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Artículo de método

Ensayo de blot de punto para detectar niveles globales de modificación del ARN N 6-metiladenosina

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DOI:

10.3791/69860

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6 de febrero de 2026

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para evaluar de forma semicuantitativa los niveles globales de m⁶A usando dot blot. El ARN total se extrae, desnaturaliza, se mancha en una membrana de nylon, se sondea con anticuerpo anti-m⁶A y se visualiza mediante quimioluminiscencia. La intensidad de la señal, cuantificada mediante análisis en escala de grises ImageJ, refleja la abundancia relativa de metilación, proporcionando un flujo de trabajo reproducible para la investigación.

Resumen

La N6-metiladenosina (m⁶A) es la modificación interna más abundante en el ARN mensajero eucariota (ARNm) y actúa como un regulador clave de la expresión génica post-transcripcional. Los métodos para investigar m⁶A pueden aplicarse a múltiples niveles de resolución, incluyendo cuantificación global, detección específica de nucleótidos y análisis de transcritos particulares de interés. Entre ellas, el ensayo dot blot proporciona un enfoque sencillo, rápido y rentable para la evaluación semicuantitativa de los niveles globales de modificación de m⁶A. En este ensayo, primero se procesan las células para extraer ARN total, que luego se diluye y desnaturaliza. Las muestras de ARN se localizan sobre una membrana de nylon, se sondan con un anticuerpo anti-m⁶A y se visualizan mediante quimioluminiscencia, con la intensidad de la señal que indica la abundancia relativa de metilación. Finalmente, la cuantificación y comparación de las intensidades de señal se realiza midiendo valores en escala de grises con ImageJ. En comparación con métodos basados en secuenciación o espectrometría de masas, el dot blot requiere una instrumentación mínima y conocimientos técnicos, lo que lo hace especialmente adecuado para cribado rutinario, estudios funcionales preliminares y análisis comparativos. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo detallado y reproducible para implementar el ensayo blot de puntos m⁶A tanto en aplicaciones de investigación básica como traslacional.

Introducción

La N6-metiladenosina (m⁶A) es la modificación interna más prevalente en el ARN mensajero eucariota (ARNm) y desempeña un papel esencial en la regulación post-transcripcional, incluyendo la estabilidad del ARN, el empalme, la degradación, la traducción y la exportacióndel ARN 1,2,3. La desregulación de la modificación m⁶A ha estado implicada en diversos procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la iniciación, progresión tumoral y metástasis 4,5. En el osteosarcoma, se han observado niveles elevados de m⁶A tanto en líneas celulares como en tejidos, lo que sugiere un papel de la metilación aberrante del ARN en la biología de laenfermedad 6,7. Por ello, la evaluación sistemática de la abundancia global de m⁶A, junto con sus cambios en los transcritos asociados al osteosarcoma y las vías regulatorias, es esencial para aclarar los mecanismos biológicos y las implicaciones clínicas de la metilación del ARN en el osteosarcoma.

Existen varios métodos analíticos disponibles para estudiar las modificaciones m⁶A 8,9. Se utilizan ensayos basados en cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS)10 y ensayos basados en inmunosorbentes enzimáticos (ELISA) 11 para medir los niveles globales de m⁶A. El primero ofrece alta sensibilidad pero requiere equipo y experiencia especializados, mientras que el segundo otorgarelativos 6niveles A y contribuye a un coste mayor que el ensayo de manchas de puntos. MeRIP-qPCR permite una evaluación dirigida de transcritos específicos, pero está fuertemente influenciada por la eficiencia deinmunoprecipitación 12. MeRIP-seq 13, m⁶A-seq14 y m⁶A-SAC-seq15 son enfoques basados en secuenciación, que pueden mapear con precisión los sitios de metilación m⁶A; sin embargo, son caros y requieren un análisis bioinformático exhaustivo.

