¿Es fiable la resistencia a la teicoplanina detectada por el sistema automatizado en cepas de Staphylococcus spp?

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para evaluar la fiabilidad de un sistema automatizado (VITEK 2) para determinar la susceptibilidad a la teicoplanina en aislados de Staphylococcus mediante la comparación con la microdilución de caldo (DMO), con aplicaciones para confirmar la resistencia y guiar la terapia antimicrobiana adecuada.

Resumen

En este estudio se incluyeron un total de 467 aislados de Staphylococcus aureus (S. aureus) y 66 de Staphylococcus coagulas-negativo (CoNS) recogidos entre junio de 2022 y diciembre de 2024. Se realizó una prueba de susceptibilidad a Teicoplanina utilizando el sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, microdilución de caldo (DMO) y un método de prueba de gradiente. Se detectó resistencia a la meticilina en el 71,7% de los aislados de S. aureus y en todos los aislados de CoNS. En este estudio, 13 aislados de S. aureus y 4 aislados de CoNS fueron identificados como resistentes a la teicoplanina mediante un sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad. Los 13 aislados de S. aureus resultaron susceptibles a la teicoplanina tanto en la prueba de gradiente como en la DMO. Los cuatro aislados de CoNS fueron identificados como susceptibles mediante la prueba de gradiente, mientras que la DMO clasificó dos aislados como susceptibles y dos como resistentes. La resistencia a Teicoplanina se detectó en cuatro cepas [S. capitis (n = 1) y S. haemolyticus (n = 3)] entre los aislados de CoNS por DMO. Las cuatro cepas de CoNS resistentes a la teicoplanina identificadas por la DMO se aislaron a partir de hemocultivos; tres se obtuvieron de pacientes pediátricos y uno de un paciente adulto. En general, la tasa de S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) fue relativamente alta en el estudio, y todos los aislados de CoNS eran resistentes a la meticilina. Además, se comprobó que los sistemas automatizados no son fiables para determinar la resistencia a la teicoplanina, y los aislados identificados como resistentes deben ser confirmados por la DMO. Dado que la teicoplanina es un antibiótico de último recurso utilizado para tratar patógenos como el MRSA y la CoNS resistente a la meticilina, su susceptibilidad debe ser controlada de cerca.

Introducción

Staphylococcus aureus (S. aureus) es una de las especies de Staphylococcus más clínicamente significativas debido a su amplia gama de factores de virulencia y su capacidad para causar infecciones graves en diversos tejidos y órganos. Es responsable de infecciones de piel y tejidos blandos, infecciones de tejidos profundos, infecciones del tracto respiratorio, infecciones urinarias e infecciones del torrente sanguíneo, y sigue siendo uno de los patógenos más importantes en entornos^{hospitalarios 1,2}. En particular, el S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) es una de las principales causas de infecciones asociadas a la atención sanitaria en todo el mundo y sigue siendo una de las principales causas de infecciones postoperatorias^{de heridas 2,3}. Los estafilococos coagulasas negativos (CoNS), aunque forman parte de la flora cutánea normal, se han visto cada vez más implicados en infecciones locales y sistémicas en los últimos años. Este aumento ha llevado a pruebas de susceptibilidad antimicrobiana más frecuentes y, en consecuencia, a una mayor detección de resistencia a antibióticos glicopeptídicos como la^{teicoplanina 4}.

Dado que las cepas de S. aureus y CoNS suelen mostrar resistencia a los antibióticos β-lactámicos, los antibióticos glicopeptídicos, principalmente vancomicina y teicoplanina, se utilizan ampliamente para el tratamiento de estas infecciones5. El aumento de la prevalencia de patógenos nosocomiales Grampositivos resistentes ha llevado al uso ampliado de glicóptidos, lo que ha contribuido a la disminución de la susceptibilidad bacteriana a estos^{agentes 5,6}. Vancomicina y teicoplanina tienen una eficacia antimicrobiana comparable; Sin embargo, múltiples estudios han demostrado que la teicoplanina se asocia con menos efectos adversos, especialmente una reducción de la^{nefrotoxicidad 7,8}. Por ello, la teicoplanina suele considerarse una alternativa adecuada a la vancomicina en poblaciones específicas de pacientes, incluyendo aquellos con neutropenia, bacteriemia o función renal^{alterada 9,10}.

