Artículo de investigación
* These authors contributed equally
Este protocolo permite la integración de secuenciación de nueva generación e inmunofluorescencia multicolor para perfilar adenocarcinomas pulmonares. Su objetivo es analizar la relación entre la heterogeneidad genómica y la densidad de células inmunitarias infiltradoras en tumores. Este enfoque multidimensional facilita una evaluación integral del microambiente tumoral para la evaluación pronóstica postoperatoria.
El pronóstico del adenocarcinoma pulmonar (LUAD) se evalúa tradicionalmente mediante la estadificación tumor-ganglio de metástasis (TNM), que no tiene en cuenta el estado inmunitario del paciente. Este protocolo integra el perfilado genómico y el análisis del microambiente inmunitario para facilitar una evaluación pronóstica postoperatoria más completa. El método implica un análisis retrospectivo de tejidos tumorales incrustados en parafina utilizando dos técnicas principales. En primer lugar, la secuenciación de nueva generación (NGS) se realiza con un panel personalizado de 37 genes para identificar mutaciones en genes conductores y variantes de importancia incierta. En segundo lugar, se utiliza inmunofluorescencia multiplex (mIF) para dirigirse a marcadores como HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 y PanCK. Esto permite cuantificar la distribución espacial y la densidad de subpoblaciones específicas de células inmunitarias en diversas regiones tumorales. Este enfoque integrado permite la evaluación simultánea de la heterogeneidad genómica y de las características de las células inmunitarias infiltradoras en tumores. Los datos resultantes identifican combinaciones específicas de perfiles mutacionales—como el estado EGFR —y densidades celulares inmunitarias. Estas combinaciones integradas permiten estudiar su impacto colectivo en la supervivencia del paciente, ofreciendo un enfoque prometedor para el desarrollo de futuros modelos pronósticos del cáncer de pulmón. Este protocolo demuestra un método robusto para caracterizar las complejas características biológicas del microambiente tumoral LUAD.
El LUAD es el subtipo de cáncer de pulmón más prevalente, aunque la tasa media de supervivencia a 5 años sigue siendo baja, aproximadamente en el 15%. La evaluación pronóstica actual se basa principalmente en el sistema de estadajamiento TNM; sin embargo, este método a menudo pasa por alto el estado inmunitario general del paciente, lo que puede limitar su precisión predictiva. La evidencia sugiere que tanto la heterogeneidad genómica como el microambiente tumoral (TME) desempeñan un papel crítico en la tumorigénesis y progresión de la enfermedadde LUAD 2,3.
En los últimos años, la transición de la secuenciación tradicional de Sanger a la NGS dirigida ha permitido el análisis simultáneo y de alta sensibilidad de múltiples genes conductores, como EGFR, TP53 y KRAS 4,5. Aunque NGS proporciona un mapa de alta resolución de alteraciones genéticas, los datos genómicos por sí solos no pueden capturar las complejas interacciones celulares y la organización espacial dentro del TME.
Para abordar estas complejidades, el mIF ofrece ventajas significativas frente a los métodos tradicionales de perfilado inmunitario. Mientras que la inmunohistoquímica de un solo plexo (IHC) está restringida a un marcador por sección, el mIF permite la detección simultánea de múltiples marcadores proteicos mientras se preserva la arquitectura espacial del tejido. A diferencia de la IHC secuencial, que puede causar degradación tisular, o la citometría de flujo y la secuenciación de ARN a granel, que resultan en la pérdida de localización espacial y resolución de célulaúnica 6,7,8, el mIF combinado con la anotación por regiones espaciales permite una caracterización in situ y multiparámetro del paisaje inmune 9.
Este protocolo establece un flujo de trabajo combinado que integra NGS dirigido, mFI y evaluación de regiones espaciales (que abarca todo el tejido, el límite tumoral y el núcleo tumoral). Este enfoque multidimensional es necesario para investigar la interacción entre las alteraciones genómicas y la densidad celular inmunitaria, una relación que los enfoques monomodales a menudo no logran capturar. Al evaluar estas características integradas, este protocolo proporciona una estrategia complementaria para caracterizar las características biológicas de LUAD y ofrece un marco más robusto para la estratificación pronóstica postoperatoria.
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Este estudio retrospectivo fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Yan'an de Kunming (Aprobación nº 2021-140-01). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes.
