Ensayo MeRIP-qPCR para detectar niveles de modificación m6A de ARN específico en células osteosarcoma

Binghan Yan; Junli Chang; Suxia Guo; Peng Zhao; Fulai Zhao; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Mengchen Yin; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69880

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Artículo de método

Ensayo MeRIP-qPCR para detectar niveles de modificación m⁶A de ARN específico en células osteosarcoma

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DOI:

10.3791/69880

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30 de diciembre de 2025

Binghan Yan^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Suxia Guo¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Mengchen Yin¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona un enfoque detallado para evaluar los niveles de modificación de m^6Ade ARN específico utilizando MeRIP-qPCR.

Resumen

La modificación epitranscriptómica del ARN desempeña un papel fundamental en la iniciación y desarrollo de diversos tipos de cáncer, entre los cuales la N 6-metiladenosina (m⁶A) es la modificación más prevalente y funcionalmente diversa. Aquí presentamos un protocolo simplificado y reproducible utilizando MeRIP-qPCR para evaluar los niveles de modificación de m^6Ade transcritos específicos en células osteosarcoma. En este ensayo, se extrajo ARN total, seguido de incubación con un anticuerpo^anti-m6A específico para la modificación de ARN de inmunocaptura de la modificación m^6A. Después, el ARN se fragmentó y se logró el enriquecimiento de fragmentos de ARN modificados con m⁶A utilizando perlas magnéticas de proteína G. El ARN enriquecido fue liberado por digestión de la proteinasa K y purificado por perlas que se unen al ARN. Por último, el ARN fue sometido a transcripción inversa y reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (PCR) para evaluar los niveles de m^6Aen genes candidatos. Los resultados han demostrado que este método distingue eficazmente las diferencias de metilación y proporciona una herramienta fiable para explorar los mecanismos funcionales de la modificación de la^m6Aen células osteosarcoma. En conclusión, MeRIP-qPCR ofrece un enfoque sencillo y altamente específico para estudiar la modificación de m^6Aen células osteosarcoma. Este protocolo tiene un gran potencial para elucidar redes reguladoras de m^6Ae identificar nuevos objetivos terapéuticos.

Introducción

Las últimas investigaciones sobre epitranscriptoma revelan que la modificación del^{ARN N} 6-metiladenosina (m⁶A), la metilación de la posición N⁶en la adenosina, es la modificación química intrínseca más abundante conocida del ARNm en células^{eucariotas 1}. m⁶A está involucrado en una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo la estabilidad del ARNm, el empalme, la exportación nuclear y la eficiencia de la traducción². Es importante destacar que la evidencia acumulada sugiere que la desregulación de la modificación m^6Acontribuye al inicio y desarrollo de varios tipos de cáncer, incluido el osteosarcoma, un tumor óseo maligno altamente agresivo que afecta principalmente a adolescentes y adultos^jóvenes.

El estudio de la modificación m^6Arequiere metodologías robustas y fiables. Se han desarrollado varios enfoques para detectar niveles de modificación de m⁶A, incluyendo m⁶A dot blot, m⁶A ELISA y MeRIP-seq. El ensayo de mancha de punto m⁶A es sencillo y rentable, pero sufre de sensibilidad limitada y una cuantificación deficiente. Proporciona el nivel de modificación^{m 6}A del ARN total, en lugar del^{nivel de}modificación m 6 A de un^{ARN 4} específico. m⁶A ELISA ofrece una detección relativamente conveniente y de alto rendimiento; Sin embargo, la reactividad cruzada y la baja precisión siguen siendo preocupaciones importantes, y de forma similar carece de la capacidad de revelar modificaciones específicas de transcripción^{o de sitio 5}. MeRIP-seq permite el mapeo a nivel de transcriptoma de m⁶A; sin embargo, sus requisitos para una gran entrada de ARN, resolución relativamente baja y dependencia de anticuerpos limitan la precisión y reproducibilidad^{MeRIP-seq 6}. En cambio, MeRIP-qPCR combina inmunoprecipitación con PCR cuantitativa, proporcionando mayor sensibilidad y especificidad para la detección dirigida de m^6Aen ARN⁷ específico. Este método permite la detección sensible y dirigida del enriquecimiento diferencial de m6A en genes candidatos, lo que lo hace especialmente adecuado para estudios de validación en investigación relacionada con el cáncer relacionado con m6A. Este método ofrece una alternativa rentable y accesible para los laboratorios que buscan investigar mecanismos regulatorios mediados por m6A.