La determinación rápida y precisa de la susceptibilidad a los glicóptidos es importante debido al uso generalizado de estos agentes en infecciones por Staphylococcus resistentes a la meticilina y al aumento de los informes de cepas resistentes a glicopéptidos¹¹. Existen varios métodos de laboratorio disponibles para evaluar la susceptibilidad a glicóptidos en especies de Staphylococcus, incluyendo la dilución de agar, pruebas de gradiente, microdilución de caldo (BMD) y sistemas automatizados de pruebas de susceptibilidad^{antimicrobiana 5}. Estudios previos han reportado discrepancias entre sistemas automatizados y métodos de referencia en la detección de una susceptibilidad o resistencia reducida a glicóptidos, especialmente teicoplanina, en la especie Staphylococcus ^4,11.

El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la fiabilidad del sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana para determinar la susceptibilidad a la teicoplanina en aislados de Staphylococcus , en comparación con el método de microdilución de caldo, el estándar de referencia. La evaluación de las características de rendimiento del sistema automatizado puede ayudar a los laboratorios clínicos a valorar su idoneidad para la detección rutinaria de susceptibilidad a glicópéptidos en la práctica clínica.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el comité de ética local el 27 de enero de 2025 (número de protocolo: HRU/25.02.03). El estudio se llevó a cabo conforme a los principios de la Declaración de Helsinki.

1. Diseño del estudio

Este estudio retrospectivo evaluó el rendimiento del sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana para determinar la susceptibilidad a la teicoplanina en especies de Staphylococcus , comparando los resultados con el método de referencia de microdilución del caldo (DMO) y un método de prueba de gradiente.

2. Selección de aislamiento

1. Colección de aislados clínicos
   1. Incluye un total de 467 aislados de S. aureus y 66 de Staphylococcus (CoNS) coagulasa negativos obtenidos de diversas muestras clínicas entre junio de 2022 y diciembre de 2024.
   2. Procesar todas las muestras clínicas según procedimientos microbiológicos rutinarios en el laboratorio de diagnóstico.
   3. Incluye solo un aislado por paciente en el análisis. Excluye los aislados repetidos obtenidos de diferentes muestras del mismo paciente.
2. Identificación inicial y cribado
   1. Identificar todos los aislados a nivel de especie utilizando espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS).
   2. Prueba de S. aureus y CoNS aislados para resistencia a la meticilina y susceptibilidad a la teicoplanina utilizando tarjetas VITEK 2 AST-P664 con el sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad.
   3. Registrar los valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) generados por el sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad para su posterior comparación.
3. Almacenamiento aislado y subcultura
   1. Almacenar aislados a −80 °C en caldo de soja tríptico suplementado con un 20% de glicerol tras un sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad.
   2. Antes de las pruebas de referencia, aísla a temperatura ambiente y subcultiva dos veces con agar de sangre de oveja al 5%.
   3. Incubar las placas a 37 °C durante 24 horas tras cada paso para asegurar la pureza y la viabilidad.

3. Pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos

1. Microdilución del caldo (DMO)
   1. Preparación de soluciones de Teicoplanina
      1. Preparar una solución de reserva de polvo de teicoplanina a una concentración de 2560 mg/L en caldo Mueller-Hinton ajustado por cationes (CAMHB).
   2. Procedimiento de microdilución del caldo
      1. Realiza pruebas de microdilución de caldo utilizando microplacas estériles de fondo en U de 96 pozos.
      2. Dispensar 100 μL de CAMHB en cada pozo. Diluye la solución de teicoplanina diez veces más y añade 100 μL al primer pozo.
      3. Preparar diluciones en serie dobles entre los pozos 1 y 10 para obtener concentraciones finales de antibióticos que oscilan entre 64 y 0,125 μg/mL.
      4. Usa el pozo 11 como control del crecimiento que contiene CAMHB y el inoculo bacteriano. Utiliza el pozo 12 como control negativo que contiene solo CAMHB¹².
   3. Preparación e incubación del inoculo
      1. Suspender las colonias bacterianas puras en solución salina estéril y ajustar la suspensión a una turbidez equivalente a un estándar McFarland de 0,5.
      2. Preparar una dilución 1:100 en CAMHB y añadir 100 μL de la suspensión bacteriana a los pozos 1–11 para lograr una concentración final de inoculo de aproximadamente 5 × 10⁵ UFC/mL.
      3. Incubar las microplacas a 37 °C durante 24 horas bajo condiciones atmosféricas^{ambientales 12}.
   4. Determinación e interpretación de la CIM
      1. Define la concentración inhibitoria mínima (CMI) como la concentración más baja de teicoplanina que inhibe completamente el crecimiento bacteriano visible tras la incubación.
      2. Interpretar los valores de CMI según las directrices 14.0 del Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST)^{versión 14.0.}