Diseño del estudio y recogida de muestras
Se incluyó una cohorte de 63 pacientes con LUAD confirmada patológica o histológicamente que se sometieron a resección quirúrgica entre 2015 y 2021. Los criterios de exclusión incluyeron la recepción de quimioterapia neoadyuvante, radioterapia o inmunoterapia antes de la cirugía. Además, se excluyeron del análisis pacientes con malignidades concurrentes, comorbilidades graves, mala calidad tisular o registros clínicos incompletos. Los bloques tumorales incrustados con parafina fijada en formalina (FFPE) se procesaron en secciones de 1 mm para la deparafinización. Como se ilustra en el flujo de trabajo (Figura 1), estas muestras fueron sometidas a un análisis integrado utilizando mIF y NGS dirigido. Este enfoque combinado permite la evaluación simultánea de alteraciones genómicas y características del microambiente inmunitario, proporcionando un marco multidimensional para caracterizar la biología tumoral.
Seguimiento
Los fármacos dirigidos al paciente, la inmunoterapia y la progresión o muerte de la enfermedad se hicieron seguimiento telefónico, y se obtuvo información detallada sobre el estado de supervivencia de los pacientes, progresión o recurrencia de la enfermedad, tratamientos adyuvantes recibidos tras la cirugía y cualquier comorbilidad recién diagnosticada. El periodo de seguimiento terminó en julio de 2023, y el punto final de observación fue la progresión o muerte de la enfermedad. La supervivencia global se definía como el tiempo desde el inicio de la cirugía hasta la muerte del paciente. No se perdieron pacientes en el seguimiento. El tiempo mínimo de seguimiento fue de 21 meses.
Preparación y secuenciación de bibliotecas NGS
Extracción de ADN de secciones de tejido FFPE
Obtener secciones de tejido FFPE (3–10 μm de espesor) de muestras patológicas. Coloca secciones en tubos estériles de microcentrífuga. Añade xileno a cada tubo e incuba durante 5–10 minutos a temperatura ambiente para eliminar la parafina. Centrifuga a 12.000 x g durante 5 minutos y descarta cuidadosamente el sobrenadante. Repite el tratamiento con xileno 1 vez para asegurar una deparafinización completa. Lava el pellet secuencialmente con etanol al 100% dos veces para eliminar el xileno residual. Seca el pellet al aire a temperatura ambiente hasta que el etanol residual se haya evaporado por completo. Añadir el tampón de lisis y la proteinasa K adecuados (proporcionados en el kit de extracción de ADN) e incubar a 56 °C durante 1–3 horas (o durante la noche si es necesario) hasta que el tejido esté completamente lisado. Realizar una incubación adicional a 90 °C durante 1 hora para revertir la reticulación de formalina. Extrae ADN genómico utilizando un kit comercial de extracción de ADN FFPE (véase Tabla de Materiales) según las instrucciones del fabricante. La calidad del ADN de las muestras de FFPE suele estar fragmentada; por lo tanto, la calidad del ADN debe cumplir con umbrales mínimos de integridad (por ejemplo, DIN ≥ 5) para garantizar una preparación exitosa de la biblioteca para NGS dirigido.
Cuantificación y normalización del ADN
Cuantifique el ADN utilizando un método fluorométrico para asegurar una medición precisa de concentraciones. Normalizar las muestras de ADN hasta una concentración final de aproximadamente 5–10 ng/μL usando tampón Tris-HCl (pH 8,5). Realizar los pasos de dilución gradualmente si es necesario para asegurar la precisión y estabilidad de la concentración de ADN.
Preparación de la biblioteca y enriquecimiento de objetivos
Preparar bibliotecas de secuenciación utilizando NGS dirigida basada en captura híbrida sobre ADN extraído del tejidoFFPE 10. Realizar el enriquecimiento de la diana utilizando un panel de sonda personalizado que cubre regiones exónicas de genes seleccionados asociados al desarrollo tumoral. Evaluar la calidad de la biblioteca y la distribución del tamaño de los fragmentos utilizando métodos estándar (por ejemplo, sistemas basados en electroforesis), si es necesario.