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado (Figura 1) para evaluar los niveles de modificación m^6Ade c-Myc en células osteosarcomas usando como ejemplo MeRIP-qPCR. MeRIP-qPCR, que se basa en el enriquecimiento basado en anticuerpos de fragmentos de ARN metilado, también combinado con transcripción inversa y PCR cuantitativa, evalúa la presencia y abundancia relativa de m^6Aen ARN específico. Demostramos que este enfoque distinguía eficazmente las diferencias de metilación de c-Myc y proporcionaba una plataforma fiable para investigar el papel funcional de^m6Aen las células osteosarcoma. Este estudio destaca el potencial de MeRIP-qPCR como herramienta práctica y específica para la investigación sobre la modificación de la^m6Aen osteosarcoma y prepara el terreno para identificar nuevos objetivos terapéuticos.

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Protocolo

1. Preparación del ARN

NOTA: La extracción de ARN se realiza utilizando un kit de extracción de ARN. Trabaja dentro de un armario de bioseguridad limpio al manipular células y reactivos de ARN. Lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes, gafas de protección). Preenfría la centrífuga a 4 °C antes de arrancar.

Prepara las celdas.
1. Retira el medio de cultivo de la bandeja de 3,5 cm y lava suavemente las células una vez con PBS preenfriado. Añade un volumen adecuado de tampón de lisis de ARN directamente al plato para lisar completamente las células y pipeteo suavemente para homogeneizar.
2. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Centrifugar a 1000 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  NOTA: Asegúrese de que el rotor esté equilibrado y la tapa bien cerrada.
4. Saca cuidadosamente el tubo de la microcentrífuga después de la centrifugación.
5. Aspira completamente el sobrenadante usando una pipeta de 1 mL sin alterar el pellet en el fondo.
  NOTA: No toques la pellet celular con la punta de la pipeta.
Células de lisis.
1. Añade 300 μL de Lysis Buffer al pellet celular.
2. Mezcla bien invirtiendo el tubo 30 veces hasta que la solución parezca clara y viscosa, sin grumos visibles.
3. Incuba el tubo a temperatura ambiente durante 2 minutos.
ARN precipitado.
1. Añadir 300 μL de etanol al 100% al lisado (igual volumen de tampón de lisis).
2. Pipetea suavemente arriba y abajo inmediatamente (unas 8-10 veces) para mezclar bien.
Realiza la unión a columnas de ARN.
1. Coloque una columna de purificación de ARN en un tubo de recogida de 2 mL proporcionado.
2. Transfiere toda la mezcla a la columna de purificación.
  NOTA: Evita tocar la membrana blanca en el centro.
3. Cierra la tapa y centrifuga a 12.000 × g durante 1 minuto.
4. Desecha el líquido inferior y golpea suavemente el tubo de recogida boca abajo sobre papel absorbente para eliminar el líquido residual.
5. Devuelve la columna de purificación al tubo de recogida.
Lava las impurezas.
1. Añade 500 μL de Wash Buffer (agua libre de nucleasa) a la columna de purificación.
  NOTA: Evita tocar la membrana blanca en el centro.
2. Centrifuga a 12.000 × g durante 1 minuto y descarta el líquido inferior.
3. Centrifugar de nuevo a 12.000 × g durante 1 minuto para eliminar el líquido residual.
4. Transfiere la columna de purificación a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL.
5. Abre la tapa y deja la columna reposar 2 minutos a temperatura ambiente.
ARN eluto.
1. Coloca la columna de purificación en un nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Añade 25 μL de Elution Buffer directamente sobre el centro de la membrana.
3. Incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos.
4. Centrifugar a 12.000 × g durante 1 minuto para recoger ARN en el tubo inferior.
5. Reaplica el eluato a la membrana y centrifuga de nuevo a 12.000 × g durante 1 minuto para maximizar el rendimiento.
  NOTA: Siempre añadir el buffer de elución directamente sobre el centro de la membrana de la columna. Evita añadirlo a la pared lateral, ya que esto puede evitar que el ARN se disuelva y reducir considerablemente su rendimiento. Además, no perfores la membrana con la punta de la pipeta.
Mide la concentración de ARN.
1. Enjuaga el puerto de muestra del espectrofotómetro con 1,5 μL de Elution Buffer.
2. Utiliza 1,5 μL de Elution Buffer como blank. Confirma que la lectura está cerca de cero.
3. Carga 1,5 μL de muestra de ARN y mide la concentración.
4. Evaluar la calidad de las muestras de ARN utilizando un espectrofotómetro (A260/A280 = 1,8-2,2, A260/A230 = 2,0-2,5) y electroforesis en gel de agarosa.

2. Inmunoprecipitación de ARN metilado (MeRIP)

Preparación de la mezcla de inmunocaptura
1. Consigue un tubo PCR nuevo de 0,2 mL.
2. Añadir componentes como se indica en la Tabla 1 (ejemplo de una reacción).
Inmunocaptura
1. Cierra bien la tapa del tubo. Coloca el tubo de PCR en un rotador o agitador rodante.
2. Incuba a temperatura ambiente durante 90 minutos.
  NOTA: Asegúrese de que la solución se mezcle de forma continua y suave.
Escisión de ARN
1. Tras la incubación, añadir 10 μL de potenciador de digestión nuclear (ECM) y 2 μL de mezcla enzimática de escisión (CEM) a cada tubo.
2. Mezcla suavemente pipeteando arriba y abajo 5 o 6 veces.
3. Incuba a temperatura ambiente durante 4 minutos.
4. Preparación del control de ARN de entrada
  1. Para asegurar la consistencia entre la inmunoprecipitación (IP) y las muestras de entrada, procesa una porción de ARN en paralelo como control de entrada.
  2. Transfiere 1 μg de ARN total (10% de entrada) de cada muestra a un tubo de PCR separado. Añadir 20 μL de tampón de captura inmunológica (ICB), 1,5 μL de ECM, 1 μL de CEM e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
Enriquecimiento magnético y lavado
1. Coloca el tubo de PCR sobre un soporte magnético.
2. Deja reposar el tubo durante 2 minutos hasta que la solución se despeje y las perlas queden atrapadas en la pared del tubo.
3. Aspira cuidadosamente y descarta el sobrenadante sin mover las cuentas.
4. Mantén el tubo sobre un soporte magnético y añade 150 μL de buffer de lavado (WB).
5. Quita el tubo del soporte magnético e inclínalo boca abajo suavemente para volver a suspender completamente las cuentas.
6. Devuelve el tubo al soporte magnético. Espera 1-2 minutos hasta que la solución se elimine, luego descarta el sobrenadante.
7. Repite el paso de lavado tres veces.
8. Lava las perlas una vez más con 150 μL de Buffer de Digestión de Proteínas (PDB) usando el mismo método.
Liberación y recuperación de ARN enriquecido
1. Prepara la solución de digestión de proteínas mezclando la proteinasa K y la PDB en una proporción 1:9. (Para cada reacción, prepara 20 μL: 2 μL de Proteinasa K + 18 μL de PDB).
2. Quita el tubo del soporte magnético después del lavado final.
3. Añade 20 μL de solución de digestión de proteínas recién preparada al pellet de perlas y mezcla suavemente.
4. Coloca el tubo de PCR en un ciclador térmico e incuba a 55 °C durante 15 minutos.
5. Coloca el tubo de PCR de nuevo en el soporte magnético. Espera a que la solución se elimine (unos 2 minutos).
6. Transfiere cuidadosamente todo el sobrenadante (unos 20 μL) a un nuevo tubo PCR de 0,2 mL.
  NOTA: El ARN ahora está en el sobrenadante. Descarta las cuentas.
Purificación de ARN
1. Añade 20 μL de Solución de Purificación de ARN (RPS) a cada tubo de muestra, tubo de control negativo y tubo de entrada.
2. Añade 160 μL de etanol al 100%.
3. Cuentas de unión de ARN vórtice para resuspenderlas.
4. Añade 2 μL de perlas de unión de ARN resuspendidas a cada tubo.
5. Mezcla bien arriba y abajo al menos 10 veces.
6. Incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir la unión del ARN.
7. Coloca el tubo sobre el soporte magnético. Espera a que la solución se elimine (unos 2 minutos).
8. Descarta cuidadosamente el sobrenadante sin mover las cuentas.
9. Mantén el tubo sobre un soporte magnético y añade 150 μL de etanol al 90% recién preparado. Incuba durante 30 segundos.
10. Descarta el etanol al 90%. Repite el lavado con etanol al 90% una vez más (dos lavados en total).
11. Quita el tubo del soporte magnético.
12. Añade 13 μL de Elution Buffer a las cuentas secas.
13. Incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos para eluir ARN.
14. Coloca el tubo de nuevo en el soporte magnético. Espera a que la solución se elimine (unos 2 minutos).
15. Transfiere cuidadosamente todo el sobrenadante (unos 13 μL) a un nuevo tubo de PCR libre de RNasa.
16. Úsalo inmediatamente o almacena ARN a -20 °C.

