Este artículo presenta un modelo isquémico de ERC utilizando IRI renal unilateral con nefrectomía contralateral realizada un día antes de la recogida de la muestra; este protocolo permite una evaluación funcional basada en suero, una alta supervivencia y patología reproducible de ERC a los 28 y 42 días, proporcionando una plataforma versátil para estudios mecanicistas e intervencionistas.
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Artículo de método
Modelo murino de transición de enfermedad renal aguda a crónica inducida por isquemia/lesión de reperfusión renal
En este artículo
Resumen
Resumen
La oclusión transitoria quirúrgica del pedículo renal induce la lesión por isquemia-reperfusión renal (IRI), un modelo ampliamente utilizado para estudiar la insuficiencia renal aguda (IAA) y su progresión hacia enfermedad renal crónica (ERC) en ratones. Sin embargo, los protocolos convencionales a menudo excluyen la evaluación funcional basada en suero o generan una alta mortalidad. Aunque los modelos IRI renales unilaterales y bilaterales existentes enfatizan la reproducibilidad, persisten desafíos para lograr tanto una severidad de lesión consistente como una supervivencia a largo plazo adecuada para estudiar la progresión de la ERC. Aquí presentamos un protocolo de aproximación dorsal que proporciona un modelo robusto y reproducible de la transición isquémica de AKI a ERC. El enfoque dorsal facilita el acceso directo a los riñones y minimiza la manipulación intraabdominal. Utilizamos IRI renal unilateral combinada con nefrectomía contralateral, realizada un día antes de la extracción de sangre y tejidos. Este enfoque ofrece dos ventajas principales: (1) minimiza la variabilidad al evitar las inconsistencias asociadas a la lesión bilateral, y (2) logra casi el 100% de supervivencia manteniendo una lesión constante, en contraste con los protocolos en los que la nefrectomía se realiza antes y se asocia con una mayor mortalidad. La evaluación funcional se realiza mediante BUN sérico y creatinina, y la fibrosis intersticial se cuantifica mediante la deposición de colágeno tricromo de Masson y los genes marcadores de la ERC a los 28 y 42 días después de la IRI renal. En conjunto, estas lecturas proporcionan una visión complementaria sobre el deterioro funcional y el desarrollo de la patología tisular. Este protocolo establece un modelo fiable y versátil de la ERC isquémica en ratones para investigaciones mecanicistas.
Introducción
La IAC es una complicación común en pacientes hospitalizados y sigue siendo un importante problema de salud global. Los estudios epidemiológicos indican que la IAC ocurre en hasta el 20% de las personas hospitalizadas y entre el 30 y el 60% de los pacientes en estado crítico 1,2. Aunque algunos pacientes recuperan la función renal, otros muestran una recuperación incompleta, lo que les predispone a laERC de tipo 3. La transición de la AKI a la ERC es cada vez más reconocida como un determinante principal de los resultados a largo plazo y se ha convertido en un foco de investigación mecanicistay terapéutica 4,5,6. Para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes y probar terapias potenciales, los modelos animales reproducibles son esenciales.
La oclusión quirúrgica transitoria del pedículo renal (arteria y vena) induce IRI renal, uno de los modelos más utilizados para estudiar la IAC en ratones. Este procedimiento provoca una lesión epitelial tubular aguda y una respuesta inflamatoria que puede progresar hacia fibrosis intersticial crónica 7,8. Sin embargo, los protocolos convencionales de IRI renal presentan varios desafíos. La IRI renal unilateral se asocia con una mortalidad mínima y se emplea ampliamente en investigaciones a largoplazo 9; sin embargo, la evaluación de la función renal (por ejemplo, química sérica, análisis de orina o tasa de filtración glomerular) no es factible. Las IRI renales bilaterales o los modelos que combinan IRI renal unilateral con nefrectomía contralateral simultánea o temprana están asociados con un aumento de la mortalidad, limitando su uso en estudios crónicos. Aunque se han investigado recientemente10 variaciones robustas de estos modelos, su aplicación en entornos de estudios crónicos merece una consideración cuidadosa. Además, algunos protocolos utilizan una laparotomía ventral de la línea media, que requiere manipular órganos intraabdominales para exponer el pedículo renal. Esto puede aumentar la invasividad quirúrgica y la complejidad técnica. Skrypnyk et al. informaron que la nefrectomía contralateral realizada 8 días después de la isquemia unilateral permite la evaluación serológica de la función renal tras la lesión, manteniendo una alta tasa desupervivencia 11. Este protocolo proporciona un conjunto sistemático de procedimientos optimizados para evaluar la progresión de la IAC a la ERC durante un periodo de hasta 42 días.