Agrupación de bibliotecas y secuenciación
Cuantifica cada biblioteca usando un ensayo fluorométrico. Agrupar bibliotecas en concentraciones equimolares según los requisitos del kit de secuenciación. Carga las bibliotecas agrupadas en la plataforma de secuenciación Illumina y realiza la secuenciación con un patrón de secuenciación de extremo par de 150 bp.
Procesamiento de datos y detección de variantes
Las lecturas de secuenciación en bruto se procesaron utilizando pipelines estándar de bioinformática, incluyendo recorte de adaptadores, filtrado de calidad y alineación con el genoma de referencia humano (GRCh37/hg19). Las métricas de control de calidad fueron las siguientes: Q20 > 85%, profundidad media de secuenciación > 2500x, tasa de respuesta al objetivo > 65% y penalización base de Fold 80 ≤ 2. Control de calidad y alineación: Los datos FASTQ en bruto pasaron por control de calidad usando FastQC y Trim Galore (o Trimmomatic) para eliminar la contaminación de adaptadores y secuencias de baja calidad. Las lecturas limpias se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh37 (hg19) utilizando el alineador Burrows-Wheeler (BWA). Procesamiento posterior a la alineación: Se realizaron clasificaciones, marcado duplicado y recalibración de puntuaciones de calidad base (BQSR) usando Picard y el Kit de Herramientas de Análisis Genómico (GATK) para minimizar llamadas falsas positivas. Variante de denominación: Se detectaron polimorfismos de un solo nucleótido de línea germinal (SNPs) e InDels usando BWA MEM (0.7.16a - r1181). Los SNVs somáticos e InDels se identificaron mediante un enfoque consensuado usando Mutect2 y VarScan2. Las mutaciones de baja frecuencia se evaluaron más a fondo utilizando el modelo estadístico de Freebayes (v 1.3.2). Anotación y filtrado: Las variantes se anotaron usando ANNOVAR, integrando datos de gnomAD, ClinVar y COSMIC. Las variantes germinales se distinguieron de las mutaciones somáticas filtrando SNPs poblacionales de alta frecuencia y evaluando las frecuencias alelares variantes (VAF). Umbrales de AFA: Se utilizó un corte de AFA del ≥5% para eventos clonales (por ejemplo, ROS1 y ALK), mientras que se aplicó un umbral del 1% a mutaciones génicas (por ejemplo, EGFR) para asegurar la detección de alteraciones de baja frecuencia, lo cual fue posible gracias a la alta profundidad media de secuenciación de >500x. Las mutaciones germinales se distinguieron de las somáticas utilizando los datos del Proyecto 1000 Genomas (1000G) y una base de datos local de individuos han chinos sanos establecida en nuestro laboratorio. La evaluación de la patogenicidad de las variantes somáticas detectadas se realizó según el marco AMP/ASCO/CAP 11, que refina la clasificación de la evidencia para variantes somáticas mediante un enfoque escalonado y basado en la evidencia. Se mantienen variantes patógenas/probablemente patógenas (P/LP), y su clasificación se basa en criterios de Nivel I/II que requieren evidencia A/B (aprobación de la FDA, ensayos clínicos) o C/D (estudios preclínicos/de caso) para su clasificación. El Nivel III (VUS) carece de evidencia concluyente, mientras que el Nivel IV indica variantes benignas a través de la frecuencia poblacional (por ejemplo, gnomAD) o estudios funcionales; Estas mutaciones quedan excluidas de análisis posteriores. Se realizó la evaluación de la patogenicidad de las variantes germinales detectadas según las directrices ACMG/AMP 12. En este estudio se registraron variantes de patógeno (P), probable patógeno (PL) y significado incierto (VUS). Solo se incluyeron variantes de alta confianza que superaban criterios de control de calidad en los análisis posteriores (CAL ≥1; profundidad de cobertura >10 para mutación germinal y profundidad de cobertura >500x para mutación somática)
Preparación de muestras a partir de tejido FFPE
Preparación de secciones de parafina
Corta bloques de tejido FFPE en secciones de 3 μm de grosor usando un microtomo. Flota secciones en un baño maria a 40–45 °C para aplanar el tejido. Monta secciones sobre portaobjetos adhesivos de microscopio y seca a temperatura ambiente. Coloque las láminas en un horno de secado a 65 °C durante 1 hora para asegurar una adherencia firme de las secciones de tejido a las láminas y para derretir el exceso de parafina.
