Un protocolo de microscopía de localización de molécula única multimarca para la investigación de la cromatina en el entorno nuclear denso

Summary

Presentamos un protocolo de tinción y análisis de microscopía de localización de molécula única de cromatina en tres colores (SMLM) que permite el mapeo reproducible de eucromatina, heterocromatina y RNAP II para análisis espacial. Este protocolo permite un marcado multicolor eficiente en entornos nucleares densos, incluyendo objetivos asociados a la cromatina, permitiendo una detección simultánea fiable.

Abstract

La microscopía de superresolución ha avanzado drásticamente nuestra capacidad para interrogar estructuras biológicas más allá del límite de difracción, haciéndola indispensable para estudiar estructuras nucleares densamente empaquetadas como la cromatina, las láminas nucleares y cuerpos nucleares como los nucleolos. La cromatina muestra una organización multiescala —desde nucleosomas de tamaño nanométrico hasta dominios a escala micrométrica— que requiere enfoques de imagen capaces tanto de alta resolución como de especificidad molecular. La microscopía de localización de molécula única (SMLM), especialmente la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), permite un mapeo preciso de las marcas epigenéticas, ofreciendo una visión crítica sobre la estructura y función de la cromatina. Sin embargo, la imagen multi-marca en el entorno nuclear presenta desafíos únicos, incluyendo una menor accesibilidad a los anticuerpos, aumento de la unión inespecífica y la inestabilidad del fluoróforo. Para abordar estos problemas, presentamos un protocolo de inmunomarcaje secuencial optimizado para entornos nucleares de alta densidad, que permite un SMLM robusto de tres colores con una diafonía mínima y menos degradación de señales. Este método incluye formulaciones optimizadas de tampón, selección de fluoróforos y estrategias de validación de anticuerpos para asegurar un marcaje reproducible y de alta fidelidad entre múltiples objetivos. Es importante destacar que integramos este protocolo con una canalización de análisis computacional que aprovecha localizaciones de un objetivo molecular como anclajes espaciales (puntos semilla) para cuantificar distancias entre objetivos, densidades locales y coafinidad multi-etiqueta. Esto permite un análisis espacial detallado de los componentes de la cromatina a nanoescala. Este protocolo sirve como un marco reproducible para la imagen multicomponente y el análisis cuantitativo en ambientes subcelulares densos, ofreciendo una herramienta poderosa para investigadores que investigan arquitecturas nucleares complejas como la cromatina.

Introduction

La llegada de la microscopía de localización de molécula única (SMLM) ha permitido una exploración sin precedentes de estructuras biológicas a escala^nanométrica 1,2,3,4,5. Más allá de la imagen de un solo blanco, la extensión a la SMLM multicolor ha avanzado aún más el campo al permitir la visualización simultánea de múltiples especies moleculares, así como las relaciones espaciales y temporales entre estructuras de^{subdifracción} 6,7,8,9,10,11 . Sin embargo, aplicar SMLM multiplexado a modificaciones de histonas abundantemente distribuidas sigue siendo un reto debido a la naturaleza densa y polimérica del ADN nuclear y al acceso limitado de anticuerpos en este^entorno 12,13,14,15,16,17,18.

La cromatina presenta una organización jerárquica y multiescala que abarca varios órdenes de magnitud en longitud, desde ensamblajes nucleosomais a escala nanométrica hasta arquitectura nuclear a escala micrométrica. A mayor escala, los cromosomas ocupan territorios cromosómicos distintos, dentro de los cuales el genoma se divide aún más en compartimentos A/B y dominios asociados topológicamente (TADs) que limitan las interacciones regulatorias a largo alcance mediante mecanismos como la extrusión de lazo 19,20,21,22. A escalas inferiores a 200 nm, la cromatina se organiza como un polímero desordenado compuesto por dominios de empaquetamiento heterogéneos (PDs) en lugar de bloques discretos de eucromatina y heterocromatina, con regiones transcripcionalmente activas que se localizan preferentemente en los límites de PD 23,24,25,26,27,28,29. A las escalas más pequeñas (5-20 nm), la cromatina consiste en ensamblajes y clutches de nucleosomas irregulares, lo que subraya la ausencia de un motivo uniforme de plegamiento de orden superior y enfatiza la naturaleza emergente y dependiente de la escala de la organización^genómica 24,26,30. Con el rápido avance de enfoques basados en secuenciación, como la secuenciación por inmunoprecipitación por cromatina y la captura de conformación de cromatina de alto rendimiento 19,30,31,32,33^, se han identificado diversas características de las estructuras organizativas a mesoescala de^{cromatina 31,32}. Sin embargo, estas técnicas, a diferencia de la imagen, no logran captar geometría espacial que solo se observa tras resolver estas estructuras. Métodos de microscopía electrónica como la microscopía electrónica de cromatina (ChromEM²⁴) y la microscopía electrónica de transmisión de escaneo de la cromatina (ChromSTEM²⁵) han revelado que la cromatina es heterogénea y está organizada en dominios de empaquetado a escalas de longitud de 50-200 nm⁽25,28,29). Aunque estas técnicas permiten una resolución impresionante para identificar dominios de empaquetamiento de cromatina, no pueden proporcionar un mapeo molecularmente específico como el que ofrece SMLM. La acumulación de puntos de ADN para la imagen en topografía a nanoescala (DNA-PAINT²²) y la hibridación in situ multiplexada por fluorescencia (FISH⁾¹⁹permiten una alta multiplexación; sin embargo, DNA-PAINT se ve fuertemente afectado por el ruido de fondo elevado derivado de eventos aleatorios de unión en el entorno nuclear rico en oligonucleótidos^12,34, mientras que los métodos tradicionales basados en desnaturalización térmica requieren un plegamiento nativo de cromatina alterado. Estudios previos han aplicado técnicas de imagen de superresolución para investigar la cromatina a esta escala de longitud e han identificado una composición híbrida de dominios de empaquetamiento, opuesta a los modelos previos de separación^{de fases 12,23,34,35}. Este protocolo proviene de un artículo previamente publicado que discute la importancia biológica de estos^{hallazgos 34}. Por tanto, dada su alta resolución y capacidades de multiplexación, dSTORM basada en inmunotinción sigue siendo la estrategia más viable para la imagen de cromatina multicolor bajo condiciones casi nativas.

