Artículo de método

Imagen espectroscópica de superresolución de moléculas de ADN usando contraste intrínseco

DOI:

10.3791/69917

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6 de marzo de 2026

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1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern Memorial Hospital

En este artículo

Resumen

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Este protocolo proporciona operaciones detalladas sobre la preparación de muestras, la recogida de datos y el análisis de espectros de fluorescencia intrínseca del ADN.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La imagen de superresolución ha revolucionado la investigación biológica al revelar detalles estructurales a nanoescala. La mayoría de los métodos ópticos de superresolución dependen del marcaje fluorescente de biomoléculas, lo que permite el marcado específico de especies moleculares pero puede alterar funciones celulares, introducir inexactitudes en moléculas enlazadoras y no proporcionar la alta densidad de marcado consistente requerida para la imagen de cromatina a escala de moléculas individuales de ADN. Una tecnología que permita la imagen genómica in situ, sin etiquetar y con resolución nanométrica tendría un impacto profundo en la biología. Aquí presentamos un protocolo que aprovecha la fluorescencia intrínseca del ADN para realizar microscopía espectroscópica de localización de molécula única (sSMLM). El protocolo detalla la preparación de la muestra, la adquisición de datos y el análisis espectral. En resumen, se crea un gel fino de ADN depositando una solución de polinucleótidos sobre el vidrio y dejándolo secar durante horas. Tras la formación del gel, la muestra se obtiene imágenes en presencia de un buffer de imagen utilizando sSMLM. El conjunto de datos registrado comprende una imagen de orden cero, que proporciona localizaciones espaciales, y una imagen de primer orden, que codifica el espectro de emisión de cada localización. Las reconstrucciones espaciales se generan a partir de los datos de orden cero, tras lo cual se extraen los espectros correspondientes de la señal de primer orden. Finalmente, demostramos la viabilidad de este enfoque utilizando múltiples longitudes de onda de excitación y moléculas de ADN con longitudes, secuencias y composiciones variables.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las técnicas de microscopía de fluorescencia de superresolución —incluyendo la microscopía de iluminación estructurada (SIM), la microscopía de depleción por emisión estimulada (STED) y los enfoques de microscopía de localización de molécula única (SMLM) como la microscopía de localización fotoactivada (PALM) y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM)— han llevado la resolución de la microscopía óptica mucho más allá del límite de difracción 1,2,3,4.5,6,7, lo que permite un acceso sin precedentes a la organización nanoescala de lacromatina 8,9,10,11,12. Sin embargo, los métodos actuales de tinción para visualizar estructuras de ácidos nucleicos dependen del marcaje de proteínas asociadas al ADN en lugar del ADN en sí, o emplean tintes de moléculas pequeñas que pueden alterar la configuración nativa de la cromatina y comprometer la viabilidad celular13,14. Debido a estas limitaciones, el desarrollo de métodos de imagen óptica sin etiqueta y sin etiqueta bajo condiciones nativas y no perturbadoras es muy deseable. El protocolo presentado aquí está destinado a nucleótidos de ADN sintéticos purificados de cadena simple o doble cadena, donde la fluorescencia intrínseca puede detectarse de forma fiable; no está optimizado para la imagen de moléculas de ADN nuclear en células fijas o vivas.

Dado que los ácidos nucleicos se consideraron durante mucho tiempo no fluorescentes debido a su rendimiento cuántico extremadamente bajo (del orden de 10−4 bajo excitación UV) y a la decaimiento de fluorescencia ultrarrápida a temperaturaambiente 15, los estudios sobre la fluorescencia intrínseca del ADN (principalmente la vida útil de la fluorescencia) fueron raros hasta que se desarrolló la espectroscopía de femtosegundos. Se ha reconocido ampliamente que los nucleótidos fluorescen débilmente bajo la iluminación ultravioleta, mientras que su absorción en el rango visible es considerablemente menor. No obstante, se observó recientemente que existe fluorescencia visible excitada por luz de ácidos nucleicos no modificados en concentraciones fisiológicamente relevantes16. Este fenómeno probablemente se había pasado por alto porque la mayoría de los estudios fotoquímicos de nucleótidos se realizaron en soluciones diluidas (10-100 μM)17,18,19,20, mientras que en núcleos y cromosomas, las concentraciones de ADN pueden alcanzar 0,1-1 M 21,22,23. Más importante aún, se observó el cambio estocástico de fluorescencia bajo iluminaciónvisible en 16, sentando las bases para el uso de ácidos nucleicos no modificados como agentes de contraste endógenos para la microscopía de superresolución basada en localización.