4. Control de calidad

1. Utilice Staphylococcus aureus ATCC 29213, con un rango de referencia de microrganismos de teicoplanina de 0,25–1 mg/L, como cepa de control de calidad.

5. Análisis estadístico

1. Comparación de métodos
   1. Comparar los resultados de la CIM de teicoplanina obtenidos mediante el sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad con los obtenidos mediante el método de referencia BMD.
   2. Defina la concordancia categórica (AC) como resultados concordantes susceptibles o resistentes entre ambos métodos.
2. Clasificación de errores
   1. Definir los errores muy graves (VME) como aislados categorizados como susceptibles por el sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad pero resistentes por la DMO.
   2. Definan los errores mayores (ME) como aislados categorizados como resistentes por el sistema automatizado de pruebas de susceptibilidad pero susceptibles por DMO.
3. Criterios de rendimiento
   1. Considere aceptable el rendimiento del método cuando el acuerdo categórico es del ≥90% y las tasas de EMV y ME son ≤3%, de acuerdo con los criterios de evaluación^{publicados 14,15}.

Resultados

En total se incluyeron 533 aislados recuperados de muestras clínicas durante un periodo de 2,5 años en el análisis. Todos los aislados de CoNS resistentes a la meticilina (MR-CoNS) y el 71,7% de los aislados de S. aureus resultaron ser resistentes a la meticilina. Las muestras de hisopo de heridas fueron las muestras clínicas más comunes que arrojaron aislamientos de S. aureus , mientras que los aislados de MR-CoNS se recuperaron con mayor frecuencia de hemocultivos (

Discusión

La resistencia antimicrobiana es una de las amenazas más significativas para la salud pública global, contribuyendo al aumento de los costes sanitarios, al fracaso del tratamiento y a la^{mortalidad 3}. La incidencia de infecciones adquiridas tanto en la comunidad como en el hospital causadas por Staphylococcus aureus sigue aumentando a nivel nacional y global. La resistencia a la meticilina, en particular, se asocia con un aumento de la morbilidad y mortali...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo Mueller Hinton ajustado por cationes	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania	CM0405B	Para el crecimiento bacteriano en el método de microdilución del caldo
MALDI-TOF MS	VITEK MS, BioMé rieux, Francia	410893	Para la identificación bacteriana
Estándar McFarland	bioMé rieux, Francia	95060-958	Estandarización del inoculo bacteriano
Placas de Petri	RTA, Tü Rkiye	2102	Para la preparación del medio y el cultivo bacteriano
Punta de pipette 20 - 200 y mu; L	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania	Z740105	Para la distribución de Mueller y dash ajustados por catión; Caldo Hinton (CAMHB) en microplacas U-bottom y preparación de diluciones en serie
Agar de sangre de oveja	RTA, Tü Rkiye	2001	Aislamiento y cultivo de microorganismos
Staphylococcus aureus	Colección de Cultura de Tipo Americano	29213	Cepa de referencia utilizada en este estudio
Polvo de teicoplanina	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania	T0578	Antibióticos
Caldo de soja tríptico	Merck, Alemania	1,054,590,500	Aislamiento y cultivo de microorganismos
Placa del pozo inferior en U	Thermo Fisher Scientific	163320	Para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana mediante el método de microdilución del caldo
VITEK 2 tarjetas AST-P664	bioMé rieux, Francia	414197	Para pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos
VITEK2 Compact	bioMé rieux, Francia	4700030	Para pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos