Este protocolo experimental proporciona un método estable, rentable y eficiente que combina el knockdown de lncRNA con ensayos formadores de colonias para cuantificar el efecto del lncRNA en la proliferación celular del osteosarcoma.
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Artículo de método
Ensayo de formación de colonias que detecta la capacidad proliferativa de células de osteosarcoma por knockdown de ARNCn
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
La expresión aberrante de ARN largos no codificantes (lncRNAs) influye profundamente en la proliferación celular de las células osteosarcoma, lo que sugiere que pueden servir como posibles objetivos terapéuticos. Sin embargo, los estudios funcionales de los lncRNA siguen siendo en gran medida teóricos y limitados a unas pocas validaciones. Los ensayos de formación de colonias, que reflejan específicamente el destino final de proliferación de células individuales, se consideran el estándar de oro para evaluar el potencial proliferativo a largo plazo. Aquí, este protocolo estableció un protocolo experimental fiable utilizando ensayos de formación de colonias en células de knockdown de ARNnc para evaluar el efecto del ARNnC sobre la capacidad proliferativa de las células osteosarcoma. Este protocolo experimental proporciona un ensayo estable, rentable y eficiente para evaluar los efectos regulatorios del ARNn en la proliferación celular del osteosarcoma. Este enfoque no solo es adecuado para la investigación de células osteosarcoma, sino que también sirve como una herramienta viable para la capacidad proliferativa celular regulada por ARNCn en otros tumores. Este estudio incluyó un protocolo detallado de detección de ensayos de knockdown de RNA y formación de colonias, con un ejemplo de knockdown del gen 6 del hospedador de ARN nucleolar pequeño (SNHG6) en células osteosarcoma (143B). Los resultados experimentales confirmaron una supresión eficiente de la expresión de SNHG6, acompañada de una reducción notable tanto en el número como en el tamaño de las colonias. Estos hallazgos sugieren que SNHG6 es esencial para mantener el potencial proliferativo a largo plazo de las células osteosarcoma (143B).
Introducción
Los ARN largos no codificantes (lncARN), definidos como transcritos de más de 200 nucleótidos sin potencial codificante proteico, han emergido como reguladores importantes de diversos procesos biológicosen los últimos años 1,2. Juegan un papel fundamental en la iniciación y desarrollo de diversos tipos de cáncer, incluyendo osteosarcoma, cáncer de próstata y cáncer depulmón 3,4,5. En el osteosarcoma, la evidencia acumulada sugiere que la expresión aberrante de ARN largo no codificante (lncRNA) tiene una influencia profunda en la proliferación celular. Por ejemplo, silenciar el ARNnc POU3F3 suprimió significativamente la proliferación y promovió la apoptosis de células osteosarcoma (MG63 y U2OS)6. De manera similar, la reducción del ARNnc HOXA-AS3 redujo la formación de colonias e inhibió el crecimiento en células U2OS y SW13537. Dado que la proliferación descontrolada es una característica de la biología del cáncer y un determinante importante de las estrategias terapéuticas, elucidar la proliferación celular regulada por ARNnc en tumores, especialmente en el osteosarcoma, sigue siendo de gran importancia y necesidad.
Aunque existen varios enfoques para evaluar la proliferación celular, cada uno conlleva limitaciones inherentes. Los ensayos colorimétricos o metabólicos, como CCK-8 y MTT, son cómodos, rápidos y de alto rendimiento. Sin embargo, principalmente proporcionan lecturas a corto plazo y se confunden fácilmente con fluctuaciones metabólicas, además de tener riesgos adicionales de interferencia óptica o fotoquímica por los reactivosutilizados. Los métodos basados en síntesis de ADN, incluyendo la incorporación de BrdU y EdU, ofrecen mayor especificidad mientras se limitan a análisis instantáneos de la entrada en la fase S sin reflejar resultados proliferativos a largoplazo 9,10. De manera similar, la inmunotinción para marcadores de proliferación, como Ki-67, solo indica actividad instantánea del ciclo celular y no predice la capacidadclonogénica 10. Los sistemas de monitorización en tiempo real, como RTCA, permiten el análisis continuo de curvas de crecimiento con alta reproducibilidad, pero su alto coste y la restricción a la evaluación a corto o medio plazo reducen supracticidad 11. En cambio, el ensayo clonogénico captura de forma única la capacidad de una sola célula para sufrir una proliferación ilimitada y formar colonias visibles, reflejando así directamente su destino final. A pesar de ser laborioso y llevar mucho tiempo, el ensayo clonogénico sigue siendo el estándar de oro para evaluar el potencial proliferativo a largo plazo, ofreciendo conocimientos que son inalcanzables mediante ensayos a corto plazo osustitutos 12.
Aquí, este artículo incluye un protocolo detallado de detección para ensayos de knockdown de RNA y formación de colonias, con un ejemplo de knockdown por SNHG6 en células de osteosarcoma 143B. Este enfoque no solo es aplicable a la investigación del osteosarcoma, sino que también sirve como una herramienta viable para investigar la proliferación mediada por ARNnc en otros tumores.
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Protocolo
Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Transfección de plásmidos
- Semillas 5 × 105 células 143B por recipiente de cultivo de 10 cm (en total dos platos), cultivar las células en medio completo (DMEM + FBS 10%) a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
- Prepara los reactivos de transfección 24 horas después, incluyendo plásmidos (shNC y shSNHG6), PEI y Opti-MEM.
NOTA: Asegúrate de que todo esté equilibrado a temperatura ambiente antes de usarlo. - Saca cuatro tubos microcentrífugas de 1,5 mL, etiqueta los plásmidos (shNC y shSNHG6) y PEI (dos tubos) usando un rotulador.
