esto podría comprometer la representatividad de los sgRNAs. Procura una cobertura de sgRNA de al menos 500 veces.

  1. Extrae gDNA de muestras usando el kit de extracción de células y tejido de ADN. Elute dos veces para maximizar la recuperación de ADNG.
    NOTA: No utilice más de 4 x 106 células/columna para recuperar el ADN de forma más eficiente.
  2. Mide la concentración de gDNA con el kit de cuantificación de dsDNA.
    NOTA: Si la concentración es demasiado baja para los pasos posteriores del protocolo, utilice un reactivo de limpieza basado en perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) para concentrar el ADN.

4. Enriquecimiento de casete de sgRNA (y eliminación de la retención de ADNg)

  1. Digestión con enzimas de restricción
    1. Digiera un máximo de 5 μg de ADNG con 20 U de la enzima/s (por ejemplo, para lentiGuide-puro backbone para la biblioteca Brunello Kinome 1 usa la combinación NdeI y PspXI) en un volumen total de 50 μL. Escala el número de reacciones para lograr la representatividad deseada del sgRNA.
      NOTA: Selecciona las enzimas de restricción que se cortarán en las regiones laterales del casete, pero ten en cuenta que algunos de los sgRNAs podrían contener un sitio de restricción. Estos sgRNAs se perderán en este paso y no aparecerán en la secuenciación. La ausencia de esta guía sirve como control de la digestión. La Tabla Suplementaria 1 muestra una lista de sgRNAs de Kinome 1 que son escindidos por PspXI y NdeI.
    2. Incuba durante la noche a 37 °C en un termociclador.
    3. Realiza una limpieza SPRI de 2 veces.
      1. Preparar 10 mL de tampón de elución (EB) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) y 50 mL de etanol fresco al 70%.
      2. Vórtice las perlas y añade 100 μL al producto de la digestión.
      3. Mezcla bien pipeteando y incuba durante 5 minutos. Magnetiza otros 5 minutos.
      4. Mientras estás sobre el imán, añade 200 μL de etanol al 70% sin alterar la pastilla. Espera 30 segundos y luego descarta el sobrenadante.
      5. Repite el paso 4.1.3.3 para un total de 2 lavados. Deja que las cuentas se sequen durante 2 minutos.
      6. Retira del imán, añade 40 μL de buffer de elución y vuelve a suspender las perlas pipeteando. Incuba durante 2 minutos.
      7. Magnetiza durante 2 minutos y transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo.
        NOTA: Al configurar este protocolo por primera vez, verifica la digestión mediante electroforesis (capilar). Asegúrate de que se observe una mancha.
  2. Pulldown del cassette sgRNA.
    1. Preparación de perlas magnéticas de estreptavidina.
      1. Preparar el tampón de lavado/unión 2x: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA. Diluye la mitad del volumen conH 2O a 1x.
      2. Haz un vórtice en las cuentas durante 1 minuto.
      3. Transfiere el volumen deseado de perlas a un tubo (normalmente 1 mg es suficiente), añade un volumen igual de Wash/Binding Buffer 1 vez, o al menos 1 mL, y vuelve a suspender.
      4. Coloca el tubo sobre un imán durante 1 minuto y descarta el sobrenadante.
      5. Retira el tubo del imán y vuelve a suspender las perlas lavadas en el mismo volumen de 1x Wash/Binding Buffer que el volumen inicial de perlas extraídas del vial.
      6. Repite durante un total de 3 lavados.
      7. Resuspende las cuentas en 2x Wash/Binding Buffer.
    2. Añadir 5 μL de cebadores pulldown de 10 μM listados en la Tabla 1 a la digestión purificada del paso 4.1.3.6.
    3. Incuba en un baño seco a 96 °C durante 5 minutos y luego lleva inmediatamente a hielo durante 5 minutos.
    4. Añade 1 mg de perlas magnéticas de estreptavidina prelavadas.
      NOTA: La unión biotina-estreptavidina funciona mejor a 1 M NaCl. Asegúrate de mezclar volúmenes iguales de cuentas y ADN biotinilado.
    5. Incuba durante 20 minutos mientras vuelves a suspender la mezcla cada 4 minutos.
    6. Magnetiza durante 5 minutos.
    7. Lava las cuentas 3 veces con 1× Buffer de Lavado/Atadura.
    8. Resuspende las cuentas en 50 μL de EB 8.0.
      NOTA: Los casetes de sgRNA usados aquí están ligados a las perlas de estreptavidina. No los descartes.