Este estudio demuestra un modelo isquémico de AKI-ERC utilizando IRI renal unilateral, seguido de una nefrectomía contralateral retardada realizada un día antes de la recogida de riñón y muestras de sangre. Anteriormente hemos empleado procedimientos similares como modelo AKI en múltiples publicaciones12, 13, 14 y 15. Hemos ampliado con éxito este enfoque para estudiar la transición de AKI a ERC, en la que, a los días 28 y 42, son evidentes signos claros de ERC (Figura 1 para el esquema). Este enfoque proporciona una excelente supervivencia, induce un fenotipo altamente fibrótico en los riñones lesionados y permite evaluar la función renal utilizando la sangre recolectada. Por ello, este enfoque es especialmente útil para estudios que requieren evaluación serológica (a diferencia de la IRI renal unilateral únicamente) y una tasa de supervivencia mejorada (en comparación con la IRI renal bilateral). Se utilizó un enfoque de flanco dorsal para acceder directamente al riñón. En comparación con la laparotomía ventral de la línea media, este enfoque minimiza la manipulación intraabdominal y limita la manipulación quirúrgica a los tejidos renales y perihilares, mejorando así la consistencia del procedimiento.
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Protocolo
Los experimentos con animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh (IACUC; Protocolo nº 23103811), de acuerdo con las directrices institucionales. Se puede incluir un grupo de control simulado de cirugía según corresponda y normalmente se somete a exposición quirúrgica sin pinzamiento vascular ni nefrectomía contralateral. Consulte la sección de Materiales para información detallada sobre las herramientas y equipos utilizados. Los objetos punzantes, incluyendo agujas, bisturí y clips, deben desecharse en recipientes designados para objetos punzantes. Los residuos biológicos, incluidos tejidos y cadáveres, deben ser manipulados y eliminados conforme a los protocolos institucionales de residuos de riesgo biológicos. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación animal y preparación quirúrgica
- Autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos antes de su uso. Al realizar cirugías en varios animales, elimina sangre y restos de los instrumentos entre procedimientos y luego esteriliza durante 10-15 segundos usando un esterilizador de perlas calientes. Deja que los instrumentos se enfríen antes de reutilizarlos.
- Coloca una almohadilla térmica que circule agua y coloca una lámpara infrarroja sobre el campo quirúrgico.
- Colocar al ratón en una cámara de inducción anestesica e inducir anestesia con isoflurano (1,5%-2% en oxígeno, 1-2 L/min) (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados). Una vez que el ratón parezca haber perdido el conocimiento, confirmar la profundidad anestésica adecuada realizando un pellizco en el dedo del pie para verificar la pérdida de reflejos.
- Transfiere el ratón a la almohadilla quirúrgica calentada y mantenga la anestesia mediante un cono nasal.
- Administrar Ethiqa XR (buprenorfina de liberación prolongada; 3,25 mg/kg, s.c.) para analgesia postoperatoria.
- Coloca al ratón en posición prona sobre la almohadilla quirúrgica. Si es necesario, asegura las extremidades con cinta adhesiva para minimizar el movimiento.
- Afeita el vello dorsal alrededor del lugar de la incisión deseada con una máquina de cortar la dosis.
- Aplica pomada oftálmica en los ojos para evitar que se resece durante el procedimiento.
- Inserta una sonda rectal, fíjala con cinta y conéctala a un termómetro para monitorización continua.
- Desinfecta la zona quirúrgica alternando 10% de povidona-yodo y 70% de etanol, y luego cubre la zona con una cortina estéril.
2. IRI renal unilateral
- Haz una incisión cutánea dorsal media (3-4 cm) que abarque el nivel renal.
- Separa la piel de las capas subcutáneas usando tijeras separadoras de tejido.
- Identifica la localización del riñón palpando a través de la piel.
- A nivel donde se visualiza el riñón, aproximadamente 1 cm lateral a la columna vertebral en el lado izquierdo, realizar una incisión muscular longitudinal de 1-1,5 cm.
NOTA: Si la incisión es demasiado larga, el riñón puede deslizarse de nuevo hacia la cavidad abdominal, complicando la manipulación posterior. Una incisión cutánea mínima puede mantener el riñón exteriorizado. - Exterioriza suavemente el riñón a través de la incisión dorsal. Si una membrana fina obstruye el acceso, disecciona de forma directa.
- Mientras estabilizas el riñón con pinzas no dentadas, disecciona de forma directa la grasa perihilar y el tejido conectivo alrededor del pedículo renal superior e inferior para crear un "canal" que permita colocar una pinza vascular.
- Confirma que la temperatura corporal central es lo suficientemente alta (36,8-37,2 °C) antes de inducir isquemia. Aplicar una pinza vascular no traumática a través de la arteria renal y la vena como un mano.
