Method Article

Impacto de los diferentes métodos de extracción en los perfiles de bioactividad in vitro de Terfezia claveryi

DOI:

10.3791/69950

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Genetics and Bioengineering, Faculty of Engineering and Architecture, Kirsehir Ahi Evran University, 3Department of Physiology, Gulhane Faculty of Medicine, University of Health Sciences, 4Department of Medical Services and Techniques, Medical Laboratory Techniques Program, Vocational School of Health Services, Kirsehir Ahi Evran University, 5Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Kirsehir Ahi Evran University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La bioactividad in vitro de los extractos de Terfezia claveryi dependía del método biofísico de extracción y de la polaridad del disolvente. El extracto de agua de la extracción asistida por maceración (MAE) mostró la mayor actividad antioxidante, mientras que el extracto de extracción Soxhlet (SE) indujo una mayor citotoxicidad en las células SH-SY5Y. Estos resultados demuestran diferencias claras dependientes del método en la bioactividad in vitro de los extractos de Terfezia claveryi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terfezia claveryi es una trufa comestible del desierto que tradicionalmente se consume en regiones áridas. En los últimos años, ha despertado un interés científico creciente debido a sus potenciales propiedades antioxidantes, antimicrobianas y terapéuticas, lo que sugiere posibles aplicaciones en los campos relacionados con la alimentación y la salud. Sin embargo, a pesar de la creciente evidencia de su potencial biológico, la influencia de diferentes estrategias de extracción en la recuperación de compuestos bioactivos y el perfil de bioactividad in vitro resultante de Terfezia claveryi aún no ha sido aclarada en la literatura. En este estudio se evaluó la bioactividad in vitro de extractos de Terfezia claveryi obtenidos mediante diferentes métodos de extracción y disolventes con polaridad variable. Se determinó el rendimiento de extracción y los extractos obtenidos se evaluaron para detectar actividades antioxidantes, antimicrobianas, antibiofilmadas y citotóxicas utilizando sistemas de prueba ya establecidos. La capacidad antioxidante se midió mediante pruebas de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) y pruebas de poder antioxidante reductor férrico (FRAP), mientras que se investigaron los efectos citotóxicos en células neuroblastoma SH-SY5Y. El rendimiento de extracción varió según el método y la polaridad del disolvente, siendo el mayor rendimiento obtenido del extracto acuoso preparado por el método de extracción asistida por ultrasonido (EAU) (18,40%). Se determinó que la actividad antioxidante mostraba diferencias significativas según el método de extracción, y los extractos acuosos obtenidos mediante el método de extracción asistida por maceración (MAE) mostraban un perfil rico en compuestos fenólicos junto con la mayor capacidad de captura de radicales. El análisis de LC-MS/MS de este extracto reveló la presencia de nueve compuestos fenólicos; Se identificaron el ácido quínico y el ácido clorogénico como los componentes dominantes. En cambio, los extractos derivados de Soxhlet indujeron mayores efectos citotóxicos en las células SH-SY5Y. Las respuestas antimicrobianas y antibiofilmadas mostraron una variación relativamente limitada entre los métodos de extracción, lo que indica una menor dependencia de la estrategia de extracción para estas actividades. En conjunto, estos hallazgos demuestran que el método de extracción biofísica y la selección de disolventes son determinantes críticos del perfil de bioactividad in vitro de los extractos de Terfezia claveryi , observándose efectos pronunciados para actividades antioxidantes y citotóxicas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El uso de diversas especies de setas para mejorar la salud y prevenir y tratar enfermedades se remonta a tiempos antiguos 1,2,3. Los macrohongos se clasifican generalmente en dos grupos: epígeos (setas) e hipogeos (trufas). Conocida como trufa del desierto, Terfezia claveryi (T. claveryi) es una especie de trufa comestible y de renombre mundial perteneciente al género Terfezia5. T. claveryi se distribuye comúnmente en regiones áridas y semiáridas donde las especies de Helianthemum sonpredominantes 6,7,8,9,10,11. En los últimos años, la carga global de enfermedades crónicas como el cáncer y los trastornos neurodegenerativos ha aumentado significativamente, lo que pone de manifiesto la urgente necesidad de nuevos agentes terapéuticos seguros y eficaces. Según informes de salud global, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte a nivel mundial, mientras que las enfermedades neurodegenerativas continúan aumentando junto con el envejecimiento de la población. Dado este creciente problema de salud pública, la investigación de productos naturales derivados de hongos y plantas medicinales como posibles fuentes de compuestos bioactivos se ha convertido en una importante prioridadde investigación 12.

Paralelamente, la rápida aparición de la resistencia a los antimicrobianos supone otra amenaza importante para la salud global. La resistencia a los fármacos ha reducido significativamente la eficacia de los antibióticos tradicionales, lo que ha generado una necesidad urgente de estrategias antimicrobianasalternativas 13. Los metabolitos secundarios derivados de fuentes naturales, especialmente compuestos fenólicos y polifenólicos, están despertando un interés creciente debido a sus diversos mecanismos antimicrobianos y a su baja tendencia a desarrollar resistencia14. El estrés oxidativo es un factor mecanicista fundamental que subyace a muchas enfermedades crónicas, incluyendo el cáncer, los trastornos neurodegenerativos y los síndromes metabólicos. La producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) puede, en última instancia, alterar la homeostasis celular al causar daño en el ADN, peroxidación lipídica y oxidación de proteínas. En este contexto, los antioxidantes naturales que pueden eliminar radicales libres y regular el equilibrio redox se consideran agentes prometedores para mitigar el daño oxidativo y la progresión de laenfermedad 15.