5. Preparación de la biblioteca de sgRNA

  1. PCR1
    1. Preparar la mezcla PCR1 con 20 μL de tampón Herculase 5x, 1 μL de dNTP (100 mM), 1 μL de ADN polimerasa, 2,5 μL de 10 μM de cebadores PCR1 directos y inversos listados en la Tabla 1, y 23 μL de agua de grado PCR. Mezcla pipetas y añade mezcla PCR1 a las perlas del paso 4.2.8.
      NOTA: La Tabla 1 enumera los cebadores PCR1 diseñados para la Biblioteca Brunello Kinome 1.
    2. Coloque los tubos en un termociclador y ejecute el programa de PCR1 descrito en la Tabla 2.
      NOTA: Asegúrate de que el termociclador puede soportar reacciones de 100 μL. Por lo demás, alicuota en reacciones de 50 μL. Escala según sea necesario.
    3. Agrupa todas las PCR1 de las mismas muestras en un solo tubo.
    4. Limpieza de SPRI PCR1 usando 150 μL (1,5x) de perlas (seguir los pasos 4.1.3.3-4.1.3.7). Resuspende cada reacción PCR en 100 μL de EB 8.0.
      NOTA: Si configuras este protocolo por primera vez, verifica el tamaño y la calidad del producto de PCR ejecutando 2 μL de un producto de 30 ciclos en un sistema de electroforesis capilar (por ejemplo, los sistemas TapeStation de Agilent).
  2. PCR2
    1. Preparar la mezcla de PCR2 con 10 μL del producto de la PCR1, 10 μL de tampón 5X, 0,5 μL de dNTP (100 mM), 1 μL de ADN polimerasa, 1,25 μL de cebadores PCR2 de 10 μM listados en la Tabla 1 (utilice una combinación diferente de rP7-i7-BC y P5-i5-BC para cada muestra), y 26 μL de agua de grado PCR para un volumen total de 50 μL.
      NOTA: Para mantener la representación de la biblioteca, realiza una reacción PCR2 por cada 10o 4 constructos en la biblioteca.
    2. Coloca los tubos en un termociclador y ejecuta el programa de PCR2 descrito en la Tabla 2.
    3. Limpieza de PCR2 SPRI usando 75 μL (1,5x) de perlas (seguir los pasos 4.1.3.3-4.1.3.7). Resuspende cada reacción PCR en 50 μL de EB 8.0.
  3. Cuantifiquen la PCR2 (es decir, la biblioteca de sgRNA) usando el kit de cuantificación de dsDNA y verifiquen el tamaño del amplicón mediante electroforesis capilar (por ejemplo, sistemas TapeStation). Agrupa las muestras.
  4. Secuencia en un instrumento Illumina.
    NOTA: Para la biblioteca Brunello Kinome 1 de 3052 sgRNA aquí, una profundidad de secuenciación de 100-200 millones de lecturas por muestra suele ser suficiente.

6. Análisis

  1. Desmultiplexar muestras usando bcl2fastq.
  2. Comprueba la calidad de los archivos fastq generados con FastQC.
  3. Extrae la secuencia del sgRNA usando como patrón las secuencias de casete que flanquean el sgRNA, así como la longitud de la guía (20 nt).
  4. Alinea la secuencia extraída con la referencia de la biblioteca usando Bowtie2 para comprobar cuántas de las guías hipotéticas son sgRNA auténticos de la biblioteca. Usa samtools para convertir el archivo SAM con información sobre la alineación al formato BAM y generar archivos resumen.
  5. Contar y normalizar el número de lecturas para cada sgRNA en las muestras editadas y de control con la función de conteo del software MAGecK.
  6. Compara los recuentos con la función de prueba de MAGecK para obtener las puntuaciones RRA y la lista de genes candidatos.