NOTA: Asegúrese de que los vasos estén centrados en las mordazas de la pinza y comprimidos con presión constante. Aplica la pinza en una posición constante sobre el hilo. Orienta la abrazadera perpendicular al eje del recipiente. Esta pinza en particular puede reutilizarse para aproximadamente 10 procedimientos con animales. - Tira de la piel para cubrir el riñón y mantenerlo lo más cerca posible de la temperatura corporal central.
- Mantener la temperatura corporal central en 36,8-37,2 °C durante la isquemia ajustando la bomba de calor entre 38-39 °C (ajustando según sea necesario) y encendiendo o apagando la lámpara infrarroja para mantener la temperatura corporal objetivo (ajustando la distancia de la lámpara según sea necesario).
NOTA: Este sistema de calefacción "sándwich", compuesto por una almohadilla de circulación de agua y una lámpara infrarroja, mantiene eficazmente la temperatura corporal central dentro del estrecho rango de 36,8-37,2 °C. Registra la temperatura corporal central cada minuto para asegurarte de que se mantiene entre 36,8 y 37,2 °C. - Tras 30 minutos del periodo isquémico, retira la pinza y devuelve el riñón con un hisopo de algodón a la cavidad abdominal.
NOTA: Confirma que todo el riñón parece uniformemente pálido antes de desclampar. Después de retirar la pinza, confirma que la reperfusión ha sido exitosa. Si la reperfusión presenta un retraso notable, como 30 segundos o más, esto puede indicar reperfusión incompleta, y debe considerarse la exclusión del animal en análisis posteriores. La susceptibilidad a la IRI renal y la posterior gravedad de la ERC están significativamente influenciadas por la edad, el sexo y la tensión de fondo. Realizar un experimento piloto para determinar la duración óptima de la isquemia es esencial para cada diseño de estudio. - Cierra la capa muscular con suturas absorbibles 5-0 y luego la piel con clips para la herida (por ejemplo, 9 mm).
NOTA: Retira los clips de la herida 10 días después de la cirugía. - Suspende la anestesia con isoflurano y deja que el ratón se recupere en una jaula limpia. Si el animal se ha recuperado de la anestesia y no muestra signos de angustia o hipotermia, devuelva la jaula a la sala de mantenimiento del animal. Los animales son monitorizados en busca de dolor o molestias postoperatorias, y se administran dosis adicionales de Ethiqa XR según sea necesario. Se establecen criterios humanos según las directrices institucionales de la IACUC para minimizar el malestar animal.
NOTA: Ethiqa XR proporciona analgesia hasta 3 días. Administre una dosis adicional si los animales muestran signos de dolor o molestia 72 horas después de la dosis inicial.
3. Nefrectomía contralateral
- Sigue el paso 1, los pasos de preparación animal.
- Realiza una incisión cutánea como se describe en los pasos 2.1 y 2.2.
- Al nivel donde se visualiza el riñón derecho, aproximadamente 1 cm lateral a la columna vertebral del lado derecho, realizar una incisión muscular longitudinal de 1-1,5 cm.
- Mientras sostienes el riñón con pinzas no dentadas, disecciona de forma directa la grasa perihilar y el tejido conectivo para exponer el pedículo renal.
- Separa cuidadosamente la glándula suprarrenal del riñón, dejando la glándula suprarrenal intacta y evitando lesiones en sus vasos.
- Liga el pedículo renal con un clip de ligadura (tamaño del clip: pequeño) y suturas de seda 4-0, luego corta los vasos del lado renal. Posteriormente, transecta el uréter y extirpa el riñón.
- Cierra la incisión como se describe en el paso 2.11.
4. Recogida de sangre y tejido renal
- Inducir anestesia en ratones con isoflurano (1,5%-2% en oxígeno, 1-2 L/min) y confirmar la profundidad anestésica con pellizcos en el dedo del pie para verificar la pérdida de reflejos.
- Coloca al ratón en posición supina, luego haz una incisión en la línea media y retira el diafragma.
- Expone cuidadosamente el corazón e inserta una aguja de 23-G unida a una jeringuilla de 3 mL en el ventrículo izquierdo.
- Extrae sangre lentamente (600-1.000 μL).
- Retira la aguja para evitar la hemólisis y transfiere la sangre al tubo de recogida.
- Extrae el riñón izquierdo y seccionarlo con un bisturí (cuchilla montada en un mango) según los requisitos del estudio.
- Realizar la eutanasia extirpando el corazón bajo anestesia (siguiendo los protocolos aprobados por la institución).
- Procesa los tejidos seccionados según los requisitos del estudio (por ejemplo, fijación, congelación rápida).
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Resultados
El cambio característico en el color renal observado durante la cirugía confirmó la inducción de isquemia renal uniforme seguida de una reperfusión exitosa. La isquemia exitosa se indica mediante un cambio en el color del riñón de negro a púrpura oscuro, con mejoría posterior tras la retirada de una pinza vascular, confirmando la reperfusión. Si la isquemia renal no se induce con éxito, el riñón presenta solo un cambio mínimo de color y la lesión posterior puede no ser consistente. En es...