Se han explorado las características fotoquímicas de los monómeros nucleotídicos y moléculas de ADN monocatenario con secuencias simples a concentraciones fisiológicas bajo excitación de luzvisible 24. También se ha demostrado que estas moléculas de ADN poseen propiedades estocásticas de conmutación de fluorescencia, lo que se alinea bien con la teoría de la depleción del estado fundamental (GSD)6,7 al examinar la recuperación por fluorescencia de nucleótidos bajo condiciones variables de agotamiento. Además, dado que los nucleótidos presentan rendimientos cuánticos relativamente altos y bajas probabilidades de cruce intersistemático, el conteo de fotones y las duraciones de parpadeo de los eventos de emisión de molécula única son comparables a los de colorantes exógenos populares en STORM (por ejemplo, Alexa Fluor 647), que exhiben espectrosdistintos 25,26 y hacen del ADN un agente de contraste intrínseco ideal para imágenes de alta resolución. Además, la implementación del algoritmo de regresión espectral descrito en la sección anterior permite la obtención de imágenes con superresolución de menos de diez nanómetros de polinucleótidos y fibras lineales de ADNmonocatenario 27.

Para capturar todo el espectro de la fluorescencia intrínseca del ADN, empleamos un prisma de doble cuña (DWP) para la detección espectral, que permite el análisis espectroscópico y la imagen simultánea de alta capacidad de molécula única con pérdida de transmisión mínima y errorde frente de onda 28,29,30, y un software de análisis espectroscópico SMLM de código abierto (RainbowSTORM) para procesamiento automáticode datos 31,32. Basándonos en esta capacidad, desarrollamos una plataforma SMLM multiláser integrada con detección espectroscópica y una cadena dedicada de análisis espectral. El protocolo que presentamos aquí abarca la preparación, adquisición y análisis de muestras, proporcionando un flujo de trabajo reproducible para aprovechar la fluorescencia intrínseca del ADN en la microscopía de localización de molécula única. Más allá de permitir estudios de prueba de concepto sobre la imagen de oligonucleótidos monocatenarios y moléculas de ADN de doble cadena con contraste intrínseco, el enfoque sentó una base para aplicaciones más amplias en la imagen de ADN bajo condiciones nativas y libres de marcador, como la predicción de secuencias basada en la fluorescencia intrínseca del ADN combinada con métodos computacionales.

Protocolo

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1. Preparación de muestras de gel de ADN (Figura 1A)

  1. Disolver la muestra de ADN (ya sea oligonucleótido o ADN de doble cadena) en polvo en agua desionizada libre de nucleasas hasta una concentración final de 100 mM y almacenar la solución original a -4 °C.
  2. Preparar alicuotas de 5 μL para minimizar los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Si usas alicuotas congeladas, déjalas a temperatura ambiente durante 5-15 minutos, dependiendo del volumen.
  3. Limpia suavemente una lámina de vidrio con una toallita de laboratorio. Pipetear 5 μL de la solución de la molécula de ADN de 100 mM sobre el portaobjetos de vidrio recién limpiado y dejar que se evapore durante 1-3 horas, formando un gel de ADN.
  4. Acciona este escalón en una campana extractora por seguridad. Preparar el buffer de imagen según la Tabla de Materiales. Tanto el buffer de β-mercaptoetanol como el buffer DABCO fueron validados para soportar la foto-conmutación estocástica de moléculas de ADN.
  5. Acciona este escalón en una campana extractora por seguridad. Añade 5 μL de buffer de imagen al gel de ADN y coloca una capa de cobertura encima justo antes de la imagen. Podría haber burbujas dentro de la muestra cubierta. Usa una pinza para eliminar las burbujas dentro de la muestra cubierta,

