Method Article

Desarrollo y eficacia de nanopartículas de esqualeno-quidamida sensibles a enzimas para el cáncer de páncreas

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

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1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Este protocolo detalla la síntesis y caracterización de nanopartículas de escualeno-quitosano modificado con ácido fólico, evalúa su liberación de fármacos responsivos a enzimas y su absorción celular in vitro, y las aplica para mejorar la terapia del cáncer de páncreas mediante administración dirigida.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un protocolo para abordar la penetración intratumoral limitada de fármacos de moléculas pequeñas causada por la matriz extracelular densa (ECM) del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Los profármacos ofrecen un gran potencial para superar este desafío mejorando la penetración de fármacos y la eficacia para eliminar tumores. El escualeno (SQ), un precursor natural para la biosíntesis del colesterol con excelente bioseguridad y biocompatibilidad, puede mejorar la compatibilidad membranaria de fármacos hidrofílicos y potenciar su absorción celular cuando se conjuga con agentes quimioterapéuticos o pequeñas moléculas bioactivas. En este estudio, desarrollamos un novedoso sistema profármaco basado en SQL lipofílico: el fármaco anticancerígeno hidrofílico chidamida (CHI) se conjugó a SQ mediante un enlace amida — un enlace sensible a pancreatina y catepsina B (enzimas clave sobreexpresadas en el microambiente PDAC). Esta conjugación produjo un profármaco anfifílico SQ-CHI, que se autoensambló a su vez en nanopartículas modificadas con folato (FA) (FA-SQ-CHI NP). Los NP optimizados mostraron un diámetro hidrodinámico uniforme de 173,3 ± 1,5 nm, un índice de polidispersión (PDI) de 0,181 ± 0,18, una alta capacidad de carga de fármacos del 59,0% ± 0,77%, y un potencial Zeta estable de -13,10 ± 0,86 mV. Los estudios de liberación in vitro mostraron que los NP lograron un 80,2% ± 4,22% de liberación acumulada de fármacos en 72 horas en presencia de un 0,25% de pancreatina, mientras que solo se observó una liberación entre un 33% y un 38% en tampones ajustados por pH (pH 4,5 o 7,4) sin enzimas. Los ensayos de captación celular confirmaron que la modificación de la AF mejoró significativamente la eficiencia de la administración intracelular, con una intensidad de fluorescencia 1,8-2,3 veces mayor en células PDAC (PSN-1 y CFPAC-1) en comparación con NPs no dirigidas a las 12-24 horas. El protocolo actual proporciona una metodología integral para la síntesis y caracterización del profármaco, evaluación in vitro de la cinética de liberación sensible a enzimas y análisis comparativos de la eficacia terapéutica y la penetración tisular, destacando las principales ventajas del nanoportador en la administración dirigida, la alta carga de fármacos y la liberación controlada desencadenada por enzimas.

Introduction

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El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es un tumor altamente maligno del tracto digestivo, con una incidencia casi igual a su tasa de mortalidad y una tasa de supervivencia a 5 años de solo 8%-9%1. Un microambiente tumoral complejo (TME) es la característica distintiva dePDAC 2. Está compuesto principalmente por una matriz extracelular (ECM) anormal, fibroblastos asociados al cáncer activados (CAFs) y un entorno celular profundamente inmunosupresor. El ECM PDAC es rico en colágeno tipo I. Tanto su contenido alterado como su arquitectura anormal promueven la progresión tumoral y están asociados a un pronósticopobre 3. Los CAF son las células estromales más abundantes y consisten en subtipos funcionalmente distintos, como los myCAFs productores de matriz y los iCAFs inflamatorios, que exhiben plasticidadfenotípica 4.

Inmunológicamente, el TME del PDAC está dominado por células mieloides protumorales. Los linfocitos antitumorales son escasos o disfuncionales. Los linfocitos B maduros también contribuyen a lainmunosupresión 3,4. En conjunto, estos componentes establecen múltiples barreras terapéuticas. El estroma denso, caracterizado por una alta presión de líquido intersticial, crea una barrera de penetración significativa que dificulta gravemente la administración de agentes terapéuticos en las regiones tumorales profundas, limitando así sustancialmente la eficacia clínica de los fármacosquimioterapéuticos 5. Por ello, es fundamental desarrollar sistemas de administración de fármacos capaces de superar esta barrera estromalica y penetrar profundamente en el tejido tumoral pancreático.

En los últimos años, el escualeno (SQ), precursor natural de la biosíntesis del colesterol, ha atraído considerable atención debido a su excelente bioseguridad y biocompatibilidad6. Al ser altamente hidrofóbicos, los SQ pueden conjugarse con fármacos hidrofílicos para formar profármacos anfifílicos, mejorando así la biocompatibilidad de fármacos hidrofílicos de moléculas pequeñas con las membranas celulares y mejorando su eficiencia de absorcióncelular 7. Estudios previos han demostrado que las SQ pueden conjugarse covalentemente con diversos agentes quimioterapéuticos, como cisplatino, paclitaxel y gemcitabina, formando nanopartículas de profármacos con alta capacidad de carga de fármacos, lo que mejora la administración de fármacos a tumoressólidos 8,9. Estas propiedades subrayan el amplio potencial de aplicación de la SQ en el desarrollo de sistemas de liberación de fármacos.

Para mejorar la diversión tumoral, este estudio emplea ácido fólico (FA) como ligando objetivo. La A es una vitamina soluble en agua crucial para el metabolismo de un carbono, la biosíntesis10, la homeostasis redox11 y las reacciones demetilación 12. La conjugación de la FA a través de sus grupos carboxilo con el nanoportador permite el reconocimiento y la unión específicos al receptor de folato (FR), seguida de la endocitosis mediada porel receptor 13. Aprovechando el mayor efecto de permeabilidad y retención de las células tumorales, Zheng et al.14 evaluaron la expresión del receptor de α de folato (FRα) en cáncer de páncreas, páncreas normal, tejidos adyacentes y pancreatitis crónica utilizando Western blot e inmunohistoquímica, y analizaron su correlación con características clinicopatológicas. FRα se expresó en el 94,7% (72/76) de los casos de cáncer de páncreas, correlacionado con metástasis, pero estuvo ausente en los tejidos pancreáticos normales. Las nanopartículas modificadas con FA pueden acumularse selectivamente en tejidos FR-positivos, permitiendo terapias molecularmente dirigidas.

La quidamida (CHI) es un novedoso inhibidor de la histona desacetilasa. Los estudios preclínicos han demostrado que también muestra una potente actividad antitumoral contra tumores sólidos como el cáncer de páncreas y de mama, y puede revertir la resistencia a fármacos en célulastumorales 15,16. Sin embargo, su fuerte hidrofilitía se asocia con una baja eficiencia de penetración en el microambiente tumoral y una mala distribución en los tejidos tumorales sólidos, lo que limita severamente su potencial terapéutico clínico para el cáncerde páncreas 5. Utilizando la chidamida (CHI) como fármaco modelo, este estudio propone la preparación de nanopartículas autoensambladas mediante la conjugación de CHI con SQ y la posterior modificación con FA. Esta estrategia tiene como objetivo mejorar la eficacia antitumoral del IC frente al cáncer de páncreas superando su mala penetración en el microambiente tumoral y su distribución subóptima dentro del tejido tumoral sólido. Además, al evaluar la eficacia in vitro del CHI en líneas celulares de cáncer de páncreas, se espera que este enfoque mejore significativamente la penetración y los efectos citotóxicos del CHI —un fármaco representativo hidrofílico de moléculas pequeñas— en el microambiente tumoral pancreático, proporcionando así una base experimental para guiar la terapia basada en CHI en el cáncer de páncreas.

Nuestro estudio detalla los procedimientos experimentales para preparar nanopartículas de profármaco autoensambladas CHI-SQ-PEG-FA para el tratamiento del cáncer de páncreas. Específicamente, describimos la optimización y caracterización del proceso de preparación para nanopartículas CHI-SQ-PEG-FA, junto con estudios de liberación in vitro de fármacos. El proceso implica: primero, optimizar la formulación mediante un enfoque experimental de un solo factor y determinar el tamaño óptimo de partículas y la carga de fármacos; segundo, caracterizar las nanopartículas mediante ensayos UPLC y MTS; y finalmente, establecer un modelo de esferoides tumorales co-cultivados in vitro . Utilizando la cumarina-6 (C6) como sonda fluorescente en nanopartículas dirigidas, validamos aún más la penetración y distribución de las nanopartículas dentro de esferoides tumorales tridimensionales y obtenemos datos relevantes.

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Protocol

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1. Síntesis de SQ-CHI y SQ-PEG-FA

  1. Síntesis de SQ-CHI: Pesa 120,4 mg (0,3 mmol) de ácido 1,1',2-tris-norsqualenoico y disuelve en 1 mL de N, N-Dimetilformamida (DMF). Añadir secuencialmente NHS (46 mg, 0,4 mmol) y EDCI (72 mg, 0,38 mmol) y permitir que la reacción continúe durante 90 minutos bajo protección con nitrógeno.
  2. Disuelve la quidamida (58,56 mg, 0,15 mmol) en 1 mL de DMF y añádela gota a la mezcla de la reacción. Agitar la reacción a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno durante 72 horas.
  3. Tras la finalización, evaporar el disolvente a presión reducida a 5-15 kPa para obtener el producto crudo. Purificar el producto bruto mediante cromatografía en columna flash usando una elución degradada de DCM/MeOH (99:1, 99:5, 85:5).
  4. Verificación estructural de SQ-CHI: Coloque el producto sintetizado de SQ-CHI en un vial de vidrio y séquelo al vacío en un desecador durante 24 horas. Disuelva el producto en aproximadamente 1 mL de cloroformo deuterado (CDCl 3) y transfiera a un tubo de muestra de RMN. Realizar un análisis RMN de 1H para confirmar la estructura química delproducto 17.
  5. Síntesis de SQ-PEG-FA: Disolver 41,12 mg de ácido 1,1',2-trisqualenoico en 35 μL de DMF. Añadir secuencialmente N-hidroxisuccinida (NHS, 15,71 mg) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI, 24,59 mg) a esta solución.
  6. Permite que la reacción continúe durante 90 minutos bajo una atmósfera de nitrógeno. Disuelve 20 mg de FA-PEG-NH2 en 35 μL de DMF y añádelo gota a la mezcla de la reacción.
  7. Remueve la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 72 horas bajo nitrógeno. Purifica el producto crudo con un tubo de centrifugación de ultrafiltración MWCO de 3 kDa a 5.200 x g durante 30 minutos para eliminar el ácido libre no reaccionado. Coloca la solución acuosa purificada del complejo SQ-PEG-FA en un vial de vidrio y precongela a -50 °C. Liofilizar la solución precongelada en un liofilizador para obtener el complejo SQ-PEG-FA como polvo liofilizado.

2. Verificación estructural de SQ-PEG-FA

  1. Coloque el complejo SQ-PEG-FA liofilizado en un tubo centrífugo de 2 mL y seque aún más bajo vacío en un desecador durante 24 horas. Disuelva el producto en aproximadamente 1 mL de dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d 6) y transfiere a un tubo de muestra de RMN. Realizar un análisis de RMN de 1H para confirmar la estructura química del complejo.
  2. Optimización de la preparación y caracterización de los NPs SQ-CHI-PEG-FA
  3. Pesa 6,64 mg de SQ-CHI y disuelve en 2 mL de etanol absoluto para preparar una solución de 3,32 mg/mL (4,3 μM).
  4. Añadir la solución etanolica de SQ-CHI (1, 0,2, 0,1 o 0,05 mL) gota a gota a 1 mL de agua desionizada bajo agitación. Remueve durante 5 minutos y luego elimina el etanol mediante evaporación a presión reducida. Sonica la mezcla resultante durante 30 minutos para obtener una suspensión de nanopartículas CHI-SQ. Mide el diámetro hidrodinámico y el índice de polidispersión (PDI) de las nanopartículas con un Zetasizador para identificar la formulación óptima18.
  5. Añade 0,1 mL de solución etanolica SQ-CHI en modo vertical a 1 mL de agua desionizada tras diferentes duraciones de agitación (0, 5, 10 o 20 min). Tras el respectivo periodo de agitación, se elimina el etanol mediante evaporación reductora de presión, seguida de una sonicación durante 30 minutos para obtener suspensiones de nanopartículas CHI-SQ. Mide el diámetro hidrodinámico y la PDI para determinar el tiempo óptimo de agitación.
  6. Añade 0,1 mL de solución etanolica SQ-CHI en caída a 1 mL de agua desionizada bajo remoción durante 5 minutos. Después de agitar, elimina el etanol mediante evaporación reducida de presión. Sonicar la mezcla resultante durante diferentes duraciones (0, 5, 20 o 30 minutos) para obtener suspensiones de nanopartículas CHI-SQ. Mide el diámetro hidrodinámico y el PDI para determinar el tiempo óptimo de sonicación.
  7. Confirma las condiciones óptimas basándote en los resultados anteriores. Aquí, la relación de volumen obtenida entre agua y solución original = 10:1, tiempo de agitación = 5 minutos y tiempo de sonicación = 30 minutos. Repite todos los experimentos de forma independiente en triplicado para garantizar la fiabilidad.
  8. Utiliza el método de un solo factor manteniendo los demás parámetros constantes. Varían secuencialmente los siguientes factores para evaluar su impacto en la distribución del tamaño de las partículas y el potencial Zeta de las nanopartículas: la relación de masas de los componentes (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0,05, 1:0,5, 1:0,7), la relación fase-volumen (fase acuosa: fase orgánica = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20) y el tiempo de sonicación (5, 15, 30, 45 min).
  9. Según el protocolo optimizado, mezclar las soluciones estándar SQ-CHI y SQ-PEG-FA en la proporción determinada. Añade esta mezcla gota a gota en agua desionizada bajo una agitación constante. Sigue removiendo durante 5 minutos para asegurarte de que se mezcla bien. Eliminar etanol mediante evaporación reducidora de presión, seguida de sonicación con sonda durante 30 minutos para obtener la suspensión final de nanopartículas CHI-SQ-PEG-FA.
  10. Mide el diámetro hidrodinámico, la distribución de tamaño (PDI) y el potencial Zeta de las nanopartículas utilizando dispersión dinámica de luz con un analizador láser de tamaño de partículas. Observa la morfología de las nanopartículas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, aumento de 150.000x) y microscopía electrónica de barrido (SEM, aumento de 80.000x).
  11. Determinación del contenido de carga de fármacos mediante cromatografía líquida de ultrarendimiento (UPLC)
  12. Establecer las condiciones cromatográficas de la siguiente manera: columna C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm); Fase móvil: 0,1% de Solución acuosa de ácido fórmico - acetonitrilo (75:25, V/V); longitud de onda de detección: 258 nm; caudal: 0,2 mL/min; temperatura en columna: 23 °C; volumen de inyección: 5 μL; duración: 10 min.
  13. Reconstituye la suspensión CHI-SQ-PEG-FA NP y centrifuga a 7.500 x g durante 30 minutos. Recoge el sobrenadante y filtrarlo a través de una membrana microporosa de 0,22 μm. Utiliza el filtrado resultante como solución de prueba. Inyectar y analizar la solución de prueba bajo las condiciones cromatográficas especificadas. Calcula el contenido de carga de fármacos de las nanopartículas basándose en la concentración de CHI medida en el filtrado.

3. Estudio de liberación in vitro de fármacos

  1. Pipetear con precisión una alícua de 2 mL de una solución de CHI recién preparada o de la suspensión de nanopartículas CHI-SQ-PEG-FA en una bolsa de diálisis con un corte de peso molecular de 3 kDa.
  2. Sumerge la bolsa de diálisis en el medio liberador que contiene diferentes concentraciones de pancreatina (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). En intervalos de tiempo predeterminados (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), extrae 1 mL de muestras del medio de liberación y reempláctalas inmediatamente por un volumen igual de medio fresco precalentado para mantener las condiciones de hundimiento.
  3. Determinar la concentración de CHI en todas las muestras utilizando el método UPLC (condiciones cromatográficas especificadas en la sección 3) y calcular la liberación acumulada del fármaco.
  4. Utiliza un buffer de acetato de amonio (pH 4,5) como medio liberador. Pipetear con precisión 2 mL de la suspensión de nanopartículas en una bolsa de diálisis (3 kDa). Añade diferentes unidades de actividad (0, 0,7, 1,4, 2,8 U) de catepsina B directamente en la bolsa de diálisis. Sumerge la bolsa en 40 mL de medio liberador e incubala en un agitador de temperatura constante a 37 ± 0,5 °C y 75 rpm. En los momentos predeterminados (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), extrae 1 mL de muestras y reemplácelas inmediatamente por un volumen igual de medio fresco, precalentado, al mismo pH para mantener el equilibrio del sistema.
  5. Filtrar las muestras recogidas a través de una membrana microporosa de 0,22 μm. Analizar los filtrados mediante UPLC para determinar la concentración del fármaco. Calcula el porcentaje acumulado de liberación de CHI y traza los perfiles de liberación de fármacos.
  6. Pipetear con precisión una alicuota de 2 mL de la solución original de CHI o de la suspensión CHI-SQ-PEG-FA NP en una bolsa de diálisis (MWCO de 3 kDa). Sumerge la bolsa de diálisis en el medio liberador que contiene diferentes concentraciones de pancreatina (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). En los tiempos predeterminados (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), extraer 1 mL de muestras y sustituirlas inmediatamente por un volumen igual de medio de liberación fresco y precalentado para mantener las condiciones de sumergimiento.
  7. Cuantifica la concentración de fármacos en las muestras mediante UPLC. Calcula la liberación acumulada del fármaco y genera las curvas de liberación.
  8. Evaluación de la estabilidad de nanopartículas en PBS
  9. Mezcla los NPs chi-cuadrado-peg-fa con PBS (pH 7,4) en una proporción de 1:20 (v/v). Incuba la mezcla en un agitador de temperatura constante a 37 ± 0,5 °C y 100 rpm. Tomen muestras en 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 h para medir el diámetro hidrodinámico y el potencial Zeta.
  10. Ensayo de proliferación celular mediante el método MTS
  11. Las células de cáncer de páncreas PSN-1 se cultivaron en medio completo de RPMI-1640. Las células en fase de crecimiento logarítmico se extrajeron mediante digestión con 0,25% de tripsina a 37 °C y se resuspendieron a una densidad de 4-6 x10 4 células/mL en medio completo. La suspensión se sembró en placas de 96 pozos a 100 μL por pozo, y se precultivaron durante 2 horas enuna incubadora de 37 °C y 5% de CO 2 para permitir la adherencia celular completa.
  12. Aspira el medio de cultivo original. Establecer un grupo de control (medio de cultivo en blanco) y múltiples gradientes de concentración de grupos quidamidas (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM), con tres pozos replicados por grupo. Añade 100 μL de medio en blanco o que contenga fármacos a cada pozo, y luego transfiere la placa celular a la incubadora para continuar el cultivo. Tratar los grupos experimentales con 100 μL de medio fresco que contenga concentraciones variables (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) de SQ-PEG, CHI LIBRE, CHI-SQ-PEG NPs o CHI-SQ-PEG-FA NPs, mientras que el grupo de control recibe un volumen igual de medio en blanco. Tras una incubación adicional durante 96 horas, se retira el medio que contiene fármaco de cada pozo.
  13. Añadir 20 μL de solución de trabajo MTS a cada pozo, seguido de incubación durante 4 horas. Agita la placa de 96 pozos durante 15 s para asegurar la homogeneidad y mide inmediatamente la absorbancia (valor A) de cada pozo a una longitud de onda de 490 nm usando un lector de microplacas. Calcular la tasa de proliferación celular restando el valor OD del grupo en blanco del valor OD del grupo tratado con fármacos, dividiendo el resultado entre el valor OD del grupo medio en blanco y el valor OD del grupo en blanco, y luego multiplicando por 100.
  14. Establecimiento de un modelo de esferoides tumoral co-cultivado in vitro
  15. Mezclar células PSN-1 en la fase de crecimiento logarítmico con células HPSC en una proporción 2:7 y sembrarlas en placas de 96 pozos de ultra baja unión con una densidad de 5.000 células por pozo. Tras la formación de los esferoides tumorales, tratar los esferoides con diferentes nanoformulaciones (NPs marcados con CHI-SQ-PEG/C6 y CHI-SQ-PEG-FA/CN6 NPs) o DMSO (como control) y coincubarlos durante 48, 96 y 144 horas para evaluar la eficacia del fármaco.
  16. Tras la incubación, añade un volumen igual de reactivo de ensayo de viabilidad celular a cada pozo. Coloca el plato sobre un agitador orbital y agita durante 15 minutos para asegurar una lisis completa, seguido de la incubación a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
  17. Transfiere el lisato celular a una placa negra de 96 pozos. Mide la señal de quimioluminiscencia a una longitud de onda de 562 nm usando un lector de microplacas multifuncional para cuantificar la viabilidad celular.
  18. Investigación de la absorción celular de nanopartículas
  19. Preparar nanopartículas dirigidas (CHI-SQ-PEG-FA/CN6 NPs) y nanopartículas no dirigidas (CHI-SQ-PEG/C6 NPs) que incorporen cumarina-6 (C6) como sonda fluorescente. Rutinariamente cultiva células PSN-1 en la fase de crecimiento logarítmico durante 24 horas para formar una monocapa. Disolver la cumarina 6 en etanol para preparar una solución de fondo de 200 μg/mL. Mezclar 10 μL de la solución con SQ-CHI y SQ-PEG-FA (o SQ-PEG) en una proporción de 1:0,7, y luego inyectar gota a gota en agua desionizada bajo agitación. Remueve durante 5 minutos, elimina el etanol por evaporación y sonica durante 30 minutos. Finalmente, purifica mediante ultrafiltración (3 kDa, 12.000 rpm, 20 min) para obtener los objetos.
  20. Trate las células de la siguiente manera: los grupos experimentales reciben un medio libre de suero que contiene C6 libre, CHI-SQ-PEG/CN NN o CHI-SQ-PEG-FA/CN (con una concentración final de CHI de 5 μmol/L y una concentración de C6 de 2,6 μmol/L), mientras que el grupo control recibe un volumen igual de medio en blanco.
  21. Tras la incubación durante 4, 12 y 24 horas, aspira el medio que contiene el fármaco. Núcleos de células de tinte usando 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)19.
  22. Realizar observaciones bajo un microscopio de fluorescencia (40x, longitud de onda de excitación Ex=360 nm, longitud de onda de emisión Em=477 nm). Evalúa la captación celular de nanopartículas midiendo la intensidad de fluorescencia de la cumarina-6.