Deparafinización y rehidratación
Coloca las láminas en una rejilla de tinte y sumérgelas en la solución de despejamiento I durante 5 minutos. Transfiere las láminas secuencialmente a la solución de limpieza II y la solución de limpieza III, 5 minutos cada una, para disolver completamente la parafina. Transfiere las láminas a etanol al 100% durante 3 minutos para eliminar el reactivo residual de aclear. Rehidratar secciones de tejido mediante una serie graduada de etanol: 95% etanol durante 3 minutos y 80% etanol durante 3 minutos. Enjuaga 2 veces en agua destilada, dejando 3 minutos entre lavados. El xileno y el etanol utilizados durante la parafinización se manipularon en una campana extractora química debido a su volatilidad y toxicidad. Todas las soluciones de residuos que contenían disolventes orgánicos se recogieron por separado y se eliminaron según las directrices institucionales de eliminación de residuos peligrosos.
Partición de tinción HE
Tinción por hematoxilina y eosina
Sumergir las láminas tras la deparafinización y rehidratación en una solución de hematoxilina durante 5–10 minutos a temperatura ambiente. Enjuaga los deslizamientos bajo agua del grifo corriendo durante 5 minutos. Diferencia las láminas en alcohol de ácido clorhídrico al 1% durante unos segundos (3–10 s). Enjuaga inmediatamente con agua del grifo corriente. Núcleos azules sumergiendo los portaobjetos en agua del grifo o solución azulada durante 5 minutos. Sumerge las láminas en solución de eosina durante 1–3 minutos a temperatura ambiente. Enjuaga brevemente con agua destilada si es necesario.
Deshidratación y limpieza
El deshidratado pasa por etanol clasificado: etanol al 80% durante 1 minuto; 95% etanol durante 1 minuto, y 100% etanol 2 veces durante 1 minuto. Desliza las láminas en xileno I–II, 2–5 minutos cada una.
Montaje
Aplica una gota de bálsamo neutro. Coloca cuidadosamente una cubierta para evitar burbujas de aire. Deja que las láminas se sequen a temperatura ambiente antes de hacer la imagen.
Tinción por inmunofluorescencia multiplex de secciones de tejido FFPE
Se realizó tinción multifluorescencia secuencial para detectar múltiples marcadores inmunes y tumorales en la misma sección de tejido. Este enfoque permite la visualización in situ de diversas poblaciones celulares preservando el contextoespacial 13. Recuperación de antígenos: Llena un tarro de tinción con un buffer de recuperación de antígenos. Coloca el tarro en un microondas y calienta a alta potencia durante 3-5 minutos hasta que la solución empiece a hervir. Transfiere cuidadosamente las láminas tras la deparafinización y rehidratación al buffer de extracción calentado, asegurando que las secciones de tejido estén completamente sumergidas. El calor se desliza a baja potencia de microondas durante 15 minutos para permitir un desenmascaramiento eficiente de antígenos. Después de calentar, deja que los portaobjetos se enfríen de forma natural a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiere las láminas a agua con hielo durante 5 minutos para detener el proceso de extracción de antígenos.
Lavado y preparación de barreras hidrofóbicas
Enjuaga las láminas 1 vez con agua destilada para eliminar el tampón residual de recuperación. Utiliza un bolígrafo barrera hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor de cada sección de tejido. Enjuaga de nuevo brevemente con agua destilada. Lavado las láminas 2 veces con el buffer TBST. Después de cada lavado, coloca los deslizadores horizontalmente durante 3 minutos para asegurar la eliminación completa del buffer.
Bloqueo
Aplica un tampón bloqueante para cubrir completamente la sección del tejido (~100 μL por diapositivas). Incuba las láminas en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Incubación primaria de anticuerpos
Elimina el buffer bloqueador dando golpecitos suaves sobre el borde de la corredera sobre papel absorbente. Se aplicaron anticuerpos primarios contra HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 y PanCK con diluciones de trabajo optimizadas que iban de 1:100 a 1:400. Aplicar ~100 μL de solución primaria diluida de anticuerpos en cada sección del tejido. Incubar las láminas en una cámara humidificada: 37 °C durante 1 hora, o 4 °C durante la noche para aumentar la sensibilidad.