Este protocolo no es el primero en demostrar el marcado de más de dos blancos nucleares, ya que estudios previos han marcado complejos proteicos individuales o genes^12,36. A pesar del marcado exitoso de modificaciones posttraduccionales de histonas nucleosómicas, el marcaje, la imagen y el análisis multicolor de la cromatina SMLM presentan desafíos significativos. En primer lugar, la inmunotinción en el ambiente denso de cromatina requiere optimizar la concentración de anticuerpos, la secuencia de incubación y la composición del tampón para asegurar una penetración y unión adecuadas sin un fondo excesivo. En segundo lugar, es necesario un análisis exhaustivo de múltiples marcadores, ya que las interacciones entre eucromatina, heterocromatina y enzimas como la ARN polimerasa probablemente se extienden más allá de simples exclusiones binarias. Hasta ahora, el número máximo de colores demostrados en la imagen de cromatina dSTORM sigue siendo de^{dos, 18, 37, 38, 39}.

Aquí presentamos un protocolo robusto para la imagen y análisis de la cromatina en tres colores SMLM. Nuestro flujo de trabajo de tinción optimiza el tiempo de incubación de anticuerpos y emplea buffers de imagen^{mejorados 40}para sesiones prolongadas de imagen para múltiples marcadores. Además describimos las canalizaciones computacionales para el análisis de distancias de dos colores y el análisis de densidad de las articulaciones en tres colores, permitiendo la caracterización cuantitativa de las relaciones entre heterocromatina, eucromatina y maquinaria de transcripción. En contraste con estudios anteriores de cromatina bicolor SMLM que sugerían una separación entre heterocromatina y eucromatina, la imagen de cromatina tricolor revela que el genoma está organizado en dominios de empaquetado, con eucromatina y transcripción activa localizadas en la periferia de núcleos constitutivos de^{heterocromatina 34}.

Este protocolo proporciona a la comunidad un marco reproducible para realizar SMLM de cromatina multicolor y establece estrategias de análisis adecuadas para múltiples objetivos nucleares conjugados funcionalmente. Al salvar brechas metodológicas, permite una exploración sistemática de la organización de los dominios de la cromatina a nivel supranucleosómico, complementando los enfoques de secuenciación y microscopía electrónica mientras preserva la arquitectura nuclear nativa. Este artículo es un protocolo ampliado de un artículo^{publicado 34}.

Protocol

NOTA: La siguiente sección del protocolo se dividirá en el proceso de tinción y el proceso de adquisición que se describe a continuación. Para tutoriales de análisis de datos, consulte la publicación^{asociada 34} que detalla el análisis de multi-etiqueta para modificaciones de histonas etiquetadas.

1. Proceso de tinción:

NOTA: A lo largo del protocolo se menciona platos de 35 mm o 8 placas bien recamaradas. Estos son los recipientes que nuestro grupo utiliza para el cultivo celular, aunque existen métodos más pequeños y eficientes. Asegúrate de que, si se utilizan materiales alternativos, se mantengan las concentraciones recomendadas para los anticuerpos tampón. Debido a la naturaleza secuencial de este protocolo, la selección de anticuerpos es importante para un marcado exitoso. Utilizamos el razonamiento estándar para asegurar que los anticuerpos del huésped para nuestros objetivos sean diferentes, de modo que nuestros anticuerpos secundarios puedan atacar especies distintas del huésped, minimizando eficazmente los efectos fuera del objetivo. El orden de marcado se determina en función de la ubicación del objetivo dentro del núcleo. Como nos dirigimos a los dominios de empaquetamiento de^cromatina 25,28,34,35 y entendemos que este es un proceso impulsado por la difusión, siempre etiquetamos primero los objetivos heterocromáticos, seguido de la eucromatina y finalmente los RNAPII para minimizar la exclusión estérica en regiones heterocromáticas densas. La optimización de los búferes se realizó empíricamente durante el desarrollo del protocolo. Descubrimos que la inclusión de suero de cabra tras el primer objetivo fue útil para reducir los efectos fuera del objetivo en los pasos posteriores.