El ensayo de blot de puntos m⁶A ofrece un método sencillo, rápido y rentable para determinar los niveles globales de modificación de m⁶A en ARN. Como inmunoensayo semicuantitativo, su principal ventaja radica en generar una visión general de la abundancia de m⁶A sin necesidad de equipos especializados ni análisis bioinformáticos complejos. Esto convierte el ensayo blot de puntos m⁶A en una herramienta valiosa para el cribado rutinario, la validación funcional preliminar y la investigación clínica, así como un complemento práctico a enfoques avanzados basados en secuenciación y espectrometría de masas. El protocolo actual ofrece un flujo de trabajo detallado paso a paso, asegurando la detección reproducible y una amplia aplicabilidad.

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Protocolo

NOTA: El protocolo está organizado en tres secciones: preparación de ARN, ensayo por dot blot y cuantificación. La Tabla de Materiales resume los materiales necesarios, la Tabla Suplementaria 1 detalla las formulaciones de los reactivos y la Figura 1 ilustra el flujo de trabajo experimental.

1. Preparación de ARN

  1. Preparación celular
    1. Extrayendo las células 143B con knockdown estable de SNHG21 (shSNHG21), células de control negativas (shCtrl) y células tratadas con 3-deazaadenosina (3-DAA); [100 μM, 24 h]) y ácido meclofenámico (MA; [100 μM, 24 h]) de la incubadora a 37 °C.
    2. Verifica que la confluencia celular sea aproximadamente al 80-90% y que las células estén en buen estado bajo el microscopio.
    3. Retira el medio de cultivo y luego enjuaga las células dos veces con 1 mL de PBS.
    4. Retira PBS y luego añade 1 mL de tripsina por plato de 6 cm.
    5. Sacude suavemente para distribuir la tripsina de forma uniforme y incuba durante 1 minuto.
    6. Retira la tripsina y luego añade 1 mL de medio que contenga un 10% de FBS para terminar la digestión.
    7. Pipete la suspensión celular varias veces para dispersar las células.
    8. Transfiere la suspensión celular a un tubo microcentrífuga libre de RNasa de 1,5 mL.
      NOTA: Etiqueta el tubo antes de usarlo. Los pasos 1.1.3 a 1.1.8 deben realizarse en condiciones estériles.
    9. Centrifuga a 1000 × g durante 3 minutos y luego elimina completamente el sobrenadante.
  2. Extracción de ARN
    NOTA: La extracción de ARN se realiza utilizando un kit de purificación de ARN EZ-press.
    1. Añade 600 μL de buffer de lisis (presente en el kit de purificación de ARN) al pellet y vórtice a fondo para lisar completamente las células, y déjalo reposar durante 5 minutos.
      NOTA: Se utilizan aproximadamente 2 × 106 células para el aislamiento de ARN.
    2. Añade un volumen igual de etanol al 100% y vórtice a fondo.
    3. Añadir 600 μL de la mezcla sobre una columna de spin ensamblada con un tubo de recogida.
      NOTA: Monta la columna de centrifugación y el tubo de recogida antes de usarlos, y etiqueta el tubo antes de usarlo.
    4. Centrifugar a 12.000 × g durante 1 minuto y descartar el líquido en el tubo de recogida.
      NOTA: Evita el contacto entre el fondo de la columna y el líquido o el operador.
    5. Repite los pasos anteriores 1.2.3-1.2.4 para la mezcla restante.
    6. Añade 500 μL de tampón de lavado (presente en el kit de purificación de ARN) a cada columna de spin y déjalo reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
    7. Centrifugar a 12.000 × g durante 1 minuto y descartar el líquido en el tubo de recogida.
    8. Centrifugar la columna vacía de nuevo a 12.000 × g durante 1 minuto para eliminar el líquido residual.
    9. Transfiere la columna de centrifugación a un nuevo tubo libre de RNasa de 1,5 mL, abre la tapa y seca al aire durante 2 minutos.
      NOTA: Etiqueta el tubo antes de usarlo.
    10. Añade entre 25 y 50 μL de tampón de elución (agua libre de enzimas) al centro de la columna de espín.
    11. Incuba a temperatura ambiente durante 2 minutos.
    12. Centrifugar a 12.000 × g durante 1 minuto para eluir ARN.
    13. Descarta la columna de spin y coloca el ARN sobre hielo.
      NOTA: Almacenar ARN a -80 °C hasta su uso.
  3. Dilución de ARN
    1. Medición de la concentración de ARN de células 143B shSNHG21, células 143B shCtrl y células tratadas con 3-DAA y MA utilizando un espectrofotómetro DS-11.
    2. Prepara 1 μg de ARN total de cada línea celular.
    3. Diluir en serie el ARN a 400 ng, 200 ng y 100 ng con agua tratada con pirocarbonato dietiliforme (DEPC).
      NOTA: Ajusta el gradiente de concentración según sea necesario.
  4. Desnaturalización de ARN
    1. Calentar muestras de ARN diluido a 95 °C durante 3 minutos.
    2. Transfiere inmediatamente las muestras a hielo para que se enfríen.
      NOTA: El ARN desnaturalizado puede almacenarse a 4 °C durante hasta 1 semana.