Resultados

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Como se describe en la Sección de Protocolos, las células CAR T se generaron siguiendo nuestro protocoloestablecido 26. Para el cribado CRISPR, adaptamos el flujo de trabajo desarrollado por Wang et al.17 (Figura 1A). Brevemente, las células T de dos donantes independientes fueron aisladas y activadas durante 24 horas antes de la transducción consecutiva tanto con la biblioteca de ARNsgRNA CRISPR como con el vector lentiviral CAR, alcanzando el 67% y el 72% de células CAR-positivas al día 5. Una fracción de células fue nucleofectada con la proteína Cas9 para inducir knockouts, mientras que las células restantes sirvieron como línea base para la representación de sgRNA. Se seleccionaron células transducidas con antibióticos y posteriormente se clasificaron poblaciones distintas según los fenotipos estudiados. La proliferación de células CAR T se monitorizó a lo largo del cribado utilizando recuentos celulares basados en AOPI, y se expresó como cambio de pliegue (Figura 1B). Tras la suplementación con puromicina en los días 8, 10 y 12, confirmamos el enriquecimiento exitoso de células CAR T transducidas con la biblioteca CRISPR en ambos donantes, como lo demuestra la supervivencia y proliferación continuadas. Se utilizaron células T no transducidas (UTD) y células T CAR sin transducción de biblioteca CRISPR como controles de la selección de antibióticos.

Tras la extracción de ADN genómico, se prepararon bibliotecas de sgRNA mediante amplificación por PCR. Para superar los problemas derivados de un exceso de retención de ADNg, implementamos un protocolo que incorpora la digestión enzimática de restricción y la reducción de biotina-estreptavidina del casete de sgRNA (Figuras 2A,B). El ADNg fue digerido con las enzimas de restricción NdeI y PspXI en los sitios de digestión que flanquean el casete de ARNsg (Figura 2C). Se usaron oligos biotinilados, diseñados para unirse aguas arriba de los sitios de recocido de cebadores PCR1, para capturar fragmentos de casete de sgRNA, y luego se extrajeron hacia abajo con perlas de estreptavidina para eliminar el gDNA transportado. Los fragmentos que contenían sgRNA fueron luego amplificados selectivamente (Figura 2D) e indexados mediante 2 PCR consecutivas.

Las bibliotecas de cada muestra se secuenciaron utilizando la secuenciación de nueva generación (NGS). Tras la desmultiplexación, el control de calidad y la identificación de sgRNA, los datos se analizaron con la tubería MAGeCK. Primero, el comando de recuento cuantificó y normalizó los recuentos de lectura de sgRNA en muestras de control (basales) y editadas por Cas9 (Figura 3A,B). Las correlaciones de Pearson y Spearman indican que la representatividad del sgRNA se mantuvo durante el experimento (ADNg donante) en comparación con la biblioteca plasmídica (Figura 3C). A continuación, el comando de prueba comparó ambas condiciones, asignando puntuaciones robustas de agregación de rangos (RRA) a cada gen (Figura 3D). Se identificaron genes significativamente enriquecidos o agotados utilizando umbrales de p < 0,05 y log fold change (LFC) > 0,5 (Figura 3E). Finalmente, se realizó un análisis de enriquecimiento de vías de genes candidatos utilizando Metascape, revelando los principales términos de la Ontología Génica asociados a los reguladores identificados (Figura 3F).