1. Preparación del tampón
   1. Componentes del buffer:
      NOTA: Para más información sobre los componentes, incluyendo tiempos de almacenamiento y preparación, consulte la Tabla de materiales. Recomendamos que el usuario tenga todas las soluciones listas antes de iniciar el protocolo para evitar errores experimentales. La solución de temple debe hacerse al final.
   2. Haz que el bloqueo sea buffer
   3. Pesa la albúmina sérica bovina (BSA) de modo que la concentración final en el volumen tampón necesario para el experimento sea del 3% y agírela a un tubo centrífuga. Inclina el tubo a un ángulo de 45° para que los cristales de BSA queden dispersos en el tubo, luego añade solución salina tamponada con fosfato (PBS). Esto se hace para evitar la formación de grumos cristalinos que no se disuelven.
   4. Deja el tubo a temperatura ambiente hasta que todos los cristales se disuelvan. No agites el tubo ni el vórtice: esto provocará la formación de burbujas que atraerán proteínas a la superficie y evitarán que la BSA se disuelva por completo.
   5. Una vez completamente disuelto, añadir Triton X-100 de modo que su concentración final sea del 0,2% (v/v) dado el volumen elegido en el paso 1.3. Si los cristales no están completamente disueltos, pipetea varias veces arriba y abajo para mezclar la solución lentamente sin formar burbujas.
      NOTA: Si se prepara un tampón modificado, incluye el suero de cabra al 10% en este proceso. Sin embargo, los buffers de bloqueo modificados deben hacerse frescos durante el uso y no almacenarse durante largos periodos, pero asegurar que las concentraciones finales sean las mismas indicadas en la Tabla de materiales: 3% BSA, 0,2% Triton X-100.
   6. Haz que el lavado sea un amortiguador:
      Repite los pasos para bloquear el buffer en 1.1.2, pero usa las concentraciones indicadas en la sección de materiales y aquí para tu comodidad (0,2% BSA, 0,1% Triton X-100 en 1X -DPBS, y para modificados incluir suero de cabra al 1%).
   7. Prepara una solución fijadora:
      1. Añade PBS a un tubo de centrífuga.
      2. Añade la cantidad adecuada de paraformaldehído al 16% al tubo de la centrífuga para una concentración final del 4%.
         NOTA: Prepáralos frescos y listos al sacar las células de la incubadora. Aunque la solución fijadora actual normalmente no utiliza glutaraldehído, puede incluirse y puede ser útil debido a su fijación más robusta y a una fijación más duradera en comparación con el paraformaldehído. El sistema para dSTORM no posee capacidades para señales de vida útil de fluorescencia provenientes de glutaraldehído (GA), sin embargo, los usuarios que sí lo tienen pueden encontrar útil para diferenciarlo de las estructuras marcadas con fluoróforos.
   8. Prepara una solución de temple:
      1. Pesa el borohidruro de sodio en papel de pesar.
      2. Prepara el tubo de la centrífuga.
      3. Añade borohidruro de sodio al tubo.
      4. Añade PBS al tubo.
         NOTA: La solución debe tener burbujas después de añadir el PBS.
   9. Haz que la imagen sea un buffer:
      1. Disolver 1,4-Diazabiciclooctano (DABCO) en RNASA desionizada, agua libre de DNASA para obtener una solución de DABCO de 13 mL con una concentración de 1 M.
      2. Añade 12 M HCl (~240 μL) hasta que el DABCO se disuelva completamente y el pH alcance 8,0.
      3. Prepara 1 M de sulfito de sodio disolviéndolo en 10X PBS. El TDT no necesita ninguna preparación.
      4. Para la preparación final, utiliza stocks previos para fabricar 65 mM de DABCO con 30 mM de sulfito de sodio y 30 mM de DTT (1 M de stock) en agua desionizada.
      5. Ajusta el pH mediante la titulación con HCl y NaOH hasta que el pH sea 8,0. Guarda cubierta y sellada con Parafilm a 4° C no más de 2 meses. Controla el pH durante todo el uso.
2. Detalles del proceso de la primera etiqueta:
   1. Fijación:
      1. Toma células vivas de la incubadora y retira el medio de cultivo celular del plato. Desecha el medio de cultivo celular en un contenedor de residuos de riesgo biológicos.
      2. Añade suficiente PBS para cubrir las celdas (1 mL para una antena de 35 mm y 500 μL para una lámina de vidrio de cámara).
      3. Remueve el plato suavemente para lavar las células con PBS y luego retira el PBS del plato. Descarta el PBS en un contenedor de residuos de riesgo biológico.
      4. Añade suficiente solución fijadora para cubrir las celdas (1 mL para un plato de 35 mm y 500 μL para una lámina de vidrio de cámara), luego deja que las células se fijen durante 10 minutos.
      5. Mientras se fijan las células, pesa borohidruro de sodio para la solución de temple y añádelo a un tubo centrífuga.
      6. Retira la solución fijadora del plato y deséchala en el contenedor de residuos químicos líquidos etiquetado adecuadamente.
   2. Temple
      1. Añade suficiente PBS al plato para cubrir la superficie (1 mL para un plato de 35 mm y 500 μL para un portaobjetos de cámara de vidrio), luego coloca el plato sobre un agitador (cualquier agitador estándar está bien) durante 5 minutos para lavar las celdas.
      2. Quita el plato de la coctelera, retira el PBS y deséchalo en el contenedor de residuos químicos líquidos etiquetado adecuadamente.
      3. Añade suficiente solución de temple (250 μL, plato de 8 pozos) para cubrir la superficie (1 mL para un plato de 35 mm y 500 μL para una lámina de vidrio de cámara), luego coloca el plato sobre un coctelero durante 7 minutos para apagar la autofluorescencia en las celdas.
      4. Mientras las celdas están en el agitador, descarta la solución de temple restante en el tubo de la centrífuga en el contenedor de residuos químicos líquidos etiquetado adecuadamente.
      5. Quita el plato del agitador, retira la solución de temple y deséchalo en el contenedor de residuos químicos líquidos correctamente etiquetado.
      6. Añade suficiente PBS (250 μL, plato de 8 pozos) al plato para cubrir la superficie (1 mL para un plato de 35 mm y 500 μL para un portaobjetos de cámara de vidrio), luego coloca el plato sobre un coctelero durante 5 minutos para lavar las celdas.
      7. Quita el plato de la coctelera, retira el PBS y deséchalo en el contenedor de residuos químicos líquidos etiquetado adecuadamente.
      8. Repite los pasos 1.2.2.6 y 1.2.2.7 dos veces más (para un total de 3 lavados PBS).
   3. Bloqueo
      1. Añade suficiente buffer de bloqueo al plato para cubrir la superficie (250 μL, plato de 8 pozos, 1 mL para un plato de 35 mm y 500 μL para una lámina de vidrio de cámara).
      2. Coloca el plato sobre un shaker durante al menos 1 hora para permeabilizar las membranas celulares y bloquear los sitios de unión (ocupa los sitios no especificados, para que no interfieran con los objetivo). (Aunque hemos probado varias veces para determinar la duración mínima exitosa del bloqueo como 20 minutos, recomendamos encarecidamente bloquear durante al menos 1 hora o más hasta toda la noche. Puede ser necesaria optimización dado el objetivo y la línea celular.)
      3. Mientras las células están en el agitador, prepara una solución primaria de tinción de anticuerpos (véase la concentración recomendada en la web del proveedor o consulte la tabla en la sección de materiales).
      4. Para determinar el volumen total de soluciones de tinción a fabricar, añadir 0,5 mL al volumen necesario para cubrir las células (por ejemplo, para un plato de 35 mm, preparar una solución de 1,5 mL).
      5. Retirar el volumen determinado en la sección 1.2.3.1 del material de bloqueo y añadir este volumen a un nuevo tubo de centrífuga para preparar la solución de tinción.
      6. Añade un volumen adecuado de stock primario de anticuerpos al tampón de bloqueo para obtener la concentración final correcta. Los volúmenes primarios de stock de anticuerpos para varios anticuerpos usados frecuentemente pueden encontrarse en la sección de materiales.
      7. Quita el plato del shaker, retira el buffer bloqueador y deséchalo en el contenedor de residuos químicos líquidos etiquetado adecuadamente.
   4. Tinción primaria de anticuerpos:
      1. Añade suficiente solución primaria de tinción de anticuerpos al plato para cubrir la superficie (1 mL para un plato de 35 mm y 500 μL para un portaobjetos de cámara de vidrio), luego coloca el plato sobre un shaker durante al menos 1-2 horas hasta toda la noche para marcar los objetivos celulares.
      2. Quita el plato del shaker, retira la solución primaria de manchas de anticuerpos y deséchala en el recipiente de residuos químicos líquidos correctamente etiquetado.
      3. Añade suficiente buffer de lavado al plato para cubrir la superficie (1 mL para un plato de 35 mm y 500 μL para un portaobjetos de cámara de vidrio), luego coloca el plato sobre un shaker durante 5 minutos para lavar las celdas.
      4. Quita el plato del agitador, retira el buffer de lavado y desvíalo en el contenedor de residuos químicos líquidos etiquetado adecuadamente.
      5. Repite los pasos 1.2.4.3 y 1.2.4.4 dos veces más (para un total de 3 lavados de tampón de lavado).
      6. Mientras las células están en el agitador durante el último lavado, prepara una solución secundaria de tinción de anticuerpos (véase la concentración recomendada en la web del proveedor o consulte experimentos previos).
      7. Para determinar el volumen total de soluciones de tinción a fabricar, añadir 0,5 mL al volumen necesario para cubrir las células (por ejemplo, para un plato de 35 mm, preparar una solución de 1,5 mL).
      8. Retirar el volumen determinado en la sección 1.2.4.7 del tampón de bloqueo y añadir este volumen a un nuevo tubo de centrífuga para preparar la solución de tinción.
      9. Añadir un volumen adecuado de stock de anticuerpos secundarios al tampón de bloqueo para obtener la concentración final correcta. Los volúmenes de stock secundario de anticuerpos para varios anticuerpos usados frecuentemente pueden encontrarse en la tabla de materiales.
      10. Envuelva el tubo de la centrífuga con la solución secundaria de anticuerpos para tinchar con papel de aluminio hasta que esté listo para añadir a las células del plato.
   5. Tinción secundaria por anticuerpos:
      1. Añade suficiente solución secundaria de anticuerpos para cubrir la superficie (1 mL para una antena de 35 mm y 500 μL para una lámina de cámara de vidrio), luego coloca la placa sobre un shaker durante al menos 40 minutos para añadir fluoróforos a los objetivos celulares marcados.
      2. Asegúrate de que el plato esté cubierto con papel de aluminio para evitar el blanqueamiento con fluoróforo.
      3. Quita el plato del agitador, retira la solución secundaria de anticuerpos y deséchalo en el recipiente de residuos químicos líquidos correctamente etiquetado.
      4. Añade suficiente PBS al plato para cubrir la superficie (1 mL para un plato de 35 mm y 500 μL para un portaobjetos de cámara de vidrio), luego coloca el plato sobre un shaker durante 5 minutos para lavar las celdas.
      5. Quita el plato de la coctelera, retira el PBS y deséchalo en el contenedor de residuos químicos líquidos etiquetado adecuadamente.
      6. Repite las secciones 1.2.5.4 y 1.2.5.5 una vez más (para un total de 2 lavados PBS).
      7. Ahora las células pueden ser visualizadas o almacenadas para obtener imágenes posteriores. Si haces imágenes inmediatamente, sigue los pasos en la sección de Adquisiciones. Si guardas para obtener imágenes más adelante, sigue siguiendo los pasos siguientes.
      8. Añade suficiente PBS al plato para cubrir la superficie (1 mL para un plato de 35 mm y 500 μL para una lámina de vidrio de cámara) antes de guardarlo.
      9. Envuelve el plato con parafilm y luego con papel de aluminio para evitar tanto la evaporación líquida como el blanqueamiento con fluoróforo.
      10. Guarda el plato envuelto a 4°C hasta que esté listo para la imagen.
          NOTA: Para las etiquetas utilizadas en este protocolo, los platos pueden almacenarse durante 2-3 días antes de que la calidad de imagen se vea significativamente afectada; sin embargo, diferentes anticuerpos pueden tener diferentes estabilidades pero, con un almacenamiento adecuado, permanecen estables durante un tiempo tras completar el protocolo. No se recomienda almacenar un plato etiquetado durante más de una semana, ya que la solución fijadora no está lo suficientemente concentrada para mantener estabilidad a largo plazo.
3. Proceso posterior de tinción de etiquetas:
   1. Bloqueo:
      1. Consulta los 1.2.3.1 - 1.2.3.2 pero usa el buffer de bloqueo con suero de cabra. El tiempo de incubación para el bloqueo puede ser tan corto como 1 hora, pero recomendamos tiempos más largos con un límite superior de una noche a la mañana (18-24 horas) para estas siguientes marcas, con el fin de reducir la unión fuera del objetivo. Por favor, consulte experimentos anteriores.
      2. Mientras tanto, preparar soluciones primarias de anticuerpos, en lugar de tampón bloqueante, en tampón bloqueador con suero de cabra.
   2. Tinción primaria de anticuerpos:
      1. Prepara el tampón bloqueador modificado y el tampón de lavado con suero para cabra y el tampón de lavado con suero para cabra, como se detalla en la sección de preparación del tampón.
      2. Consulte las secciones de paso 1.2.3-1.2.4 (Bloqueo y tinción primaria de anticuerpos) utilizando los tampones modificados de bloqueo y lavado:
         NOTA: El tiempo de incubación del anticuerpo primario puede ser tan corto como 1 hora, y incluso durante la noche (8-24 horas). Aunque el mejor rendimiento de etiquetado se ha logrado con tiempos de incubación más largos, especialmente para multi-etiqueta. Los datos de este protocolo se han preparado con pasos de incubación nocturnos.
      3. Poco antes de finalizar el tiempo de incubación, preparar soluciones secundarias de anticuerpos en el tampón bloqueador modificado 1.1.3.
   3. Tinción secundaria por anticuerpos:
      1. Consulta la sección 1.2.5 (Tinción secundaria de anticuerpos) pero utiliza tampón bloqueante con suero de cabra.
         NOTA: Ten en cuenta que el tiempo de incubación puede ser tan corto como 1 h, pero hemos probado tiempos más largos (2-4 h) con un rendimiento similar. Para las siguientes etiquetas, repita la sección 1.3.

2. Proceso de adquisición

NOTA: Para la adquisición de datos, utilice el software Nikon Imaging Software (NIS) Elements compatible con el microscopio usado. Cualquier software que pueda controlar el filtro, la ruta de la luz y los ajustes de la cámara está bien para este protocolo. El siguiente protocolo de imagen está adaptado para la iluminación de fluorescencia interna total (TIRF) de la muestra; sin embargo, el protocolo de etiquetado es compatible con múltiples formas de imagen. La imagen no TIRF es posible con este protocolo de etiquetado para STORM y es necesaria para aplicaciones 3D STORM. Por favor, utilice un protocolo estándar para metodologías de imagen alternativas.

1. Proceso posterior de tinción de etiquetas:
   1. Enciende los componentes ópticos necesarios y establece la conexión con el software adecuado. En la mayoría de los casos, como en NIS, el software no inicializará completamente a menos que el ordenador pueda comunicarse correctamente con el microscopio, la cámara y el control del escenario.
   2. Abre el software NIS (o equivalente).
   3. Configurar la vista en directo: Activa la vista en vivo >alterna) Mantén el escalado automático > en los ajustes de la cámara y ajusta el tiempo de exposición a 30 ms.
   4. Establece el camino de datos para adquisiciones.
   5. Navega al panel superior Adquirir> Rápido Tiempo Rápido> Camino
   6. Selecciona el nombre adecuado del archivo para la primera adquisición y establece el número de fotogramas en 10.000.
      NOTA: Estos pasos se toman para limitar el tiempo que la muestra está expuesta a la fuente de luz una vez que comienzan las imágenes.
   7. Asegúrate de que el ángulo crítico y el ángulo cero del TIRF estén preestablecidos antes de la adquisición. Por favor, consulta fuentes online con tutoriales sobre cómo lograrlo. Como se ha dicho antes, si no usas iluminación TIRF, este paso se puede omitir.
   8. Selecciona el camino de luz adecuado para la cámara y activa la opción de Iluminación Epidemiológica en Lámparas (en NIS o software equivalente) para asegurarte de que el espejo está preparado para iluminación de campo amplio desde fuentes de luz estándar no láser.
2. Preparación de muestras:
   1. Recuperar muestras y añadir un tampón de imagen (formulación descrita en la sección 1.1 Preparación del tampón) a la muestra. (Dependiendo del buffer de imagen utilizado, puede ser necesario tomar diferentes precauciones. Protege las muestras de la luz.)
   2. Después de añadir aceite al objetivo, coloca la muestra en el escenario con el soporte adecuado y alterna el Enfoque Perfecto y luego enfoca la muestra.
3. Pasos de imagen:
   1. Busca un punto láser y muéstrate hasta un punto del plato sin celdas.
   2. Activar la iluminación TIRF .
   3. Cambia el filtro para que coincida con el filtro adecuado para pasar la luz roja (o el láser que se utilice para obtener datos de esta muestra específica).
      NOTA: Utilice un filtro de múltiples mueschas como se describe en la tabla de materiales. No es necesario un filtro multimuesca, y los usuarios pueden alternativamente realizar cubos de filtro no distintos diseñados para los fluoróforos usados en su tinción.
   4. Enciende el láser a la potencia láser más baja ~ 1 mW (esto depende de la fuente de iluminación, pero se hace para evitar blanqueos accidentales) y ajusta el ángulo del espejo al ángulo crítico.
   5. Si no hay celdas cerca, aumenta la potencia del láser hasta que el punto láser se vea claramente en la vista en directo.
   6. Utiliza la herramienta Región de Interés (ROI), dibuja, establece y guarda el ROI donde está ubicado el punto láser.
      NOTA: Para muestras multi-etiqueta, asegúrese de que los puntos láser de todas las fuentes de luz necesarias para la muestra estén alineados. En este protocolo usamos tres láseres y nos aseguramos de que todos los puntos estén alineados. Esto es esencial ya que el co-registro de datos espaciales requiere alineación láser.
   7. Vuelve a la iluminación Epi y al filtro de campo brillante.
   8. Utilizando la herramienta de definición de ROI, navega para encontrar una célula sana adecuada (por ejemplo, una célula HCT116 adecuada debe tener una forma adherente, poligonal u ovalada con un límite celular claro).
   9. Centra el ROI en el núcleo y haz clic en OK para ampliar la posición ROI (Realiza usando iluminación de campo brillante, ya que la salud de la célula no puede determinarse directamente a partir de imágenes fluorescentes de campo amplio del núcleo).
   10. Volver a la iluminación TIRF usando el mismo método que se usó en la 2.3.2.
   11. Selecciona el filtro adecuado para el objetivo etiquetado con longitud de onda más larga (en la mayoría de los casos es el blanco rojo muy largo, es decir, el objetivo etiquetado como Alexa Fluor 647). Normalmente, se selecciona primero la longitud de onda más larga para evitar el blanqueamiento fotográfico de la muestra con longitudes de onda más cortas en caso de que los objetivos etiquetados tengan secundarios que se solapen en espectros.
   12. Con una potencia láser BAJA para cada láser necesario (en el caso de múltiples etiquetas serían 3 láseres), enciende el láser e ilumina el núcleo para asegurarte de que la muestra está correctamente alineada.
   13. Utiliza controles TIRF para asegurarte de que la muestra se ilumina con TIRF.
   14. Selecciona la posición Z adecuada para la adquisición según las necesidades. Sin embargo, esto puede ajustarse justo antes de la adquisición.
   15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
   16. Haz clic en Adquirir> Timelapse rápido.
   17. Configura los marcos en ≥10.000 y haz clic en Aplicar para crear el archivo en el directorio especificado.
   18. Enciende la potencia láser al 50% y haz una muestra de lejía.
   19. El núcleo debería blanquearse inicialmente, pero poco después (segundos después) debería empezar a parpadear.
   20. Vuelve al ángulo crítico deseado y a la posición Z alternando las posiciones guardadas o controlando manualmente el ángulo del espejo y la posición Z, y obtienes un lapso rápido de tiempo.
   21. Asegúrate de que no haya deriva en la etapa o no se hará correctamente la co-grabación de imágenes multicanal. Utiliza marcadores fiduciarios (microperlas fluorescentes) o guarda la posición Z al inicio de la adquisición para usarla más adelante en corrección de deriva usando el método de guardado de posición para adquisición multipunto en el dispositivo.
   22. Cambia el filtro (o déjalo si usas multi-muesca con banda pasante para el fluoróforo necesario) y repite las secciones 2.3.17-2.3.20 (Para etiquetas posteriores, asegúrate de empezar siempre con baja potencia láser, ajustar parámetros y adquirir).
4. Procesamiento de datos:
   1. Carga la pila de imágenes raw en FIJI usando el plugin Bio-Formats. Genera una proyección de intensidad mínima seleccionando Imagen> Pilas> Proyecto Z y eligiendo Intensidad mínima como tipo de proyección. Resta esta proyección mínima de la pila de imágenes en bruto usando Process > Image Calculator. En la imagen resultante, realiza la resta de fondo (Proceso > Resta de fondo) con un radio de bola rodante de 5 píxeles.
   2. Define la región de interés (ROI) para células individuales, ya sea manualmente o con el plugin Nuclei Outline (Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline).
   3. Realizar análisis de localización en la pila de imágenes preprocesadas dentro del ROI definido usando el plugin ThunderSTORM (Plugins > análisis ThunderSTORM > Run). Utiliza parámetros apropiados para una localización robusta (por ejemplo, filtro de imagen: B-spline, orden = 3, escala = 2; umbral de intensidad máxima = 1,5× std (Onda.F1); método de localización subpíxel: Gaussiana, sigma = 2; radio de ajuste = 4; método de ajuste: máxima verosimilitud). Las coordenadas resultantes pueden usarse para reconstruir la imagen de superresolución.
   4. Para experimentos multicanal, fusionar canales para generar una imagen dSTORM compuesta reconstruida con cromatina (Imagen > Canales de Fusión > Color).

