Desarrollo y eficacia de nanopartículas de esqualeno-quidamida sensibles a enzimas para el cáncer de páncreas

Summary

Este protocolo detalla la síntesis y caracterización de nanopartículas de escualeno-quitosano modificado con ácido fólico, evalúa su liberación de fármacos responsivos a enzimas y su absorción celular in vitro, y las aplica para mejorar la terapia del cáncer de páncreas mediante administración dirigida.

Abstract

Aquí presentamos un protocolo para abordar la penetración intratumoral limitada de fármacos de moléculas pequeñas causada por la matriz extracelular densa (ECM) del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Los profármacos ofrecen un gran potencial para superar este desafío mejorando la penetración de fármacos y la eficacia para eliminar tumores. El escualeno (SQ), un precursor natural para la biosíntesis del colesterol con excelente bioseguridad y biocompatibilidad, puede mejorar la compatibilidad membranaria de fármacos hidrofílicos y potenciar su absorción celular cuando se conjuga con agentes quimioterapéuticos o pequeñas moléculas bioactivas. En este estudio, desarrollamos un novedoso sistema profármaco basado en SQL lipofílico: el fármaco anticancerígeno hidrofílico chidamida (CHI) se conjugó a SQ mediante un enlace amida — un enlace sensible a pancreatina y catepsina B (enzimas clave sobreexpresadas en el microambiente PDAC). Esta conjugación produjo un profármaco anfifílico SQ-CHI, que se autoensambló a su vez en nanopartículas modificadas con folato (FA) (FA-SQ-CHI NP). Los NP optimizados mostraron un diámetro hidrodinámico uniforme de 173,3 ± 1,5 nm, un índice de polidispersión (PDI) de 0,181 ± 0,18, una alta capacidad de carga de fármacos del 59,0% ± 0,77%, y un potencial Zeta estable de -13,10 ± 0,86 mV. Los estudios de liberación in vitro mostraron que los NP lograron un 80,2% ± 4,22% de liberación acumulada de fármacos en 72 horas en presencia de un 0,25% de pancreatina, mientras que solo se observó una liberación entre un 33% y un 38% en tampones ajustados por pH (pH 4,5 o 7,4) sin enzimas. Los ensayos de captación celular confirmaron que la modificación de la AF mejoró significativamente la eficiencia de la administración intracelular, con una intensidad de fluorescencia 1,8-2,3 veces mayor en células PDAC (PSN-1 y CFPAC-1) en comparación con NPs no dirigidas a las 12-24 horas. El protocolo actual proporciona una metodología integral para la síntesis y caracterización del profármaco, evaluación in vitro de la cinética de liberación sensible a enzimas y análisis comparativos de la eficacia terapéutica y la penetración tisular, destacando las principales ventajas del nanoportador en la administración dirigida, la alta carga de fármacos y la liberación controlada desencadenada por enzimas.

Introduction

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es un tumor altamente maligno del tracto digestivo, con una incidencia casi igual a su tasa de mortalidad y una tasa de supervivencia a 5 años de solo 8%-9%¹. Un microambiente tumoral complejo (TME) es la característica distintiva de^{PDAC 2}. Está compuesto principalmente por una matriz extracelular (ECM) anormal, fibroblastos asociados al cáncer activados (CAFs) y un entorno celular profundamente inmunosupresor. El ECM PDAC es rico en colágeno tipo I. Tanto su contenido alterado como su arquitectura anormal promueven la progresión tumoral y está....

Protocol

1. Síntesis de SQ-CHI y SQ-PEG-FA

1. Síntesis de SQ-CHI: Pesa 120,4 mg (0,3 mmol) de ácido 1,1',2-tris-norsqualenoico y disuelve en 1 mL de N, N-Dimetilformamida (DMF). Añadir secuencialmente NHS (46 mg, 0,4 mmol) y EDCI (72 mg, 0,38 mmol) y permitir que la reacción continúe durante 90 minutos bajo protección con nitrógeno.
2. Disuelve la quidamida (58,56 mg, 0,15 mmol) en 1 mL de DMF y añádela gota a la mezcla de la reacción. Agitar la reacción a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno durante 72 horas.
3. Tras la finalización, evaporar el disolvente a presión reducida a 5-15 kPa p....

Results

Este estudio diseñó y evaluó con éxito con éxito un novedoso sistema dirigido de administración de nanofármacos: las nanopartículas autoensambladas basadas en profármacos por escualenilación de chidamida (CHI-SQ-PEG-FA NN; Figura 1). Sintetizamos las NPs CHI-SQ-PEG-FA (Figura 2) y evaluamos sistemáticamente los efectos de varios parámetros, incluyendo la relación de fase aceite-agua (Figura 3A), la .......

Discussion

Este estudio ofrece una guía práctica paso a paso para implementar un sistema de cintura baja basado en el autoensamblaje de nanopartículas. Las nanopartículas autoensambladas obtenidas en este estudio mostraron una forma esférica regular, buena dispersión, tamaño de partícula uniforme, alta eficiencia en la carga y encapsulación de fármacos, y demostraron una estabilidad^{satisfactoria 21}. Se empleó un modelo 3D de cocultivo de esferoides tumorales (PSN-1/HPSC) par.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% tripsina-EDTA	Gibco (EE. UU.)	25200072
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida cloruro (EDCI)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	E6383
Viales criogénicos de 2 mL	Corning (EE. UU.)	430488
Placas de cultivo celular de 96 pozos	Corning (EE. UU.)	3598
etanol absoluto	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	100092680
Acetona	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	32201-2.5L
acetonitrilo	Tedia (EE. UU.)	A998-4	Grado HPLC
Acetato de amonio	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	10002861
Sulfato de sodio anhidro	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	31481
Gabinete de seguridad biológica	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	1380, 1332, 1356
Frascos de cultivo celular	Corning (EE. UU.)	CLS430372
Incubadora de cultivos celulares	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	HERA51901126
Chidamida (CHI)	Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (China)		pureza >95%
Lector de microplacas multimodo Cytation 5	BioTek, EE. UU.	CYT5MV
Agitador termostatático de calefacción magnética DF-101S	Zhengzhou Kechuang Instrument Co., Ltd., China
diclorometano	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	80047318
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	D2650
dioxano	Aladdín (China)	D116156-5 ml
Medio DMEM	Gibco (EE. UU.)	12100046
Solución fisiológica tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	Gibco (EE. UU.)	14040141
Acetato de etilo	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	10009460
éter etílico	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
FA2004B Balance electrónico	Shanghai Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., China	FA2004B
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco (EE. UU.)	10099141C
folato-poli(etilenglicol)-amina (FA-PEG-NH2)	Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)	PS2-NFA-2000
Ácido fórmico	Aladdín (China)	F112034	Grado HPLC
Liofilizador	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.
Catepsina B humana	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	SRP0289
Líneas celulares de cáncer de páncreas humano (PSN-1, CFPAC-1)	la Colección de Cultura de Tipo Americano (ATCC)	CRL-3211, CRL-1918
células estrelladas pancreáticas humanas (HPaStec, HPSC)	la Colección de Cultura de Tipo Americano (ATCC)
Tripsina humana	Sigma-Aldrich (EE. UU.)
Ácido clorhídrico	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	CFSR-10011008
Microscopio invertido	Olympus, Japón	IX83
Medio Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM)	Gibco (EE. UU.)	12440053
IX 1000 mezclador de vórtices & nbsp;	Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., China	IX 1000
Metanol	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	M433287-10L
metanol	Tedia (EE. UU.)	MS1922-001	Grado HPLC
Tubos de microcentrífuga (1,5/2,0 mL)	Axygen (EE. UU.)	MCT-150-C
micropipetas (20, 100 y 1000 y mu; L)	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	4642050, 4642070, 4642090
Sistema de purificación de agua Mill-Q	Millipore, EE. UU.	ZR0Q00800
Kit de ensayo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenilo)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio)	Promega (EE.UU.)	G3582
N,N-Dimetilformamida (DMF)	Aladdín (China)
N-bromosuccinimida (NBS)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	B81255
N-Hidroxisuccinida (NHS)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	56480
Optima Max ultracentrífuga	Beckman, EE. UU.	393490
Solución de penicilina/estreptomicina	Gibco (EE. UU.)	15140-122
ácido periódico	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	P7875
Éter de petróleo	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
Metasulfato de fenazina (SPM)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	3180806
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco (EE. UU.)	70011069
Poli(etilenglicol)-amina (PEG-NH2)	Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)	PG2-AM-20k
Medio RPMI-1640	Gibco (EE. UU.)	31800022
Polvo de gel de sílice	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	53698	Malla 300
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	401676
Cloruro de sodio	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	10019318
Dicromato de sodio dihidratado	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	1.93689
Escualeno	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	Y0002131
tubos centrífugos estériles (15 y 50 mL)	Corning (EE. UU.)	430791, 430828
Ácido sulfúrico	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	10021618
Tetrahidrofurano	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	34865-4X4L	Grado analítico
tubos centrífugos de ultrafiltración (corte de peso molecular: 3,5 kDa)	Beckman, EE. UU.	344088