Este protocolo proporciona un enfoque detallado para evaluar los niveles de modificación de m6Ade ARN específico utilizando MeRIP-qPCR.
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Artículo de método
Ensayo MeRIP-qPCR para detectar niveles de modificación m6A de ARN específico en células osteosarcoma
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La modificación epitranscriptómica del ARN desempeña un papel fundamental en la iniciación y desarrollo de diversos tipos de cáncer, entre los cuales la N 6-metiladenosina (m6A) es la modificación más prevalente y funcionalmente diversa. Aquí presentamos un protocolo simplificado y reproducible utilizando MeRIP-qPCR para evaluar los niveles de modificación de m6Ade transcritos específicos en células osteosarcoma. En este ensayo, se extrajo ARN total, seguido de incubación con un anticuerpoanti-m6A específico para la modificación de ARN de inmunocaptura de la modificación m6A. Después, el ARN se fragmentó y se logró el enriquecimiento de fragmentos de ARN modificados con m6A utilizando perlas magnéticas de proteína G. El ARN enriquecido fue liberado por digestión de la proteinasa K y purificado por perlas que se unen al ARN. Por último, el ARN fue sometido a transcripción inversa y reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (PCR) para evaluar los niveles de m6Aen genes candidatos. Los resultados han demostrado que este método distingue eficazmente las diferencias de metilación y proporciona una herramienta fiable para explorar los mecanismos funcionales de la modificación de lam6Aen células osteosarcoma. En conclusión, MeRIP-qPCR ofrece un enfoque sencillo y altamente específico para estudiar la modificación de m6Aen células osteosarcoma. Este protocolo tiene un gran potencial para elucidar redes reguladoras de m6Ae identificar nuevos objetivos terapéuticos.
Introducción
Las últimas investigaciones sobre epitranscriptoma revelan que la modificación delARN N 6-metiladenosina (m6A), la metilación de la posición N6 en la adenosina, es la modificación química intrínseca más abundante conocida del ARNm en célulaseucariotas 1. m6A está involucrado en una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo la estabilidad del ARNm, el empalme, la exportación nuclear y la eficiencia de la traducción2. Es importante destacar que la evidencia acumulada sugiere que la desregulación de la modificación m6Acontribuye al....
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Protocolo
1. Preparación del ARN
NOTA: La extracción de ARN se realiza utilizando un kit de extracción de ARN. Trabaja dentro de un armario de bioseguridad limpio al manipular células y reactivos de ARN. Lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes, gafas de protección). Preenfría la centrífuga a 4 °C antes de arrancar.
- Prepara las celdas.
- Retira el medio de cultivo de la bandeja de 3,5 cm y lava suavemente las células una vez con PBS preenfriado. Añade un volumen adecuado de tampón de lisis de ARN directamente al plato para lisar completamente l....
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Resultados
Aquí proporcionamos un resultado representativo del análisis MeRIP-qPCR, el nivel demodificación m6A de c-Myc en las células hFOB1.19 y 143B. Como se muestra en la Figura 2, el enriquecimiento de c-Myc con anticuerpo anti-m 6 A fue significativamente mayor en comparación con el control de IgG, que solo mostró niveles de fondo, lo que sugiere que el anticuerpo anti-m6A es tanto eficaz como específico. También observamos que el.......
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Discusión
MeRIP-qPCR ha surgido como una herramienta valiosa para estudiar modificaciones de ARN m6Acon amplias aplicaciones. Es especialmente útil para validar resultados de secuenciación de alto rendimiento y localizar sitios de modificación con precisión dentro de regiones específicas de genes objetivo durante estudios mecanicísticos. Además, este método puede implementarse fácilmente en la mayoría de los laboratorios de biología molecular debido a su coste relativamente bajo y simpl.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio contó con el apoyo de subvenciones de la National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 y 82205145).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100% etanol | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd., América | 1158566 | |
| 143B | ATCC, América | ATCC CRL-8303TM | |
| 2 y veces; SYBR Mezcla verde qPCR | Beijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., China | FS-Q1002 | |
| Denovix DS-11 | Denovix | DS-11 | Espectrofotómetro |
| Medio DMEM | WISENT CORPORATION, China | 319-005-CL | |
| DMEM/F-12 medio | Gibco, América | 11320033 | |
| EpiQuik CUT& Kit de enriquecimiento de ARN RUN m6A (MeRIP) | Epigentek, América | P-9018-24 | |
| Suero fetal bovino | WISENT CORPORATION, China | 086-150 | |
| hFOB1.19 | Banco de Células de la Academia China de Ciencias, China | GNHu14 | |
| Kit de ensayo de metilación de ARN m6A | Abcam, Inglaterra | ab185912 | |
| Kit de transcripción inversa de microARN | EZBioscience-EZB, América | A0010CGQ | |
| Sistema en tiempo real | BIO-RAD, América | CFX96 | |
| Kit de extracción total de ARN | EZBioscience-EZB, América | B0004DP | |
| Enzima TrypLE Express | Gibco, América | 12604021 |
Referencias
- Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
- Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during ....
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Reimpresiones y permisos