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Figura 1: Cribado CRISPR en células CAR T. (A) Esquema del cribado CRISPR en células CAR T. (B) Selección de células transducidas con puromicina (P). Las bibliotecas plasmídicas incluyen un gen de resistencia a la puromicina para la selección positiva. El antibiótico se añadió al día 8 al medio en muestras no transducidas de células T no transducidas (UTD) y CAR T transducidas. Se utilizaron muestras sin puromicina como control de la proliferación. Se muestran datos de dos donantes independientes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Preparación de la biblioteca para el análisis de enriquecimiento de sgRNA. (A) Esquema del protocolo para la preparación de la biblioteca. (B) Esquema de la localización relativa de los tamaños de corte de la enzima de restricción (tijeras) y las regiones de recocido de cebadores PCR1 (flecha) y cebadores biotinilados (flecha con punto verde). (C) Electroforesis del ADNG antes y después de la digestión de la RE. (D) Enriquecimiento selectivo de casetes de sgRNA tras PCR1. Se muestran datos de dos donantes independientes de muestras basales y Cas9 de ambos fenotipos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Guía análisis de enriquecimiento con MAGeCK. (A) Resumen de la salida de la función de recuento MAGeCK. (B) Distribución de los conteos de lecturas. (C) Coeficientes de Pearson y Spearman para la correlación entre el gDNA de donantes y el recuento de bibliotecas de plásmidos. (D) Genes potencialmente enriquecidos/agotados clasificados mediante una agregación de clasificación robusta modificada (puntuación RRA). (E) Gráfico volcánico mostrando genes significativos (valor p < 0,05, LFC > 0,5) en rojo. (F) Términos de la Ontología Superior de Genes (GO) tras el análisis de la vía Metascape de los genes significativos enriquecidos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Secuencia de cebadores. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Condiciones de PCR. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 1: Lista de sgRNA en la biblioteca Kinome 1 y sgRNAs perdidos durante la digestión con NdeI y PspXI Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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El cribado CRISPR se basa en el principio de perturbación de una sola guía, lo que significa que solo debe integrarse un ARNsg por célula. Para lograrlo, los sgRNAs suelen administrarse mediante vectores lentivirales, y la multiplicidad de la infección (MOI) debe controlarse cuidadosamente. Un MOI de ca. Generalmente se recomienda 0,3, lo que resulta en que entre el 25% y el 30% de las células sean transducidas con una sola partículaviral 6. Por tanto, una titulación precisa es esencial para determinar el volumen de partículas virales necesarias. Otro paso crítico es la pérdida de cobertura de sgRNA durante el protocolo. La pérdida celular durante la extracción, las ineficiencias durante la extracción de ADNG (principalmente sobrecarga en columna y elución incompleta del ADN), o un exceso de plantilla durante la amplificación por PCR pueden contribuir a esta pérdida, sesgando así nuestro análisis de sgRNA. En cuanto a los oligos biotinilados, es mejor que se purifiquen con HPLC para evitar que la biotina libre utilizada en la síntesis sature las perlas de estreptavidina. Además, se recomienda fuertemente un amino-modificador de 3' para evitar la amplificación de los cebadores biotinilados en PCRs posteriores. Además, al diseñar estos oligos, evita cualquier solapamiento con cebadores PCR1 para evitar la competencia durante la amplificación. Además, el análisis bioinformático requiere una atención cuidadosa: los patrones de extracción de sgRNA dependen de la columna vertebral del plásmido (por ejemplo, lentiGuide-puro o lentiCRISPR v2), y la rigurosidad de alineación puede variar desde coincidencias exactas hasta cierta tolerancia a discrepancias. Además, dado que este protocolo incluye un paso de digestión, algunos sgRNAs que contienen sitios de restricción pueden perderse, lo que requiere ajuste de la biblioteca de referencia.

En este estudio, proponemos un protocolo optimizado de preparación de la biblioteca de cribado CRISPR que enriquece fragmentos que contienen sgRNA mediante la digestión y, más importante aún, mediante un paso de pulldown. La digestión enzimática de restricción ya se ha sugerido anteriormente como una estrategia para reducir la entrada de gDNA y enriquecer para casetes desgRNA 27. De manera similar, las sondas biotiniladas se han aplicado ampliamente en biología molecular para capturar ácidos nucleicos específicos o complejos proteína-ácidonucleico 28,29,30,31.

Nuestro protocolo se basa en estos principios y los adapta para el cribado CRISPR en células CAR T primarias, aunque deben reconocerse varias limitaciones. Primero, las células T CAR primarias imponen restricciones en la escala de cribado, ya que su capacidad de expansión es limitada. Para mantener una cobertura adecuada y una representación del ARNsg, se requieren un gran número de células iniciales. Cuando esto no es factible, se pueden usar bibliotecas personalizadas máspequeñas 12, aunque esto reduce la amplitud de la interrogación genética. La variabilidad biológica es otro desafío; Se esperan diferencias entre donantes, y la superposición de coincidencias significativas suele sermodesta de 17. En segundo lugar, la estrategia de enriquecimiento se basa en la presencia y posición de los sitios de corte de enzimas de restricción. En casos raros, estos sitios pueden aparecer dentro de secuencias de sgRNA, lo que resulta más problemático para bibliotecas pequeñas con redundancia limitada. Sin embargo, la mayoría de las bibliotecas, especialmente los diseños genómicos a nivel general, incluyen múltiples sgRNAs por objetivo, minimizando el impacto global de la pérdida de la guía. Finalmente, estrategias alternativas de enriquecimiento basadas en fragmentación, como la sonicación acoplada a la capturade sonda 24, pueden ofrecer cierta flexibilidad en casos donde la digestión enzimática de restricción no sea adecuada.