2. Mancha de puntos

  1. Manchado de ARN
    1. Corta la membrana de nylon cargada positivamente al tamaño deseado.
    2. Dibuja líneas de referencia y etiqueta la membrana con el nombre de la muestra.
    3. Mezcla el ARN a fondo mediante un suave vórtice o pipeteo.
    4. Coloca 1-2 μL de cada muestra de ARN en las posiciones designadas de la membrana.
      NOTA: Utiliza siempre las puntas de la pipeta sin RNasa. Evita el contacto directo entre la punta de la pipeta y la membrana. Permite que el ARN se difunda de forma natural sobre la membrana. Usa una nueva punta de pipeta para cada muestra. No excedas los 2 μL por punto para evitar difusión irregular.
  2. Reticulación de ARN
    1. Seca la membrana al aire durante 3 minutos.
    2. Realizar reticulación de ARN irradiando la membrana en un reticulador UV a 254 nm, 120 mJ/cm².
      NOTA: Incuba la membrana a 37 °C durante 30 minutos como opción alternativa.
    3. Lava la membrana con 10 mL de 1x TBST sobre una plataforma de mecedor durante 5 minutos para eliminar el ARN no unido.
  3. Bloqueo por membrana
    1. Prepara una solución BSA al 5%.
      NOTA: Prepara esta solución fresca antes de usarla.
    2. Incuba la membrana en la solución bloqueadora a temperatura ambiente durante 2 horas.
  4. Incubación de anticuerpos
    1. Incubar la membrana con anticuerpo anti-m⁶A durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Diluir el anticuerpo 1:1000 en una solución de BSA al 5% antes de su uso. Incuba la membrana sobre una plataforma de mecedor con suaves agitaciones (50 rpm).
    2. Lava la membrana tres veces con 10 mL de 1x TBST sobre una plataforma de mecedor durante 10 minutos.
    3. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente.
      NOTA: Diluir el anticuerpo 1:1000 en una solución de BSA al 5% antes de su uso.
    4. Lava la membrana tres veces con 10 mL de 1x TBST sobre una plataforma de mecedor durante 10 minutos.
  5. Detección de quimioluminiscencia
    1. Aplica uniformemente el sustrato quimioluminiscente de HRP en forma de gota sobre la membrana.
      NOTA: Incuba la membrana con sustrato durante 1 minuto a temperatura ambiente con un suave mecimiento.
    2. Detectar señal mediante un sistema de imagen quimioluminiscencia.
    3. Utiliza una función de autoexposición en el sistema de imagen quimioluminiscencia como preescaneo inicial.
      NOTA: Aceptar auto-tiempo solo si la señal más brillante está saturada por debajo del 65%; de lo contrario, reduce a la mitad la exposición y vuelve a adquirirla hasta que la señal máxima baje entre el 30 y el 60%.
  6. Tinción con azul de metileno (MB)
    1. Incuba la membrana en la solución de tinción de MB durante 1 minuto.
    2. Lava la membrana tres veces con 10 mL de 1x TBST sobre una plataforma de mecedor durante 5 minutos, y haz la imagen como control de carga.
      NOTA: Tinte la misma membrana que se usa para la quimioluminiscencia. Evita alterar sedimentos en la solución teñida. Lleva ropa protectora y mascarilla, ya que el MB es difícil de quitar.
    3. Retira la membrana manchada de MB tras la imagen, utilizando una solución que contenga SDS al 1% sobre una plataforma de mecedor durante 15 minutos para facilitar la documentación o la posible re-sondeo.