3. RT-qPCR

Transcribe inversamente el ARN enriquecido con m⁶A en ADNc
1. Utiliza ARN purificado^{de m 6}A-IP, Input o grupo IgG para la transcripción inversa.
2. Establece la reacción de transcripción inversa (RT).
  NOTA: Asegurar una entrada de ARN igual en todos los grupos para permitir una comparación fiable en el análisis qPCR posterior.
Amplificación qPCR
1. Prepara reacciones qPCR usando la química verde SYBR. Añadir 10 μL de SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 μL de cebador directo (10 μM), 0,5 μL de cebador inverso (10 μM), 7 μL de_{ddH 2}O y 2 μL de ADNc a cada tubo, mezclar bien y centrifugar brevemente antes de cargar en el instrumento qPCR.
  NOTA: Establece tres pozos replicados para cada muestra de ADNc (Entrada, IgG, m⁶A-IP). Consulte la Tabla 2 para la lista de cebadores.
2. Ejecuta el programa qPCR.
  1. Realizar las reacciones qPCR en un ciclador térmico en tiempo real usando el siguiente programa: establecer la desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s; Ejecuta 40 ciclos que consisten en desnaturalización a 95 °C durante 15 s, recocido a 58 °C durante 10 s y extensión a 72 °C durante 30 s.
  2. Tras la amplificación, realizar un análisis de curva de fusión ajustando la desnaturalización a 95 °C durante 15 s, enfriando a 60 °C durante 1 minuto y luego aumentando gradualmente la temperatura hasta 95 °C a una velocidad de rampa de 0,5 °C/s con adquisición continua de fluorescencia para confirmar la especificidad de los productos amplificados.
Análisis de datos
1. Analizar los valores de Ct de los grupos objetivo y de control.
2. Calcula el enriquecimiento usando uno de los siguientes métodos:
  1. Métodos 1: % Método de entrada
    %Entrada = 2^{[Ct(Entrada)−Ct(IP)]}× DF × 100%
    NOTA: Ct (Entrada) y Ct (IP) representan los valores umbral del ciclo de las muestras de entrada e IP, respectivamente, y el factor de dilución (DF) es el recíproco de la fracción de entrada usada para qPCR (por ejemplo, si se usó el 10% del ARN total como entrada, entonces DF = 10).
  2. Métodos 2: Método comparativo de la Ct (método 2^^-ΔΔCt )
    _{ΔCt muestra}=_{Ct IP}−_{Ct IgG}
    Ct=ΔCt_{tratado−ΔCt control}, Fold=2^−ΔΔCt.
    NOTA: Mantén consistentes las cantidades de entrada de ARN, la configuración de la reacción y la eficiencia del cebador en todas las muestras.

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Resultados

Aquí proporcionamos un resultado representativo del análisis MeRIP-qPCR, el nivel de^{modificación m}6A de c-Myc en las células hFOB1.19 y 143B. Como se muestra en la Figura 2, el enriquecimiento de c-Myc con anticuerpo anti-m 6 A fue significativamente mayor en comparación con el control de IgG, que solo mostró niveles de fondo, lo que sugiere que el anticuerpo anti-m⁶A es tanto eficaz como específico. También observamos que el...

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Discusión

MeRIP-qPCR ha surgido como una herramienta valiosa para estudiar modificaciones de ARN m^6Acon amplias aplicaciones. Es especialmente útil para validar resultados de secuenciación de alto rendimiento y localizar sitios de modificación con precisión dentro de regiones específicas de genes objetivo durante estudios mecanicísticos. Además, este método puede implementarse fácilmente en la mayoría de los laboratorios de biología molecular debido a su coste relativamente bajo y simpl...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo de subvenciones de la National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 y 82205145).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100% etanol	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd., América	1158566
143B	ATCC, América	ATCC CRL-8303TM
2 y veces; SYBR Mezcla verde qPCR	Beijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., China	FS-Q1002
Denovix DS-11	Denovix	DS-11	Espectrofotómetro
Medio DMEM	WISENT CORPORATION, China	319-005-CL
DMEM/F-12 medio	Gibco, América	11320033
EpiQuik CUT& Kit de enriquecimiento de ARN RUN m6A (MeRIP)	Epigentek, América	P-9018-24
Suero fetal bovino	WISENT CORPORATION, China	086-150
hFOB1.19	Banco de Células de la Academia China de Ciencias, China	GNHu14
Kit de ensayo de metilación de ARN m⁶A	Abcam, Inglaterra	ab185912
Kit de transcripción inversa de microARN	EZBioscience-EZB, América	A0010CGQ
Sistema en tiempo real	BIO-RAD, América	CFX96
Kit de extracción total de ARN	EZBioscience-EZB, América	B0004DP
Enzima TrypLE Express	Gibco, América	12604021

Referencias

Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).
Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis. Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).
Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA. Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).
Yang, Y., et al. Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications. Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).
McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq. Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).
Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications. Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).
Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications. PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).
Law, J., Günther, S., Watanabe, S. Epitranscriptome mapping of N6-methyladenosine using m6A immunoprecipitation with high-throughput sequencing in skeletal muscle stem cells. Methods Mol Biol. 2640, 431-443 (2023).
Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS. STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).
Slama, K., et al. Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments. Methods. 156, 102-109 (2019).
Guo, W., et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms. Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).

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