2. Calibración del sistema sSMLM y adquisición de datos (Figura 1B)

  1. Preparar una matriz de nanohuecos fabricada con un diámetro de huecos de 100 nm y un espaciamiento de 4 μm, dispuestos en 8 filas x 5 columnas para la siguiente calibración del sistema espectroscópicoSMLM 33.
    NOTA: Alternativamente, la tabla de resolución de 1951 (R3L1S4N) de la Fuerza Aérea de los Estados Unidos (USAF) también puede utilizarse para la calibraciónespectral 33.
    1. Producir la matriz de nanohuecos mediante pulverización secuencial de metales y fresado por haz de iones enfocados (FIB). Primero, depositar una película de aluminio de 150 nm de grosor sobre una cubierta de vidrio borosilicato de 22 x 22 mm usando sputtering DC a 75 W con un flujo estándar de argón de 20 centímetros cúbicos por minuto (SCCM) a 3 mTorr.
    2. Modelar una matriz de 5 x 8 nanoorificios en la capa de aluminio usando fresado FIB operado a una tensión de aceleración de 30 kV.
  2. Enciende el sistema espectroscópico SMLM (Figura 2), inserta filtros de ancho de banda estrecho (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm y 750 nm) justo delante de la cámara y utiliza una fuente de luz blanca (por ejemplo, la lámpara del microscopio) para iluminar la muestra de calibración.
  3. Recoge 10 fotogramas con cada filtro. Ajusta el tiempo de exposición para 532 nm, 580 nm, 633 nm y 680 nm a 200 ms y a 2000 ms para 750 nm debido a la baja intensidad de la lámpara y la baja eficiencia de la cámara en la región del infrarrojo cercano (Figura 3).
  4. Carga la muestra de gel de ADN en el microscopio, asegúrate de que el lado de la cubierta esté orientado hacia el objetivo y abre el software de la cámara para la adquisición de datos.
  5. Identifica la posición z adecuada con la ayuda del sistema automático de seguimiento de enfoque, asegurando que el parpadeo estocástico claro sea visible. Este paso es fundamental y requiere paciencia, ya que las muestras de gel de ADN carecen de señales morfológicas evidentes como las estructuras celulares, lo que dificulta la navegación hacia una señal adecuada.
  6. Asegúrate de que el objetivo no toque el borde del deslizante, ya que esto podría causar fugas de amortiguador hacia el aceite de inmersión e interferir con el rastreo.
  7. Adquiere entre 10.000 y 30.000 fotogramas con una potencia de iluminación típica de 5 kW/cm² y un tiempo de exposición de 30 ms. Ajusta el número de fotogramas, la potencia de iluminación y el tiempo de exposición según sea necesario. Tras la adquisición, el software guardará los datos en formato nd2 por defecto.
  8. Tras completar el experimento, desecha la lámina de vidrio en un recipiente aprobado para residuos punzantes (por ejemplo, un contenedor de eliminación de cristales rotos o objetos punzantes) y desecha todos los buffers restantes en el recipiente de residuos líquidos químicos designado conforme a las directrices de seguridad institucional.

3. Análisis de datos de calibración y espectroscopía (Figura 1C)

  1. Carga la pila de imágenes en bruto adquirida de la muestra de ADN en FIJI (Windows 64 bits), usando el Bio-Formats Plugin.
  2. Se resta la proyección mínima de la pila para obtener un conjunto de datos con fondos de fondo y gárdalo para el análisis espectral. Para la pila de imágenes raw cargadas, selecciona Pilas de > Imágenes > Proyecto Z y selecciona Intensidad mínima en el tipo de Proyección. Luego selecciona Procesar > Calculadora de Imagen para restar la proyección mínima de la pila de imágenes raw y guárdala como TIFF.
  3. Realizar la identificación de localización en la pila de imágenes raw de orden cero usando el plugin ThunderSTORM (versión 1.3). Utiliza parámetros apropiados (por ejemplo, umbral = 1.2 x std (Onda.F1), sigma = 1.5, radio de ajuste = 3) para reconstruir la imagen de orden cero y extraer las coordenadas del evento de emisión (unidades: nm). Para la pila de imágenes raw de orden cero recortadas, selecciona Plugin > ThunderSTORM > Análisis Run.
  4. Utiliza FIJI y el software de código abierto RainbowSTORM (enlace de GitHub en32, con versión MATLAB más reciente que 2020b) para procesar los datos de calibración y obtener la relación entre los desplazamientos horizontales y verticales y las longitudes de onda31,32.
    1. Realiza la identificación de localización en las imágenes de calibración de las 5 longitudes de onda usando el plugin ThunderSTORM. Utiliza parámetros apropiados (por ejemplo, umbral = 5 x std (Onda.F1), sigma = 1.5, radio de ajuste = 3) para reconstruir las localizaciones de los nanoagujeros en orden cero y sus correspondientes localizaciones espectrales en primer orden.
    2. Ajusta el umbral (por ejemplo, en un rango de 5-10 x std (Onda.F1)) hasta que haya 80 localizaciones para cada imagen de calibración.
    3. Ejecuta RainbowSTORM y haz clic en Calibración Espectral > Navega y carga los archivos CSV para cada longitud de onda de calibración (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm) del paso anterior. Haz clic en guardar archivo de calibración.
  5. Convierte las coordenadas basadas en nanométricos en coordenadas de píxeles y mapealas a la ventana espectral correspondiente basándose en los desplazamientos horizontales y verticales del orden cero al primer orden, determinados en la calibración (Figura 4), para medir todo el espectro de fluorescencia intrínseca del ADN.
    1. Utiliza scripts personalizadosen Python 34 (versión 3.11.7) para extraer los datos de todo el espectro con los siguientes pasos.
    2. Establece las rutas correctas de archivo para la pila de imágenes restada en fondo (.tiff) del paso 3.2, el archivo CSV de localización (.csv) producido a partir del paso 3.3 y el archivo de calibración del paso 3.4 (.mat).
    3. Utiliza 900-950 píxeles como desplazamiento horizontal para los datos de 488 nm adquiridos con el DWP 3D, correspondiente a una ventana espectral de 484-588 nm, ligeramente más amplia que el rango de filtros de 500-550 nm para asegurar la cobertura.
    4. Utiliza 925-984 píxeles como desplazamiento horizontal para los datos de 532 nm adquiridos con el DWP 3D, correspondiente a una ventana espectral de 525-750 nm, también elegida para ser más amplia que el rango de filtro de 590-650 nm.
    5. Usa 23 píxeles como desplazamiento vertical tanto para los datos de 488 nm como de 532 nm con el DWP 3D.
      Los valores anteriores se derivaron de la curva de calibración espectral obtenida usando RainbowSTORM. Los scripts en Python para la medición de espectro completo se pueden encontrar en34.
  6. Linealizar el espectro no lineal para análisis posteriores (comparación, clasificación, etc.) usando un ajuste polinómicode orden 3 (Figura 3).

Resultados

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El proceso completo —desde la preparación de la muestra hasta la adquisición y análisis de datos— para una pila de imágenes de una muestra de ADN lleva aproximadamente 120 minutos, suponiendo que la formación del gel de ADN requiera 1 hora (Figura 1). El tiempo combinado para el descongelamiento, formación del gel y calibración espectral se fija en unos 90 minutos, independientemente del número de imágenes o muestras en el experimento. Para maximizar la eficiencia, recomendamos recopilar múltiples pilas de imágenes en varias muestras en una sola sesión.

Las imágenes representativas en tiempo real obtenidas tras la DWP se muestran en la Figura 1B y la Figura 3A, donde las señales de fluorescencia se separan en el orden cero (izquierda, que contiene información espacial) y el primer orden (derecha, que contiene información espectral). En la Figura 1B, las imágenes se adquirieron usando la configuración DWP 2D, en la que la separación entre imágenes de orden cero y primer es relativamente pequeña. En contraste, la Figura 3A muestra datos recogidos utilizando el DWP 3D, donde los dos órdenes de difracción están más separados debido a la diferencia de trayectoria óptica diseñada necesaria para la imagen 3D biplana. Todos los datos presentados en las Figuras 1C, 3 y 4 se recogieron utilizando la configuración 3D DWP. La elección entre imágenes 2D y 3D depende del objetivo experimental: para mediciones espectrales de fluorescencia intrínseca de muestras de ADN sintetizadas, generalmente se prefiere la DWP 2D porque estas muestras carecen de características estructurales tridimensionales relevantes, aunque la configuración DWP 3D también puede utilizarse cuando se desea información axial.

En conjunto, estos resultados representativos demuestran la capacidad central de la plataforma de imagen basada en DWP para resolver simultáneamente los espectros de localización espacial y emisión de moléculas individuales de ADN en tiempo real. El rendimiento adecuado del sistema se indica por la clara y estable separación entre la imagen espacial de orden cero y la imagen espectralmente dispersa de primer orden, con cada localización de molécula individual en orden cero correspondiente a una traza espectral distinta de primer orden. El análisis espectral cuantitativo se realiza identificando eventos aislados de una sola molécula en la imagen de orden cero, midiendo el desplazamiento relativo del píxel de la señal de primer orden asociada y convirtiendo este desplazamiento en longitud de onda mediante una función de mapeo calibrada. Dado que la relación entre el desplazamiento del píxel y la longitud de onda de emisión es no lineal, se aplica un ajuste polinómico de tercer orden para reconstruir con precisión espectros de emisión lineales a partir de datosen bruto 28. Los espectros de molécula única resultantes pueden integrarse aún más en canales de análisis computacional, incluyendo modelos de aprendizaje automático o aprendizaje profundo, para permitir la clasificación espectral y la inferencia de la composición de secuencias de ADN o la estructura molecular basada en firmas de fluorescencia intrínseca bajo diferentes condiciones de iluminación y estados fotofísicos.

Todos los datos mostrados en este protocolo se recogieron utilizando el buffer de imagen basado en β-mercaptoetanol35. En principio, cualquier buffer de imagen que mejore el comportamiento de conmutación de fotoconmutación de fluoróforos debería ser compatible con este enfoque, por ejemplo, buffer de imagenbasado en DABCO. Las moléculas de ADN analizadas incluyen A, G, C, T monocatenario de 20 bases; cadena de corriente alterna simple de 40 bases (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20); guanina monohilo de 5, 8, 12 y 16 bases; GC y AT de doble cadena de 20 bases (véase la Tabla de Materiales para información detallada). La selección de constructos de ADN de 20 y 40 bases se basa en la observación de que una cadena de ADN de 40 bases adopta una conformación compacta con un tamaño efectivo inferior a 40 x 3,4 = 13,6 nm, situándola por debajo del límite de resolución de la imagen reconstruida del SMLM. Las longitudes de onda de excitación (488 nm y 532 nm) no fueron optimizadas de forma única para secuencias específicas, sino que se seleccionaron para demostrar que la fluorescencia intrínseca del ADN puede detectarse de forma robusta a través de diferentes composiciones de bases y estados conformacionales usando cualquiera de las dos longitudes de onda. Probamos el buffer de imagen como se muestra en la Figura Suplementaria 1 y encontramos que casi no se detectaron señales de parpadeo estocásticas, descartando componentes del buffer y tratamientos superficiales de vidrio. Solo el gel de ADN + el buffer de imagen presentaron un número significativo de parpadeos. Las láminas y cubiertas de vidrio estaban limpias y manipuladas con cuidado, mientras que el gel de muestra se formaba en un entorno cerrado. Por lo tanto, es poco probable que las señales detectadas provengan de impurezas o autofluorescencia del sustrato. También medimos la señal del gel secante y la solución de ADN, ambos, y encontramos que no había diferencias significativas, por lo que los artefactos fotoquímicos durante el secado no son la fuente principal de las señales. Los productos de fotodegradación suelen mostrar espectros amplios y no tienen propiedades de parpadeo, que nunca se observaron en nuestro estudio. Los límites cuantitativos de detección, reflejados por el recuento mínimo de fotones de localizaciones, son de 30 - 50 [conteo de fotones]. Este valor se mantiene igual para muestras de ADN y sistemas marcados, como H3K9me3 marcado con AF647 en células fijas. La precisión media de localización de la fluorescencia intrínseca del ADN es de unos 15 - 25 nm, mientras que la AF647 es de unos 10 - 15 nm.