Lavado
Lavado las llaves 3 veces con el tampón TBST, 3 minutos cada lavado. Coloca los deslizadores horizontalmente después de cada lavado para permitir el drenaje del tampón.
Incubación secundaria de anticuerpos
Prepara la solución secundaria de anticuerpos diluyendo 1:3 en el tampón TBST. Aplicar aproximadamente 100 μL de solución secundaria de anticuerpos a cada lámina. Incubar las láminas a 37 °C durante 10 minutos en una cámara humidificada. Lava las láminas 3 veces con TBST, 3 minutos cada lavado.
Amplificación de señales fluorescentes
Diluye el reactivo de amplificación fluorescente 1:100 en el buffer de amplificación. Aplica 100 μL de reactivo diluido a cada portaobjetos. Incuba las láminas a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad para evitar el fotoblanqueamiento. Lava las láminas 3 veces con TBST, 3 minutos cada lavado.
Recuperación de antígenos entre marcadores
Realizar la extracción de antígenos por microondas según lo descrito. Después de calentar, se enfría en las diapositivas secuenciales: 5 minutos en agua tibia y 5 minutos en agua con hielo.
Tinción secuencial de marcadores adicionales
Repita los pasos de incubación primaria y secundaria de anticuerpos para cada marcador adicional de anticuerpos. Asegúrate de que la extracción de antígenos se realice tras teñir cada marcador antes de pasar al siguiente anticuerpo.
Contratinción nuclear
Lava las láminas 1 vez con el buffer TBST. Aplica tinte nuclear DAPI. Incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad. Lava las láminas 3 veces con agua destilada. Determinación del punto final: Los núcleos deben aparecer claramente teñidos bajo microscopía de fluorescencia.
Tinción final solo con marcador
Aplica solución de biotina diluida 1:200 en tampón de amplificación, incuba 10 minutos a temperatura ambiente. Lava las llajes 3 veces con el buffer TBST. Realizar la extracción de antígenos según lo descrito. Lava las llajes 3 veces con el buffer TBST. Aplica un reactivo endógeno bloqueador de biotina e incuba a 37 °C durante 30 minutos. Aplica tinte 1:100 en TBST y incuba 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lava los deslizadores 1 vez con TBST y deja drenar 3 minutos.
Montaje
Añade una gota de medio antidescolorante sobre la sección de tejido. Coloca cuidadosamente una cubierta sobre el tobogán. Deja que las láminas se sequen antes de hacer la imagen.
Adquisición de imágenes de las secciones H&E y mIF
Se obtuvieron imágenes de portaobjetos completos (WSI) de secciones de tejido teñido con H&E y mIF utilizando un escáner de portaobjetos. Se realizó un escaneo de campo claro para secciones H&E, mientras que para secciones mIF se utilizó escaneo de fluorescencia. Objetivo: aumento de 20x para escaneo general; Aumento de 40x para imagen regional de alta resolución. Ajustes de excitación y emisión: Optimizados para cada fluoróforo según las especificaciones del fabricante. Tiempo y ganancia de exposición: Ajustados automáticamente por software de imagen para asegurar una intensidad de señal adecuada sin saturación.
Control de calidad del mIF y evaluabilidad de imagen
Para garantizar la fiabilidad de los resultados del MFI, se implementó un riguroso protocolo de control de calidad antes de la clasificación tisular y cuantificación celular utilizando el sistema digital de patología HALO. Eliminación de artefactos y definición de área evaluable: Las imágenes de diapositivas completas (WSIs) fueron revisadas meticulosamente para excluir manualmente regiones que contenían pliegues tisulares, artefactos de tinción y señales de fondo no específicas. Este paso era esencial para evitar señales falsos positivas y garantizar la precisión del análisis espacial. Tras este cribado, una media del 80% (rango: 50%–95%) del área tisular en todas las muestras fue designada como la región evaluable de mFI. Verificación y partición patológica: Para delimitar con precisión los compartimentos tumorales y estromales, se cruzaron secciones de FIA con secciones seriadas adyacentes teñidas con H&E. Las anotaciones fueron revisadas de forma independiente por dos patólogos experimentados, resolviendo cualquier discrepancia por consenso. Se excluyeron muestras con un área de tejido tumoral inferior al 30% del estudio para mantener la rigurosidad analítica. Validación posterior a la cuantificación: Tras la fenotipificación y cuantificación celular automatizada, los patólogos reevaluaron la distribución espacial y los patrones de expresión de las subpoblaciones de células inmunitarias. Esta revisión aseguró que los datos cuantitativos digitales fueran consistentes con las características histomorfológicas subyacentes, garantizando así la fiabilidad y precisión de los hallazgos.