Results

Imágenes representativas de cromatina tricolor dSTORM

El protocolo propuesto de tinción secuencial ha sido probado válido para diversas líneas celulares, incluyendo fibroblastos BJ, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A, etc. La Figura 1 muestra las imágenes representativas de fibroblastos BJ, HeLa y células MCF10A.

Validación de la cadena de análisis utilizando conjuntos de datos simulados

El desarrollo de un protocolo de inmunofluorescencia de tres colores hizo necesaria la creación de un enfoque computacional especializado capaz de manejar la complejidad de datos de SMLM nuclear multiobjetivo (Figura 2A,2 B). Dado el denso entorno de cromatina donde múltiples objetivos coexisten en proximidad, implementamos un marco de análisis de nubes de puntos que procesa directamente las coordenadas de localización en lugar de imágenes reconstruidas. Este enfoque aprovecha las extensas herramientas de análisis de clústeres disponibles para datos de nube^{de puntos 40,41,42}. Evaluamos sistemáticamente la capacidad de la cadena de análisis para distinguir patrones espaciales biológicamente significativos utilizando conjuntos de datos simulados controlados. Se generaron cuatro tipos de distribución para representar escenarios distintos de organización de la cromatina: distribución normal para modificaciones muy agrupadas, distribución uniforme para patrones dispersos, distribución toroidal modelando zonas de exclusión y distribución aleatoria como control organizativo (Figura 2C). Estos patrones simulados se anclaron a posiciones genuinas de clústeres de heterocromatina derivadas de datos experimentales de H3K9me3, preservando restricciones espaciales nucleares realistas. Este marco de análisis utiliza agrupamiento DBSCAN (épsilon = 50 nm, puntos mínimos = 3), que es uno de los muchos métodos para el análisis de conglomerados en datos^SMLM 40,41,42. Para asegurar parámetros adecuados de agrupamiento, hemos descrito previamente un método de optimización adaptado para la detección de dominios de empaquetamiento^{de cromatina 34}. Ten en cuenta que, al utilizar esto como primer paso en el análisis, los usuarios deberán optimizar los parámetros que informan la selección a través de la estructura, el entorno y la función de su objetivo. Aquí los límites de los conglomerados se determinan mediante cálculos de envolvente convexa, eliminando suposiciones sobre la geometría del dominio. Nuestra validación demostró una clara discriminación entre todos los patrones de distribución simulados mediante perfiles distintivos de histogramas de distancia (Figura 2D). Cada tipo de organización espacial produjo firmas características cuando se analizaron las localizaciones en relación con los centroides de heterocromatina. El análisis de ocupación conjunta se probó utilizando simulaciones de doble marcador con relaciones espaciales controladas (Figura 2E). Los marcadores espacialmente segregados (configuración normal-toroidal) produjeron una densidad articular mínima como se esperaba, resultando en perfiles de distribución planos (Figura 2E). Los patrones de marcadores superpuestos (configuración normal-aleatoria) producían una densidad de juntas decreciente a medida que se distanciaba de los puntos de referencia, coincidiendo con las predicciones teóricas. Estos resultados de validación demuestran la capacidad de nuestro marco para detectar y cuantificar relaciones de acoplamiento espacial en conjuntos de datos complejos multi-objetivo. Para más información sobre cómo se generaron estos conjuntos de datos simulados, consulte la publicación^{completa 34}.

Resultados representativos del análisis de la organización de la cromatina

La implementación de nuestro enfoque de análisis validado en muestras biológicas revela patrones característicos de organización espacial alcanzables mediante este protocolo. Utilizando células HeLa procesadas con nuestro procedimiento de tinción en tres colores para H3K9me3, H3K27ac y ARN Polimerasa II, demostramos las capacidades analíticas que permite esta metodología. La heterocromatina H3K9me3 sirve como sistema de referencia ideal dada la evidencia establecida de la organización concéntrica de la cromatina a escala de 200 nm de investigaciones previas de superresolución 23,28,35. El análisis comienza con la identificación basada en escaneo DB de dominios de heterocromatina, que posteriormente se categorizan por radio efectivo: dominios pequeños (25-40 nm), dominios medios (40-80 nm) y dominios grandes (80-253 nm). Esta estratificación de tamaño explica la heterogeneidad documentada en las dimensiones de los dominios de empaquetamiento de ADN, con dominios medios que miden aproximadamente 80 nm en un radio²⁵. Las mediciones de distancia emplean una ventana de búsqueda de radio de racimo de 1,5x (Figura 2B arriba) para capturar señales proximales de eucromatina y polimerasa (Figuras 3A,B).

Los resultados representativos muestran que tanto H3K27ac como ARN Polimerasa II localizan consistentemente cerca de los límites de la heterocromatina en todas las categorías de dominios, alineándose con estudios^{previos 28,44} y modelos de localización de transcripción relativos a los dominios de^{cromatina 23,35,45,46}. El análisis cuantitativo de distancias revela posiciones medias muy cercanas a las periferias de dominio: los dominios grandes muestran H3K27ac a -1,0 nm y la ARN polimerasa II a 8,4 nm de los límites, mientras que los dominios más pequeños presentan asociaciones periféricas comparables con diferencias posicionales menores. Estas mediciones indican que los elementos activos de la cromatina se concentran en la interfaz entre dominios represivos y permisivos en lugar de estar completamente excluidos. El análisis de densidad conjunta demuestra la capacidad del protocolo para revelar el acoplamiento espacial entre objetivos co-etiquetados (Figura 3C-F). El análisis relativo a los dominios de heterocromatina muestra que la densidad articular máxima ocurre justo fuera de los límites del dominio (r/r₀> 1), lo que indica una colocalización preferencial de la H3K27ac-ARN Polimerasa II en regiones periféricas (Figura 3G-I). Estos resultados muestran cómo esta cadena de tinción y análisis puede ayudar a investigar relaciones espaciales complejas en entornos densos.