En el escenario 2D, la imagen SMLM reconstruida tiene un tamaño de píxel de 22 nm. La precisión de las localizaciones de las emisiones estocásticas tiene una media de ~20 nm, lo que describe el intervalo de confianza de dónde se localiza la molécula individual. Sin embargo, las muestras analizadas para fluorescencia intrínseca no tienen estructuras biológicas, por lo que la resolución de las estructuras no puede interpretarse. Se informa que la microscopía de dispersión Raman coherente tiene una resolución de 250 - 300 nm37, y el dos fotones UV tiene una resolución de 300nm 38. La relación señal-ruido de la imagen de dispersión Raman coherente es de magnitud 10 - 10039, mientras que es de 2 a 20 (a menudo expresada como señal a desviación estándar de ambos, SSDR) para la microscopía UV de 2 fotones 40,41. La SNR para la fluorescencia intrínseca del ADN usando sSMLM es de aproximadamente 5 debido al bajo recuento de fotones y las limitaciones impuestas por el ruido de detección de cámara.

figure-results-1
Figura 1: Flujo de trabajo con duraciones estimadas. (A) La preparación de la muestra implica descongelar el material, preparar el gel de ADN y añadir un tampón de imagen. El tiempo total varía entre 1 y 3 horas dependiendo de la muestra y el entorno. (B) Cada adquisición requiere un proceso de calibración con una muestra especialmente diseñada por un array de nanoagujeros. El tiempo total de calibración será de unos 20 minutos, y el tiempo de adquisición de datos para una pila de imágenes será de unos 10 minutos, incluyendo la búsqueda de muestras (10.000 fotogramas y 50 ms de exposición). (C) La cadena de análisis implica preprocesamiento FIJI y análisis espectral en Python. El preprocesamiento en FIJI dura unos 10 minutos, mientras que el análisis espectral es rápido con los códigos establecidos. Los espectros presentados se recogieron de la guanina de 16 bases. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Esquema óptico. Las cuatro líneas láser (405 nm, 488 nm, 532 nm, 647 nm) se dirigen al microscopio invertido mediante alineación láser, haciendo que el sistema sea estable y fácil de manejar. El DWP se coloca justo delante de la cámara sCMOS, permitiendo la detección espectroscópica de molécula única. Al calibrar para el DWP, se inserta una rueda de filtros entre la cámara y el DWP. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Calibración espectral. Las longitudes de onda de calibración utilizadas son 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm y 750 nm. Colocando secuencialmente filtros de ancho de banda estrecho con estas longitudes de onda centrales tras la DWP y delante de la cámara, se pueden medir los correspondientes desplazamientos horizontales y verticales de diferentes longitudes de onda, permitiendo mapear una curva de calibración entre la posición del píxel y la longitud de onda. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Espectros de moléculas seleccionadas de ADN de doble cadena y simple cadena bajo excitación de 532 nm y 488 nm, respectivamente. (A - B) Los espectros no lineales y lineales de GC_alter, que se refieren a un tipo de molécula de ADN de doble cadena, con ambas hebras como 20 bases 5'-GCGCGCGCGCGCGCGCGC-3'. El espectro verde resaltado muestra la curva media. (C - D) Los espectros no lineales y lineales de A10C10, que se refieren a un tipo de molécula de ADN monocatenario, con longitud de 40 bases y repetidas 10 adeninas y 10 citosina (5'- AAAAAAAAAACCCCCCCCCCAAAAAAAAACCCCCCCCCCC-3'). El espectro azul resaltado muestra la curva media. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Experimentos de control para la fluorescencia intrínseca del ADN. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos, por primera vez, un protocolo para capturar todo el espectro de fluorescencia intrínseca del ADN tanto de moléculas de ADN de cadena simple como de doble heta, cubriendo el flujo de trabajo desde la preparación de la muestra hasta la adquisición de datos y el análisis computacional. Este protocolo permite la obtención de imágenes sin marcar y superresolución de moléculas de ADN aprovechando la fluorescencia intrínseca en lugar de sondas exógenas. En principio, este enfoque podría extenderse a células fijas y potencialmente a la imagen de células vivas, ya que evita el marcaje químico y la amplificación basada en anticuerpos. La cromatina dentro del núcleo involucra ADN, ARN y diferentes tipos de proteínas, que es un sistema mucho más complicado que el gel de ADN. Actualmente, debido a los bajos conteos de fotones de las moléculas de ADN, las emisiones estocásticas desde dentro del núcleo en células fijas/vivas son un desafío. Pero para los cromosomas aislados, o núcleo, se había reportado la señal de fluorescencia intrínseca delADN 16,24,27. Sin embargo, en su forma actual, el protocolo se limita a entornos in vitro utilizando muestras de ADN sintetizadas. En comparación, marcar ADN nuclear o cromatina mediante inmunotinción suele implicar procedimientos de varios pasos extensos —incluyendo temple, bloqueo e incubaciones primarias y secundarias de anticuerpos— que pueden durar del orden de varias horas (a menudo ~5 horas por objetivo)12,42, introduciendo tanto complejidad experimental como posibles perturbaciones a la estructura nativa de la cromatina. Al eliminar las marcas exógenas, la imagen basada en fluorescencia intrínseca no solo reduce sustancialmente el tiempo de preparación de la muestra, sino que también evita perturbaciones estructurales y errores de ligamento asociados a sondas fluorescentes voluminosas y anticuerpos, permitiendo así una localización más fiel a nanoescala del ADN.