En conjunto, el casete de sgRNA representa una fracción diminuta del ADN genómico total en las células editadas por CRISPR, lo que hace que un enriquecimiento eficiente sea fundamental para la preparación exitosa de la biblioteca. En comparación con los protocolos estándar, nuestro flujo de trabajo optimizado reduce la transferencia de ADNGG y favorece la amplificación por PCR del sgRNA de interés. Aunque la combinación de fragmentación de ADNGG y pulldown de sonda biotinilada con perlas de estreptavidina no es conceptualmente nueva, su integración en el cribado CRISPR evita errores comunes en PCR y aumenta la reproducibilidad del cribado CRISPR. Además, incorporar métricas estandarizadas de control de calidad en cada paso clave (como la pureza de las células T post-clasificación, la proporción de células resistentes a la puromicina, la integridad del ADNG y la eficiencia de la transducción CAR) mejoraría aún más la robustez y reproducibilidad del flujo de trabajo. En conclusión, aunque se desarrolló en el contexto de células T CAR primarias y con solo dos donantes (lo que puede representar una limitación, aunque se utilizaron varias muestras de cada donante), este protocolo optimizado podría ser ampliamente aplicable a otros cribados CRISPR y flujos de trabajo NGS con grandes retenciones de ADNG.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por el proyecto PID2022-137914OB-I00 financiado por MICIU/AEI /10.13039/501100011033 y por FEDER, UE. Este estudio fue apoyado por el Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) a través de Red de Terapias Avanzadas, TERAV y TERAV+ (RD21/0017/0009 y RD24/0014/0010) y a través del Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer CIBERONC (CB16/12/00489). Este estudio contó con el apoyo del Gobierno de Navarra Salud (GN2023/08 y GN2024/04) y Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 y 0011-1411-2023-000074). La Figura 1B y la Figura 2A se crearon con BioRender.com

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4200 TapeStationAgilentG2991A
Naranja acridinaInvitrogenA1301
AMPure XP Beckman CoulterA63881
Separador NEO autoMACSMiltenyi130-120-327Clasificador de celdas magnéticas de alta velocidad
Oligos biotiniladosIDT
BSASigmaA9647
Contador de celolas fluorescentes K2RevvityCMT-K2-MX-150Contador de células fluorescentes
Cámaras de conteo CHT4RevvityCHT4-SD100-002
Nanoperlas CD4 de CytoSinctGenScriptL00863-1
Nanoperlas CD8 de CytoSinctGenScriptL00864-1
dNTPAgilent200418-51
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen11206D
Imán DynaMag-2Invitrogen12321D
EDTA 0,5 M pH 8,0Invitrogen15575-038
EtanolMerck1,00,98,31,000
Electroporador ExPERT ATXMaxCyteExPERT ATx
Ficoll-PaqueCytiva17544203
Filtropur S 0.2 y micro; mSarstedt83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
Herculase Buffer 5XAgilent600675-52Búfer 5X
Enzima de fusión Herculasa IIAgilent600679-51ADN polimerasa
IL-15Miltenyi130-095-765
IL-7Miltenyi130-095-362
Mastercycler X50aEppendorf6313HG006059
Buffer de electroporación MaxCyteCytivaEPB1
NdeINew England BiolabsR0111L
Tejido nucleoespínMacherey-Nagel74,09,52,250
PBSGibco14190-094
PolybreneMerckTR-1003-6
PrimersThermoFisher
Propendio yodoSigmaP4864
PspXINew England BiolabsR0656S
PuromicinaGibcoA11138-03
Fluorómetro Qubit 3.0InvitrogenP33216
Ensayo de ADN de qubit HSInvitrogenP32851
Conjunto de procesamiento de pozo estéril R-50x3MaxCyteLM243882
Células T TransAct humanosMiltenyi130-111-160Reactivo de estimulación de células T
Estación de cinta HSD1000Agilent5067-5585
TEXMACSMiltenyi130-097-196Medio de crecimiento de células T
Tris Buffer, 1,0 M, pH 8,0, grado de biología molecularEMD Milipore648314
Agua, para biología molecular, DNAsa, RNAsa y proteasa libresThermoScientific327390010