4. Análisis estadístico

  1. Realizar todos los experimentos con un mínimo de 3 réplicas para obtener los datos presentados en este estudio. Analiza estadísticas usando el software GraphPad Prism. Presentar los datos experimentales como media ± error estándar de la media (DS), y comparar entre grupos utilizando la prueba t de Student, ANOVA unidireccional o prueba de Wilcoxon cuando corresponda. Fija el umbral de significación estadística en P < 0,05.

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Results

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Este estudio diseñó y evaluó con éxito con éxito un novedoso sistema dirigido de administración de nanofármacos: las nanopartículas autoensambladas basadas en profármacos por escualenilación de chidamida (CHI-SQ-PEG-FA NN; Figura 1). Sintetizamos las NPs CHI-SQ-PEG-FA (Figura 2) y evaluamos sistemáticamente los efectos de varios parámetros, incluyendo la relación de fase aceite-agua (Figura 3A), la ...

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Discussion

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Este estudio ofrece una guía práctica paso a paso para implementar un sistema de cintura baja basado en el autoensamblaje de nanopartículas. Las nanopartículas autoensambladas obtenidas en este estudio mostraron una forma esférica regular, buena dispersión, tamaño de partícula uniforme, alta eficiencia en la carga y encapsulación de fármacos, y demostraron una estabilidadsatisfactoria 21. Se empleó un modelo 3D de cocultivo de esferoides tumorales (PSN-1/HPSC) par...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran conflictos de interés.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (LZ23H290001, LY19H280001); subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82474338 y 82274364); Programa de Colaboración en Ciencia y Tecnología Agrícola de la Provincia de Zhejiang (2025SNJF075); así como el Proyecto de Investigación en Bienestar Público de Huzhou Science and Technology Grand (2021GZ261); así como el Proyecto General de Investigación Científica del Departamento de Educación de la Provincia de Zhejiang (Y202456442, 2025YKJ10).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% tripsina-EDTAGibco (EE. UU.)25200072
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida cloruro (EDCI)Sigma-Aldrich (EE. UU.)E6383
Viales criogénicos de 2 mLCorning (EE. UU.)430488
Placas de cultivo celular de 96 pozosCorning (EE. UU.)3598
etanol absolutoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)100092680
AcetonaChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)32201-2.5L
acetonitriloTedia (EE. UU.)A998-4Grado HPLC
Acetato de amonioChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10002861
Sulfato de sodio anhidroSigma-Aldrich (EE. UU.)31481
Gabinete de seguridad biológicaThermo Fisher Scientific, EE. UU.1380, 1332, 1356
Frascos de cultivo celularCorning (EE. UU.)CLS430372
Incubadora de cultivos celularesThermo Fisher Scientific, EE. UU.HERA51901126
Chidamida (CHI)Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (China)pureza >95%
Lector de microplacas multimodo Cytation 5BioTek, EE. UU.CYT5MV
Agitador termostatático de calefacción magnética DF-101SZhengzhou Kechuang Instrument Co., Ltd., China
diclorometanoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)80047318
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich (EE. UU.)D2650
dioxanoAladdín (China)D116156-5 ml
Medio DMEMGibco (EE. UU.)12100046
Solución fisiológica tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)Gibco (EE. UU.)14040141
Acetato de etiloChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10009460
éter etílicoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
FA2004B Balance electrónicoShanghai Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., ChinaFA2004B
Suero fetal bovino (FBS)Gibco (EE. UU.)10099141C
folato-poli(etilenglicol)-amina (FA-PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)PS2-NFA-2000
Ácido fórmicoAladdín (China)F112034Grado HPLC
LiofilizadorThermo Fisher Scientific, EE. UU.
Catepsina B humanaSigma-Aldrich (EE. UU.)SRP0289
Líneas celulares de cáncer de páncreas humano (PSN-1, CFPAC-1)la Colección de Cultura de Tipo Americano (ATCC)CRL-3211, CRL-1918
células estrelladas pancreáticas humanas (HPaStec, HPSC)la Colección de Cultura de Tipo Americano (ATCC)
Tripsina humanaSigma-Aldrich (EE. UU.)
Ácido clorhídricoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)CFSR-10011008
Microscopio invertidoOlympus, JapónIX83
Medio Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM)Gibco (EE. UU.)12440053
IX 1000 mezclador de vórtices & nbsp;Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., ChinaIX 1000
MetanolChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)M433287-10L
metanol Tedia (EE. UU.)MS1922-001Grado HPLC
Tubos de microcentrífuga (1,5/2,0 mL)Axygen (EE. UU.)MCT-150-C
micropipetas (20, 100 y 1000 y mu; L)Thermo Fisher Scientific, EE. UU.4642050, 4642070, 4642090
Sistema de purificación de agua Mill-Q Millipore, EE. UU.ZR0Q00800
  Kit de ensayo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenilo)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio)Promega (EE.UU.)G3582
N,N-Dimetilformamida (DMF)Aladdín (China)
N-bromosuccinimida (NBS)Sigma-Aldrich (EE. UU.)B81255
N-Hidroxisuccinida (NHS)Sigma-Aldrich (EE. UU.)56480
Optima Max ultracentrífuga  Beckman, EE. UU.393490
Solución de penicilina/estreptomicinaGibco (EE. UU.)15140-122
ácido periódicoSigma-Aldrich (EE. UU.)P7875
Éter de petróleoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
Metasulfato de fenazina (SPM)Sigma-Aldrich (EE. UU.)3180806
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco (EE. UU.)70011069
Poli(etilenglicol)-amina (PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)PG2-AM-20k
Medio RPMI-1640Gibco (EE. UU.)31800022
Polvo de gel de síliceSigma-Aldrich (EE. UU.)53698Malla 300
Bicarbonato de sodioSigma-Aldrich (EE. UU.)401676
Cloruro de sodioChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10019318
Dicromato de sodio dihidratadoSigma-Aldrich (EE. UU.)1.93689
EscualenoSigma-Aldrich (EE. UU.)Y0002131
tubos centrífugos estériles (15 y 50 mL)Corning (EE. UU.)430791, 430828
Ácido sulfúricoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10021618
TetrahidrofuranoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)34865-4X4LGrado analítico
tubos centrífugos de ultrafiltración (corte de peso molecular: 3,5 kDa)Beckman, EE. UU.344088

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