A pesar de su naturaleza libre de etiquetas y simplicidad conceptual, la implementación exitosa de este protocolo requiere una atención cuidadosa a varios detalles experimentales críticos. Por ejemplo, durante la preparación de la muestra, el tiempo insuficiente para la formación de geles de ADN reduce el número de localizaciones detectables de una sola molécula en comparación con geles completamente formados. Normalmente, el gel tarda aproximadamente 1,5 horas en formarse. Si la solución no está completamente seca, solo espera un poco más. Para un deslizante de 22 x 22 mm, 5 μL de buffer de imagen son suficientes, mientras que un mayor volumen de buffer puede causar fugas, lo que puede alterar la interfaz de inmersión en aceite del objetivo y afectar negativamente al rendimiento de imagen. Si se produce fuga, puede eliminarse cuidadosamente con una toallita de laboratorio. Mientras enfocas, sube gradualmente el objetivo desde la posición z más baja. Después de que el objetivo se active con el aceite de inmersión, se utiliza el modo de ajuste fino para identificar el plano focal con frecuentes eventos estocásticos de emisión de molécula única. Si los grandes cúmulos de gel producen señales agregadas con espectros de primer orden superpuestos, se selecciona un área de imagen alternativa.

A pesar de sus ventajas, este protocolo presenta varias limitaciones importantes que deben tenerse en cuenta al evaluar su aplicabilidad y rendimiento. Primero, la extracción espectral precisa depende de una separación espacial suficiente entre eventos individuales de molécula única; las altas densidades de localización, como las que surgen de grandes cúmulos de gel de ADN o ensamblajes macromoleculares densamente empaquetados, pueden dar lugar a trazas espectrales de primer orden superpuestas que complican o impiden una reconstrucción espectral fiable. En segundo lugar, el método es sensible a la alineación óptica y a la estabilidad del enfoque, ya que pequeños desalineamientos del prisma de doble cuña o desviaciones del plano focal óptimo pueden introducir errores sistemáticos en la calibración de la longitud de onda y reducir la relación señal-ruido. Tercero, el protocolo actualmente no implementa la mezcla espectral, limitando su uso en muestras con alta densidad molecular o múltiples especies que se solapan espectralmente. En conjunto, estos factores definen el régimen operativo práctico del método y deben considerarse cuidadosamente al extender el protocolo a sistemas biológicos más complejos o saturados.