Figura 1: Tres imágenes en color de las celdas utilizadas. Imágenes en tres colores de (A) fibroblasto de BJ (B) HeLa y (C) MCF10A. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Marco de análisis cuantitativo para la organización espacial de objetivos en relación con los clústeres de heterocromatina. (A) Canal de análisis para datos de SMLM multicanal utilizados en este estudio. (B) Esquema de cálculos de distancia a la periferia para los clústeres de heterocromatina identificados y el método de conteo de afinidad conjunto. Ambos métodos se utilizan para determinar cuantitativamente la disposición de dos objetivos en relación con la estructura del cúmulo de heterocromatina. (C) Distribuciones de dispersión de ejemplo alrededor de cúmulos específicos de heterocromatina usados en un estudio³⁴ para determinar organizaciones biológicas distintas de estructuras objetivo (agrupadas dentro de un dominio vs alrededor del dominio vs no asociadas y distribuidas aleatoriamente). (D) Distancia a la periferia del histograma para curvas de afinidad centralizadas, distribuidas aleatoriamente y toroidales y (E) Curvas de afinidad articular para casos de simulación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Relaciones espaciales cuantitativas de marcadores de transcripción alrededor de dominios de histonas. (A) Resultados de la distancia a la periferia del histograma para datos biológicos ejemplares de células HeLa multi-marcadas. Para dominios pequeños (<40 nm), medianos (40-80 nm) y grandes (>120 nm) para RNAPII y (B) H3K27ac en relación con los clústeres H3K9me3. (C-E) Imágenes de ejemplo para imágenes dSTORM de tres etiquetas de celdas HeLa (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p, con imagen insertada y ampliada para un solo dominio. (F) Ajuste de la envolvente convexa (rojo) del dominio representado en E con la zona de análisis en gris. (G) Gráficos de afinidad para RNAPII en relación con H3K27ac y H3K27ac (H) respecto a RNAPII en el análisis de ROI para todos los dominios de los datos de tamaño medio en el conjunto de datos. (I) Densidad conjunta de RNAPII y H3K27ac en análisis ROI para todos los dominios de tamaño medio. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

Este protocolo SMLM de tres colores representa un avance significativo en nuestra capacidad para investigar la organización de la cromatina dentro del denso entorno nuclear. El enfoque secuencial de marcaje de inmunofluorescencia, combinado con el análisis espacial de nubes puntuales que utiliza estimaciones de localización como puntos como base del análisis, proporciona a los investigadores una herramienta poderosa para examinar las relaciones a nanoescala entre diferentes modificaciones de cromatina y maquinaria de transcripción activa que antes eran indetectables mediante técnicas convencionales de microscopía.

La estrategia de tinción secuencial del protocolo aborda desafíos fundamentales inherentes a la imagen nuclear multi-objetivo. A diferencia de las estructuras citoplasmáticas o asociadas a membranas, que son relativamente dispersas, los objetivos de cromatina nuclear existen en densidades extremadamente altas con dominios espaciales superpuestos. Nuestro enfoque de bloqueo modificado, que incorpora suero de especies secundarias de anticuerpos hospedadores tras cada ronda de marcaje, previene eficazmente la reactividad cruzada entre pares de anticuerpos manteniendo la especificidad del objetivo. Las incubaciones nocturnas a 4°C aseguran la penetración completa de anticuerpos en todo el volumen nuclear, fundamental para lograr la densidad de marcado uniforme necesaria para el análisis cuantitativo de SMLM. Este protocolo produce de forma fiable imágenes con una resolución de 15-20 nm a través de múltiples líneas celulares, lo que lo hace ampliamente aplicable para estudios de organización de la cromatina.

A continuación, se presentan los consejos para la resolución de problemas de la sesión de imagen. Si los núcleos no blanquean, la causa más probable es una intensidad insuficiente del láser en la muestra, que puede deberse a un ajuste de baja potencia o a un ángulo incorrecto del TIRF; en este caso, soluciona el problema comprobando la alineación del láser, aumentando la potencia del láser y ajustando cuidadosamente el ángulo del TIRF. Si los parpadeos en el núcleo son muy pocos pero permanecen constantemente brillantes, esto indica que los núcleos no se han blanqueado lo suficiente. Si los parpadeos son muy escasos y los núcleos no son visibles en absoluto, la explicación más probable es la tinción infructuosa, y los reactivos y anticuerpos deben comprobarse antes de repetir el protocolo. Por el contrario, si el número de parpadeos nucleares es muy alto (un resultado deseable), se requiere un tiempo de blanqueamiento más largo hasta que se puedan resolver visualmente los parpadeos individuales y bien separados de una sola molécula. En experimentos convencionales de SMLM, la densidad de marcado adecuada puede estimarse a menudo utilizando estructuras de referencia bien definidas como los microtúbulos; Sin embargo, la cromatina presenta una organización altamente heterogénea y carece de una estructura de verdad de base bien definida, lo que dificulta esta estimación. Basándonos en la optimización empírica y la experiencia previa, aseguramos que la densidad efectiva de marcado alcance aproximadamente 100 localizaciones por μm² para permitir una reconstrucción robusta de los dominios de empaquetamiento de cromatina. En nuestro protocolo, no utilizamos ningún marcador fiduciario, pero recomendamos si los usuarios los tienen. En nuestros experimentos, los desplazamientos laterales permanecen dentro de 0,2 píxeles (menos de ~5nm), lo cual puede ser ignorado. Por lo tanto, no utilizamos marcadores fiduciarios.

La elección de H3K9me3, H3K27ac y ARN polimerasa II proporciona información complementaria sobre la organización de la cromatina a nivel nanométrico. H3K9me3 sirve como referencia espacial ideal porque forma clústeres discretos y bien definidos que representan la heterocromatina constitutiva y pueden identificarse de forma fiable mediante algoritmos de agrupamiento automatizados. H3K27ac marca la cromatina asociada al potenciador que participa activamente en la regulación génica, mientras que la ARN polimerasa II indica directamente los sitios de transcripción activa. En conjunto, estos tres objetivos permiten investigar cómo se organizan la maquinaria transcripcional y las modificaciones regulatorias de la cromatina en relación con las regiones heterocromáticas dentro de la arquitectura nuclear.