Análisis digital de patología y anotación de regiones
Las imágenes panorámicas escaneadas se importaron a la plataforma digital de análisis de imágenes de patología para su procesamiento. El HALO AI Nuclei Seg-Plugin se utilizó para segmentar e identificar células. Usando la tinción H&E como referencia, se anotaron manualmente las siguientes regiones de interés (ROI): Región tumoral total (WSIT); Límite tumoral (TB); Núcleo tumoral (CT). La detección de señales positivas se determinó en base a los umbrales de intensidad de fluorescencia y la localización subcelular esperada de cada marcador. Este enfoque específico por compartimento se aplicó para minimizar la interferencia de fondo y mejorar la precisión de la identificación de células inmunitarias. La densidad celular inmunitaria se cuantificó como el número de células marcadores positivas por región tumoral seleccionada. Alinear las imágenes mIF con las correspondientes anotaciones derivadas de H&E basadas en la morfología tisular. Los pacientes fueron estratificados en grupos de alta y baja densidad según el valor medio de la densidad celular inmunitaria para cada marcador.
Análisis estadístico
Se utilizó el software SPSS 17.0 para el análisis. Los datos normalmente distribuidos se expresaron como media ± desviación estándar, y los datos cuantitativos no distribuidos normalmente se expresaron como mediana (rango cuantilístico del 25%-75%). La correlación entre cada tipo de mutación génica, densidad celular inmunitaria y características clínicas fue analizada mediante el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox utilizando el modelo de líneas vitales de Python. Según el tamaño de la muestra y si los datos se ajustaban a la distribución normal, se utilizó la prueba de Student o la prueba Mann-Whitney U para la comparación entre variables continuas. Se utilizó la prueba de rango de Wilcoxon para la comparación de variables de rango. Se seleccionó la prueba de chi cuadrado o prueba exacta de Fisher para el análisis de variables categóricas no ordenadas según el tamaño de la muestra y la frecuencia teórica. Se utilizó la prueba de Spearman o la prueba de Pearson para el análisis de correlación. La tasa global de supervivencia de los pacientes se obtuvo mediante el método Kaplan-Meier, y se utilizó la prueba de rango logarítmico para las pruebas. Las curvas de supervivencia se dibujaban usando el lenguaje R basado en el software RStudio. Se consideró estadísticamente significativo un valor p <0,10.
Aplicabilidad práctica y limitaciones
Para la implementación fiable de este flujo de trabajo integrado, los bloques de tejido FFPE deben cumplir con estrictos estándares de calidad, incluyendo una celularidad tumoral ideal del ≥30% y la ausencia de necrosis extensa o artefactos tisulares significativos. El éxito técnico del MFI depende en gran medida de la preservación de tejidos; Factores como la sobrefijación, el daño excesivo o la alta autofluorescencia de fondo pueden resultar en una penetración inadecuada de anticuerpos y una intensidad de señal subóptima. Además, deben considerarse varias limitaciones inherentes a este estudio. En primer lugar, el análisis se basa en una cohorte retrospectiva y monocéntrica de 63 pacientes, lo que puede limitar el poder estadístico y la amplia generalización de los hallazgos a otras poblaciones. En segundo lugar, el alcance de la evaluación se restringe a un panel NGS fijo de 37 genes y un conjunto específico de marcadores inmunitarios (HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 y PanCK; Tabla suplementaria 1). Como se señala en las fuentes, aunque este enfoque combinado proporciona un marco más sólido para la estratificación pronóstica, son necesarios estudios prospectivos y multicéntricos de mayor alcance para validar aún más estas asociaciones y refinar la utilidad predictiva de los biomarcadores identificados.
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Características clínicas de los pacientes con adenocarcinoma pulmonar
En este estudio se recogieron un total de 63 pacientes diagnosticados con LUAD y que se sometierona tratamiento quirúrgico en nuestro hospital entre 2015 y 2021 y cumplieron los criterios de inclusión. Las características clínicas de los pacientes incluidos se muestran en la Tabla 1. Entre los pacientes inscritos, la edad mediana era de 60 años (47-73 años), incluyendo 30/6...