En este protocolo, RainbowSTORM se utiliza únicamente para calibración espectral, aunque el software también proporciona potentes herramientas para calibración 2D/3D, análisis de datos sSMLM y reconstrucción de imágenes. Estas herramientas de análisis son muy adecuadas para vincular información de localización espacial con lecturas espectrales en imágenes espectroscópicas de superresolución y podrían aprovecharse aún más en futuras extensiones de este protocolo. Finalmente, este protocolo es potencialmente factible para otros tipos de macromoléculas biológicas 43,44,45, como ARN, tubulina, etc. El espectro detectado puede alimentarse además en modelos computacionales, como los modelos de aprendizajeprofundo 46, para realizar la clasificación, prediciendo así la secuencia o la estructura molecular a partir de espectros intrínsecos bajo diferentes propiedades de iluminación y fotofísicas. Este estudio también allana el camino para la imagen de cromatina específica molecular y sin marcador, que evita el marcaje externo o la desnaturalización de estructuras nativas.

Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue financiada por subvenciones R02CA225002, U54CA261694, R01CA289294 y U54CA268084 de los Institutos Nacionales de Salud y la subvención CBET-2430743 de la Fundación Nacional de Ciencias. Agradecemos al laboratorio del profesor Hao F. Zhang en la Universidad Northwestern su dispositivo prismático de doble cuña como parte clave del sistema espectroscópico SMLM.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro de emisión de 488 nm para imagenChroma Technology Corp.ET525/50M
Filtro pasa banda de 532 nm para calibraciónThorlabsFL532-3
Filtro de emisión de 532 nm para imagenChroma Technology Corp.ET620/60M
Filtro pasa banda de 580 nm para calibraciónThorlabsFB580-10
Filtro pasa banda de 633 nm para calibraciónThorlabsFL632.8-3
Filtro pasa banda de 680 nm para calibraciónThorlabsFB680-10
Filtro pasa banda de 750 nm para calibraciónThorlabsFB750-10
Beta-mercaptoetanol  SigmaM6250
Búfer de imagen BMENANA7 & mu; L GLOX, 7 y mu; L Beta-mercaptoetanol y 690 & mu; Tampón de L glucosa
Catalasa de hígado bovinoSigmaC100
DABCO (1,4-di-azobiciclo-(2.2.2.)-octanaje)SigmaD27802
Búfer de imagen DABCONANA65 mM DABCO+30 mM Sulfito de sodio + 30 mM DTT 1 M  en el ADNasa, agua desionizada libre de ARNasa. El sulfito de sodio debe disolverse en PBS 10 y 5 veces; a 1 M antes de crear el buffer de imagen.
Deplex de ADN para SMLM espectroscópicoIDTNA20 pares de bases de doble hilo GC_alter, GC_conti, AT_alter y AT_conti.
Por ejemplo, GC_alter tiene ambas hebras de 5' - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGC - 3'; GC_conti tiene una hebra de 5' - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3' y el otro como 5' - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3'
Todas las muestras están en el estándar HPLC.
ADN oligonucleótido/ADN de doble cadenaIDTNA
Oligos de ADN para SMLM espectroscópicoIDTNA20 bases de A, G, C, T; cadena de corriente alterna monohilo de 40 bases (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20);   Guanina monohilo de 5, 8, 12 y 16 bases.
Por ejemplo, A10C10 es
5'- AAAAAAAAAACCCCC
CCCCCAAAAAAAAA
AACCCCCCCCCCCC - 3'
Todas las muestras están en el estándar HPLC.
Agua Destilada Libre de DNasa/RNasaInvitrogen10977015
DTT (DL-Ditiotreitol)Sigma43816
GLOXNANA14 mg de glucosa oxidasa, 50 y mu; L catalasa (17 mg/ml) + 200 y mu; El buffer L A, que es de 10 mM Tris (pH 8,0) y 50 mM NaCl. 
Buffer de glucosaNANA50 mM de Tris (pH 8,0), 50 mM de NaCl y 10% de glucosa.
Glucosa oxidasasigmaG7141
Glucosa, polvoThermo Fisher15023021
PBS (10X)Thermo FisherJ62036. K3
PBS (1X)Gibco10010023
Cloruro de sodioThermo Fisher424290010
Sulfito de sodio y nbsp;SigmaS0505
Tris (1M) pH 8,0InvitrogenAM9856

Referencias

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