- Añade 500 μL de Opti-MEM a cada tubo.
- Añadir 10 μg de plásmidos al tubo del plásmido (shNC o shSNHG6) y añadir 30 μL de PEI (1 μg/μL) a cada tubo PEI.
- Mezcla suavemente arriba y abajo, incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Combina el tubo de plásmidos y el tubo PEI, mezcla suavemente e incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.
- Saca 143 células B de la incubadora y aspira suavemente el medio de cultivo. Añade 7 mL de medium sin suero a cada plato. Etiqueta los platos para indicar los plásmidos a añadir (143B shNC o 143B shSNHG6).
- Añade la mezcla de transfección prepreparada en gota en el recipiente de cultivo correspondiente.
NOTA: Añade la mezcla lentamente, usando una pipeta en movimiento circular, y relázala uniformemente desde el borde exterior hacia el centro del plato. Incubar a 37 °C en una incubadora con 5% deCO2. - Desecha el sobrenadante 8-12 horas después y añade 10 mL de medio DMEM completo a cada plato de cultivo de 10 cm. Incubar las células a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
- Observar bajo microscopio de fluorescencia a las 72 horas después de descartar el sobrenadante y reemplazarlo por un medio DMEM completo.
2. Ensayo de formación de colonias
- Retira el medio del recipiente de cultivo de 10 cm (shNC y shSNHG6), añade 1,5 mL de tripsina-EDTA para digerir las células, pipetea suavemente para desprenderlas y luego añade 5 mL de medio completo para terminar la digestión.
- Transfiere la suspensión de la celda a un tubo microcentrífuga de 15 mL.
- Quita 20 μL de suspensión celular y cuenta los números de celdas.
NOTA: El recuento de células debe realizarse varias veces para asegurar que los números de celda en el grupo shNC y en el grupo shSNHG6 sean consistentes. Aquí recogemos 3 × 105 celdas para la verificación RT-PCR de la eficiencia de derribo del SNHG6. - Semilla 2 ×10 3 celdas por pozo en una placa de 6 pozos. Añadir el medio DMEM completo a un volumen final de 2 mL y cultivar las células a 37 °C en una incubadora deCO-2 al 5%.
NOTA: Sustituye el medio por medio DMEM completo y nuevo cada dos días. - Monitoriza la formación de las colonias a diario.
NOTA: Terminar el cultivo cuando la mayoría de las colonias del grupo control (shNC) contengan ≥50 células, o después de 10-14 días de incubación, lo que ocurra primero. - Saca las células de la incubadora y desecha el sobrenadante.
- Lava las células dos veces con 1 mL de PBS por pozo y descarta el PBS tras cada lavado.
- Fija las celdas con 1 mL de solución de formol al 10% durante 15 minutos y luego descarta la solución al 10%.
- Lava las células dos veces con 1 mL de PBS por pozo y descarta el PBS tras cada lavado.
- Tinte las celdas con 1 mL de solución teñidora de violeta cristalina al 0,5% durante 10-30 minutos, luego descarta la solución de tinción.
- Lava las células suavemente con agua del grifo que corre lentamente.
- Seca las celdas al aire a temperatura ambiente.
- Captura imágenes con una cámara.
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Resultados
Para evaluar el efecto del RNAlnc SNHG6 sobre la capacidad proliferativa de las células de osteosarcoma, establecimos con éxito un sistema de knockdown mediado por plásmidos y realizamos ensayos de formación de colonias. El flujo experimental incluyó la transfección de plásmidos de células 143B y el ensayo de formación de colonias (Figura 1).
La eficiencia de transfección de 143 células B fue confirmada mediante microscopía de flu...
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Discusión
Dirigirse terapéuticamente a los ARNnc asociados al cáncer, además de aprovechar su utilidad diagnóstica como biomarcadores, representa un enfoque emergente en el manejo del cáncer. Definir el papel de los ARNCn en la patogénesis del osteosarcoma es crucial para avanzar en su diagnóstico, terapia y pronóstico.
Deben seguirse pasos críticos para garantizar el éxito de este ensayo. En primer lugar, establecer una suspensión unicelular es un requisito absoluto pa...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por subvenciones de la National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 y 82205145).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL MICROTUBOS | Merck | AXYMCT150C | |
| Formalina amortiguada al 10% de neutro | VICTREX | 5205000 | |
| 100 - 1000 μ L Extended Graduated Blue Tips | Shanghai BioScience Co., Ltd | BS10401ML | |
| Laboratorio de Platos de Cultivo Celular de 100 mm | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 704001 | |
| 143B | ATCC | ATCC CRL-8303TM | |
| Tubo centrífuga de 15 mL | Shanghai BioScience Co., Ltd | BL2002150 | |
| Placa de cultivo celular de 6 pozos | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 703001 | |
| Incubadora CO2 | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | 300583057 | |
| Violeta Cristalino | TCI Shanghái | C0428 | |
| Medio DMEM | CORPORACIÓN DE WISENT | 319-005-CL | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3123000233 | |
| FBS - Calidad superior | CORPORACIÓN DE WISENT | 086-150 | |
| Boligrafo de marca | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. & nbsp; | YYST5 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| PASTEUR PIPETTE | Labgic | BS-XG-O3L | |
| Amortiguador PBS (polvo seco) | Labgic | BL601A | |
| PEI | Policiencias | 24765 | |
| Puntas de pipeta | Merck | AXYT200Y | |
| Enzima TrypLE Express | Gibco | 12604021 | |
| Tripsina/EDTA | Gibco | R001100 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