Referencias

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  1. Brudno, J. N., Maus, M. V., Hinrichs, C. S. CAR T cells and T-cell therapies for cancer: A translational science review. JAMA. 332 (22), 1924-1935 (2024).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: What we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Cui, K., et al. The challenges and progress of CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Mol Cell Biochem. 480 (10), 5345-5367 (2025).
  4. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  5. Redondo-Frutos, R. A., et al. Genetic engineering in CAR T cells for solid tumors: Current state, barriers and future developments. Hum Gene Ther. 36 (17-18), 1138-1153 (2025).
  6. Bock, C., et al. High-content CRISPR screening. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-23 (2022).
  7. Shang, W., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies FAM49B as a key regulator of actin dynamics and T cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), E4051-E4060 (2018).
  8. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  9. Chen, Z., et al. In vivo CD8+ T cell CRISPR screening reveals control by Fli1 in infection and cancer. Cell. 184 (5), 1262-1280.e22 (2021).
  10. Belk, J. A., et al. Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  11. Henriksson, J., et al. Genome-wide CRISPR screens in T helper cells reveal pervasive crosstalk between activation and differentiation. Cell. 176 (4), 882-896.e18 (2019).
  12. Gurusamy, D., et al. Multi-phenotype CRISPR-Cas9 screen identifies p38 kinase as a target for adoptive immunotherapies. Cancer Cell. 37 (6), 818-833.e9 (2020).
  13. Wei, J., et al. Targeting REGNASE-1 programs long-lived effector T cells for cancer therapy. Nature. 576 (7787), 471-476 (2019).
  14. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  15. Legut, M., et al. A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation. Nature. 603 (7902), 728-735 (2022).
  16. Ye, L., et al. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8 T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metab. 34 (4), 595-614.e14 (2022).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Yukl, S. A., Kaiser, P., Kim, P., Li, P., Wong, J. K. Advantages of using the QIAshredder instead of restriction digestion to prepare DNA for droplet digital PCR. BioTechniques. 56 (4), 194(2014).
  19. Latham, S., Hughes, E., Budgen, B., Morley, A. Inhibition of the PCR by genomic DNA. PLoS One. 18 (4), e0284538(2023).
  20. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Wälder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47 (19), 5336-5353 (2008).
  21. Sasaki, Y., Miyoshi, D., Sugimoto, N. Effect of molecular crowding on DNA polymerase activity. Biotechnol J. 1 (4), 440-446 (2006).
  22. Seitz, V., Schaper, S., Dröge, A., Lenze, D., Hummel, M., Hennig, S. A new method to prevent carryover contaminations in two-step PCR NGS library preparations. Nucleic Acids Res. 43 (20), e135(2015).
  23. Giuffre, A., et al. Overview of the Agilent Technologies SureSelectTM target enrichment system. J Biomol Tech. 22 (Suppl), S30(2011).
  24. Chen, R., Im, H., Snyder, M. Whole-exome enrichment with the Roche NimbleGen SeqCap EZ Exome Library SR platform. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 634-641 (2015).
  25. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  26. Rodriguez-Marquez, P., et al. density influences antitumoral efficacy of BCMA CAR T cells and correlates with clinical outcome. Sci Adv. 8 (39), 514(2022).
  27. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  28. Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based pulldown assay to validate mRNA targets of cellular miRNAs. J Vis Exp. (136), e57786(2018).
  29. Tsuji, Y. Optimization of biotinylated RNA or DNA pulldown assays for detection of binding proteins: Examples of IRP1, IRP2, HuR, AUF1, and Nrf2. Int J Mol Sci. 24 (4), 3604(2023).
  30. Sui, H., Chen, Q., Imamichi, T. A pulldown assay using DNA/RNA-conjugated beads with a customized competition strategy: An effective approach to identify DNA/RNA binding proteins. MethodsX. 7, 100890(2020).
  31. Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. Promoter pulldown assay: A biochemical screen for DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 2346, 165-172 (2021).

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