3. Cuantificación

  1. Medición del valor en escala de grises
    1. Importa la imagen en el software ImageJ.
    2. Convierte la imagen a formato de 8 bits usando Image > Tipo > 8 bits.
    3. Restar antecedentes con Proceso > Restar fondo.
      NOTA: Radio: 50,0 píxeles, comprueba fondo claro.
    4. Utiliza la herramienta Rectángulo para seleccionar el área de análisis.
    5. Define los carriles secuencialmente con Analizar > Gels > seleccionar Primer carril.
    6. Genera perfiles de intensidad usando Analiza > geles > Traza los carriles y mide picos.
    7. Mide los valores en escala de grises de m⁶A y MB, respectivamente.
  2. Copia los datos en una tabla para su análisis.
  3. Comparar las intensidades de la señal para evaluar los niveles globales de modificación de m⁶A.

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Resultados

Para validar rigurosamente el rendimiento del ensayo de blot de punto y examinar el papel de SNHG21 en la regulación global de los niveles globales de m6 A, se sometieron a 143 células B a perturbaciones farmacológicas que suprimen o potencian la metilación de m6A y monitorizaron la abundancia de m6 A en ambas direcciones.

Cuantificación por mancha de puntos de la abundancia global de m6 A
Primero evaluamos la cap...

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Discusión

En este estudio, la reducción de SNHG21 en células osteosarcoma 143B resultó en una reducción de la intensidad de la señal m⁶A, demostrando el valor de este ensayo para evaluar si las modificaciones genéticas afectan a la metilación del ARN. Además, este ensayo sirve como herramienta para múltiples aplicaciones, incluyendo: 1) Estudios funcionales y validación mecanicista: Este ensayo puede utilizarse para un cribado preliminar rápido que determine si los niveles globales de m⁶A están as...

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Divulgaciones

Los autores no informan de conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por subvenciones de la National Nature Science Foundation (82174408, 82374477 y 82474535). La Figura 1 fue creada con BioRender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3-deazaadenosina (3-DAA)MCEHY-W013332A1 mg
Anticuerpo monoclonal anti-m6AProteintech68055-1-IG50 & mu; L
Albúmina sérica bovina (BSA, Fracción V)BioFroxx4240GR100 100 g
Sistema de Imagen MP ChemiDocBIO RAD12003154
DMEM Glucosa AltaWISENT319-005-CL500 mL
Espectrofotómetro DS-11DeNOVIXDS-11
Kit de purificación de ARN EZ-pressEZB B0004DP100 Preparaciones
FBS: Calidad superiorWISENT086-150500 mL
IgG Anti-Ratón de Cabra conjugado con HRP (H+L)BeyotimeA02161 mL
Sustrato quimioluminiscente de HRP Immobilon Occidental  MilliporeWBKLS05002 y veces; 250 mL
Ácido meclofenámico (AM)MCEHY-1172751 mg
Solución de tinción con azul de metilenoSolarbioG13000,1%, 100 mL
Membrana de transferencia de nailonLABSELECTTM-NY-XS-457,4 y horas; 8,5 cm, 0,45 y mu; hombre, 10 PCS/BOLSA
Buffer PBS (polvo seco listo para usar)BiosharpBL601ApH: 7,2-7,4, 2 L/bolsa
Dodecilo sulfato de sodio (SDS)SigmaL5750-500G500 g
Polvo premezcla tampón TBSSangon  A510025-00011EA (243,9 g de pólvora)
Enzima TrypLE ExpressGibco12604-0211 y veces, 500 mL
Preadolescente-20SangonA600560-0500500 mL
Cruzcruzador UVUVPCL-1000

Referencias

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