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Perfilado inmunológico genómico integrado y espacialmente resuelto de LUAD
Este estudio demuestra un flujo de trabajo integrado que combina NGS dirigido y mIF para caracterizar el paisaje multidimensional de LUAD. Nuestros hallazgos genómicos coinciden con la literatura previa, especialmente en lo que respecta a las variaciones étnicas en la frecuencia de mutaciones. La tasa observada de mutación en EGFR (aproximadamente 40%-60%) es consistente con las frecue...
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Los autores no declaran que existen relaciones comerciales o financieras que puedan interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Plan de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la provincia de Zhejiang (2022KY1237); el Proyecto del Fondo de Investigación Científica del Departamento de Educación de Yunnan (2025Y0387); El Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Yunnan (202403AC100002).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AlphaTSA Multiplex IHC Kit | alphaxbio Technology Co., Ltd. | AXT36025011 | Tinción por inmunofluorescencia multiplex |
| Medio de montaje antifade | Leagene Technology Co., Ltd. | IH0252, Lote 0525A17 | Tinción por inmunofluorescencia multiplex |
| CD163 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0428 | RRID:AB_3714707; Tinción por inmunofluorescencia multiplex |
| CD206 | Abcam, Inc | Cat# 5307-1 | RRID:AB_10896526; Tinción por inmunofluorescencia multiplex |
| CD68 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0060 | RRID:AB_2904190; Tinción por inmunofluorescencia multiplex |
| Panel Personalizado de Genes del Cáncer | TWIST Co., Ltd. | Preparación de la Biblioteca NGS & nbsp; | |
| Buffe de deparafinización | QIAGEN Co., Ltd. | 19093 | Extracción de ADN tinción HE; Tinción por inmunofluorescencia multiplexada a partir de secciones de tejido FFPE |
| Dynabead M-270 estreptavidina | Thermo Co., Ltd. | 65602 | Preparación de la Biblioteca NGS & nbsp; |
| Fluorómetro | ThermoFisher Scientific Co., Ltd. | QUBIT 4.0 | Preparación de la Biblioteca NGS & nbsp; |
| Plataforma digital de análisis de imágenes de patología HALO | Indica Labs, Inc., Albuquerque | Versión 3.6.4134 | Tinción con HE y análisis de tinción inmunofluorescencia multiplex |
| Kit de tinción de hematoxilina-eosina | Wuhan elabscience Technology Co., Ltd. | E-IR-R117 | Mancha HE |
| Kit de ADN HiPure FFPE | Guangzhou Magen Biotechnology Co., Ltd. | D6323 | Extracción de ADN de secciones de tejido FFPE |
| HLA-D&NBSP; | HUABIO Co., Ltd. | ET1610-66 | RRID:AB_3069950; Tinción por inmunofluorescencia multiplex |
| Secuenciador de ADN Illumina | Illumina, Inc | 550DX | Secuenciación |
| Balsámico neutro | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | Mancha HE |
| Panck | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0069 | RRID:AB_2941997; Tinción por inmunofluorescencia multiplex |
| PD-L1 | Sistemas de I&D | Catálogo # AF1019 | RRID:AB_354540; Tinción por inmunofluorescencia multiplex |
| Búfer TBST | abclonla Technology Co., Ltd. | RM00013 | Tinción HE e tinción de inmunofluorescencia multiplexada |
| UN-Blocker | homgen Co., Ltd. | Preparación de la Biblioteca NGS & nbsp; | |
| VAHTS ADN Clean Beads | Vazyme Co., Ltd. | N411 | Preparación de la Biblioteca NGS & nbsp; |
| Kit de preparación de la biblioteca uniersal de ADN VAHTS para illumina | Vazyme Co., Ltd. | ND610 | Preparación de la Biblioteca NGS & nbsp; |
| Sistema de imagen de portaobjetos completos | ZEISS Co., Ltd. | ZEISS AXIOSCAN 7 versión 3.3 | Tinción con HE y análisis de tinción inmunofluorescencia multiplex |
| Kit de hibridación y lavado xGen | IDT Co., Ltd. | 1080577 | Preparación de la Biblioteca NGS & nbsp; |
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