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Discusión
Este protocolo proporciona un modelo reproducible inducido por IRI renal de la transición de la IRI a la ERC, caracterizada por disfunción renal sostenida y fibrosis intersticial progresiva, que son ampliamente consideradas características de laERC 17,18. La obstrucción ureteral unilateral (UUO) es un modelo ampliamente utilizado de ERC, que induce nefropatía obstructiva y provoca principalmente fibrosis mediante obstruc...
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por NIDDK K01-DK133635; Premio UPMC VMI P3HVB; Premio de la Fundación Samuel y Emma Winters; Subvención de inicio de UPMC CHP RAC; Premio de los Financiadores de la Fundación UPMC CHP Children's Trust; Programa de Oportunidades de la Alianza de Recursos Renales George M. O'Brien (OKRA OPP) (a TC), NIDDK R01-DK121758; DK134346; R25-DK119180 (a SSL), NIDDK R01-DK125015; R01-DK137410 (a JH), y Carolyn y Mark Snyder y la familia Snyder (a JH y SSL). Agradecemos al Laboratorio Básico de Histología de la CHP de UPMC por su ayuda con histología e imágenes escaneadas, y a los Laboratorios de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Kansas por el apoyo en química sérica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtro de gases anestésicos | A.M. Bickford | F-AIR | |
| Cámara de inducción de anestesia, calentamiento | Productos de AIMS Lab | WCS8 | |
| Tubo de recogida de sangre | BD Microtainer | 365967 | |
| Etanol | Laboratorios de Descontaminación | 2701 | |
| Ethiqa XR (buprenorfina de liberación prolongada) | Saludo Animal Fidelis | NDC 86084-100-30 | |
| Pomada para ojos | AKORN | NDC 17478-062-35 | |
| Gasas, estériles y nbsp; | Dynarex | 3353 | |
| Máquina de cortar pelo para animales pequeños | WAHL | CLP-9868 | |
| Lámpara de calor, infrarrojo | Instrumentos Physitemp | HL-1 | |
| Bomba de calor para circulación de agua caliente | BrainTree Scientific | HTP-1500 | |
| Sistema de calor/anestesia para animales pequeños, Versaflex | BrainTree Scientific | EZ-7150 | |
| Cortinados quirúrgicos que retienen el calor | Braintree Scientific | SPDR-MPS | |
| Esterilizador de cuentas calientes | Simon Keller | Steri 250 | |
| Solución de isoflurano | Covetrus | 29405 | |
| Aplicador de clip de ligadura | ¡QUÉ PUAJ! | 533140 | |
| Clips de ligadura | ¡QUÉ PUAJ! | 533837 | |
| Microsonda para temperatura rectal y nbsp; | Fisitempo | RET-3 | |
| Termómetro de microsonda | Fisitempo | BAT-12 | |
| Microscopio, óptico | Leica | DM2500 | |
| Microscopio, escáner deslizante | Leica | Escáner de diapositivas Aperio CS2 | |
| Mouse (FVB/NJ) | Laboratorio Jackson | 001800 | |
| Aguja (23G) | BD | 305145 | |
| Varillas de hipododio de povidona | Dynarex | 1201 | |
| Cuchillas de bisturí | Herramientas Científicas Fines | 10020-00 | |
| Empuñadura de bisturí | Herramientas Científicas Fines | 10060-13 | |
| Pinzas quirúrgicas, no dentadas | Instrumento Quirúrgico Roboz | RS-5228 | |
| Pinzas quirúrgicas, dentadas | Herramientas Científicas Fines | 11051-10 | |
| Pinzas quirúrgicas, dentadas | Herramientas Científicas Fines | 11019-12 | |
| Guantes quirúrgicos | CTI | SPGF750 | |
| Tijeras separadoras de tejido quirúrgico | Herramientas Científicas Fines | 14072-10 | |
| Sutura, Ácido Poliglicólico (PGA)/absorbible (5-0) | Dynarex | 9131 | |
| Sutura, seda (4-0) | Oasis | MV-683-V | |
| Jeringuilla (3ml) | BD | 309628 | |
| Cortinas para toallas, estériles y nbsp; | Dynarex | 4410 | |
| Pinza vascular aplicando pinzas | Herramientas Científicas Fines | 15057-14 | |
| Pinza vascular, no traumática y nbsp; | Herramientas Científicas Finas | 18055-03 | |
| Aplicador de clip de herida | Herramientas Científicas Fines | 12020-09 | |
| Clips de herida | Herramientas Científicas Fines | 12022-09 |
Referencias
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