El marco de análisis de nubes de puntos aborda limitaciones críticas de estudios previos sobre la organización de la cromatina al permitir un análisis espacial integral en entornos nucleares densos. Los métodos tradicionales de comparación por pares no pueden capturar las complejas relaciones espaciales que ocurren cuando múltiples modificaciones de cromatina coexisten dentro de las mismas regiones nucleares. Nuestro enfoque utiliza análisis de densidad conjunta para revelar dónde co-localizan H3K27ac y ARN polimerasa II en relación con los clústeres H3K9me3, proporcionando información cuantitativa que no puede obtenerse en experimentos separados de dos colores.

Los resultados representativos demuestran consistentemente un modelo organizativo cohesivo en lugar de una compartimentalización estricta de la cromatina. Tanto H3K27ac como ARN polimerasa II se localizan preferentemente en las periferias de los grupos de heterocromatina en diferentes tamaños de dominio, con mediciones cuantitativas que muestran posicionamientos dentro de 10 nm de los límites de los conglomerados, lo que respalda hallazgos de otros grupos con métodos y modelos de transcripción^similares 23,28,35,45,46 . El análisis de densidad conjunta revela que la maquinaria activa de transcripción y la cromatina asociada a potenciadores se acoplan con mayor frecuencia en las regiones que rodean grupos heterocromáticos. Estos hallazgos desafían modelos simples de separación de fases y apoyan principios organizativos integrados donde diferentes modificaciones de cromatina mantienen una proximidad espacial cercana en lugar de formar compartimentos separados y distintos.

El diseño modular del protocolo permite investigar diversas cuestiones de biología de la cromatina mediante la sustitución de objetivos, manteniendo el mismo marco analítico. Los estudios sobre el tiempo de replicación pueden sustituir a proteínas del ciclo celular como el antígeno nuclear de células de proliferación (PCNA) y el mantenimiento de mini cromosomas (MCM), mientras que las investigaciones de respuesta al daño del ADN podrían dirigirse a γH2AX y factores de reparación. Los estudios del ciclo celular podrían examinar modificaciones de histonas que cambian a lo largo de la división, y la investigación en diferenciación podría centrarse en las marcas epigenéticas asociadas al compromiso de la línea de linaje. El enfoque de marcado secuencial acomoda cualquier combinación de proteínas nucleares o modificaciones de cromatina para las que existan anticuerpos fiables, limitados principalmente por consideraciones de compatibilidad espectral y reactividad cruzada. Esta flexibilidad permite a los investigadores abordar cuestiones fundamentales sobre la dinámica de la cromatina durante diversos procesos celulares, manteniendo al mismo tiempo capacidades de análisis espacial cuantitativo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andor iXon Ultra 888 CCD  con multiplicación de electrones;	Andor	DU-888U3-CSO-#BV	NA
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A7030	Se usa para bloquear y lavar amortiguadores. No guardes buffer de bloqueo basado en BSA durante más de 1 mes en 4° C
Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., Modelo MGL-FN-532 (532 nm) y nbsp;	PSU-H-LED	https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htm	NA
Caja láser OBIS coherente (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm) y nbsp;	Coherente	1228877	Láseres colimados con 3– 10 kW/cm³ potencia media en la muestra, mínimo 10.000 fotogramas recogidos por canal de longitud de onda con  10– 30  ms  tiempo de adquisición.
DABCO (1,4-Diazabiciclo-(2.2.2)-octano)	Sigma	D27802	NA
DBPS (1X)	Thermo Fisher	14190-136	NA
Agua destilada	NA	NA	Cualquier agua destilada está bien y no pasa nada;
DTT (Ditiotreitol), 1M	Sigma	43816	NA
Vidrio cubierto con ocho cámaras bien compartimentadas	Cellvis	C8-1.5H-N	Puede ser cualquier placa inferior de cristal, pero los volúmenes deben ajustarse según el recipiente.
Anti-Ratón de Cabra AF568	Thermo Fisher	A11004	Concentración de stock: 2 mg/mL Estabilidad Post Marcado: 2– 3 días
Goat anti Rabbit AF647	Thermo Fisher	A21245	Concentración de stock: 2 mg/mL Estabilidad tras el marcado: 4 y la línea guion; 5 días
Cabra anti-rata A488	Thermo Fisher	A11006	Concentración de stock: 2 mg/mL Estabilidad Post Marcado: 2– 3 días
Anticuerpo primario H3K27ac	Thermo Fisher	MA5-23516	Concentración de stock: 1,0 mg/mL
Anticuerpo primario H3K9me3	Abcam	AB1769156	Concentración de stock: 1,287 mg/mL
Tubo cónico de polipropileno de alta claridad 15 mL	Corning	352096	Usado para soluciones fijadoras y de temple y nbsp;
Tubo cónico de polipropileno de alta claridad 50 mL	Corning	352070	Usado para 40 mL de cargas de bloqueo y lavado
Ácido clorhídrico (HCl), 12M	Sigma	258148	NA
Nikon Eclipse Ti-E con sistema de enfoque perfecto	Niikon	TI-DH 611392 y nbsp;	Microscopio invertido
Nikon SR APO TIRF, aumento de 100x, 1,49 NA	Nikon	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series	NA
Suero normal de cabra	Abcam	AB7481-1002	Se usa después de terminar la primera etiqueta. Debería estar presente en los amortiguadores de bloqueo y lavado
Paraformaldehído 16 %	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15710	Se usa en solución fijadora que debería agotarse en las dos semanas posteriores a la preparación. Mantente protegido de la luz a 4 grados; C
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10X	Ambión	AM9625	NA
Puntas de pipeta 1000 uL	SureOne	02-707-404	Cualquier punta de pipeta está bien siempre que lo haga. s apropiado para el volumen
RNAPII-PS2	Abcam	AB252855	Concentración de serie: 0,98 mg/mL
Borohidruro de sodio	Thermo Fisher	S678-10	Usa fresco para el tampón de temple cada vez.
Hidróxido de sodio (NaOH)	Thermo Fisher & nbsp;	A16037.36	NA
Sulfito de sodio	Sigma	S0505	NA
Triton X-100 10%	Thermo Fisher & nbsp;	28314	NA