Las trufas son ricas en ácidos grasos insaturados, proteínas, minerales, vitaminas, aminoácidos, fenólicos y polifenoles, componentes que se han asociado con propiedades antimicrobianas, antioxidantes yanticancerígenas 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Su capacidad antioxidante se ha relacionado con su eficacia para eliminar radicales libres 25,26,27. Entre las especies de trufa, T. claveryi es especialmente notable debido a su estructura comestible, valor económico regional y riqueza reportada en compuestosfenólicos 23. A pesar de la evidencia emergente sobre su consumo tradicional y actividad biológica, los estudios exhaustivos que investigan cómo las estrategias de extracción afectan su composición química y sus efectos biológicos siguen siendo limitados.

La recuperación de compuestos biológicamente activos de las trufas está fuertemente influenciada por parámetros de extracción, incluyendo la técnica de extracción aplicada y la polaridad del disolvente. Métodos de extracción biofísica como la extracción asistida por ultrasonido (EAU), la extracción asistida por maceración (MAE) y la extracción Soxhlet (SE) muestran diferencias significativas en cuanto a consumo energético, eficiencia de extracción y selectividad para compuestospolares 28. Sin embargo, la mayoría de la investigación se ha basado en un solo método de extracción o en sistemas de disolventes limitados, y los estudios que abordan comparativamente los efectos de estos métodos sobre el perfil de actividad biológica in vitro de T. claveryi son limitados. Por ello, este estudio compara sistemáticamente múltiples métodos de extracción biofísica utilizando disolventes de polaridad variable para evaluar las actividades biológicas in vitro de extractos de T. claveryi . Se hipotetizó que el método de extracción y la polaridad del disolvente conducirían a diferencias dependientes del método en las actividades biológicas. Por tanto, los objetivos del estudio son: (i) comparar los rendimientos de extracción entre diferentes métodos y disolventes, (ii) evaluar la variación dependiente del método en las actividades antioxidantes y citotóxicas, y (iii) examinar las respuestas antimicrobianas y antibiofilmadas, considerando su sensibilidad a la estrategia de extracción.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: El flujo de trabajo experimental general para la preparación y análisis de extractos de T. claveryi se resume esquemáticamente en la Figura 1. Todos los materiales utilizados en el estudio se describen en la Tabla de Materiales.

1. Autenticación y preparación de materiales fúngicos

  1. Recogida y procesamiento de material
    NOTA: En mayo de 2023 se recogieron trufas frescas de T. claveryi en estepas y tierras arenosas, sin cultivar (no agrícolas) en la provincia de Kırsehir, Anatolia Central, Turquía. Se realizó el muestreo en tres lugares distintos: la aldea Dedeli (38°54′15,8" N, 34°06′40,3" E; ~1050 m sobre el nivel del mar), la aldea Buyukkayapa (38°53′45,1" N, 34°19′37,5" E; ~1020 m sobre el nivel del mar) y la aldea Akcaagıl (39°01′39,9" N, 34°12′39,8" E; ~1100 m sobre el nivel del mar). Los yacimientos de recogida se caracterizan por un clima continental semiárido, con inviernos fríos, veranos calurosos y secos, y una precipitación media anual de aproximadamente 380–420 mm. Todas las muestras se recogieron durante la temporada natural de fructificación en zonas sin actividad agrícola reciente para minimizar la posible contaminación antropogénica.
    1. Selecciona trufas limpias y intactas, pélalas y lávalas tres veces con agua destilada.
    2. Corta las muestras en trozos pequeños y seca a la sombra hasta alcanzar un peso constante (aproximadamente 20 días).
    3. Pulveriza el material seco usando una trituradora mecánica y pásala por un tamiz de 328 micras (50 mallas).
    4. Guarda las muestras procesadas en bolsas zip-lock en un ambiente fresco, seco y oscuro a temperatura ambiente hasta que se realicen más análisis.
  2. Identificación molecular de T. claveryi
    1. Aislar ADN genómico de muestras secas de T. claveryi para identificación molecular.
    2. Evalúa la cantidad y pureza de ADN espectrofotométricamente.
    3. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de identificación de especies amplificando la región interna del espaciador transcrito (ITS) usando cebadores universales ITS1 (5′-TCCGTGTGAACCTGCGG-3′) e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).
    4. Resolver los productos de amplificación por PCR mediante electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,5% preparado en 1x tampón TAE y visualizado bajo iluminación UV tras la tinción con bromuro de etidio.
    5. Purificar los productos de PCR de banda única según las instrucciones delfabricante 29. Sujeta amplicones purificados a la secuenciación de Sanger.
    6. Ensamblar las lecturas de secuencias directas y inversas en secuencias de consenso usando el algoritmo del programa de ensamblaje contig (CAP).
    7. La identidad de la especie se confirmó comparando la secuencia ITS consensuada con las secuencias de referencia disponibles en bases de datos públicas.
      NOTA: Una muestra de comprobación de T. claveryi se conservó en la colección de laboratorio para referencia futura. La identificación de especies fue confirmada mediante análisis molecular basado en ITS (Archivo Suplementario 1).

2. Preparación y extracción de materiales fúngicos

  1. Preparación de extractos de T. claveryi
    1. Pesa aproximadamente 30 g de polvo seco de T. claveryi .
    2. Añade 150 mL de disolvente (metanol, acetona, n-hexano, acetato de etilo o agua destilada) para mantener una proporción sólido-líquido constante en todos los métodos de extracción.
    3. Utiliza disolventes de grado analítico para todos los procedimientos de extracción.
    4. Filtra cada extracto a presión reducida usando papel filtro cualitativo.
    5. Concentra los filtrados a presión reducida a 30–45 °C usando un evaporador rotativo.
    6. Liofilizar (liofilizar) los extractos concentrados hasta lograr la eliminación completa del disolvente.
    7. Almacenar los extractos de crudo seco a −20 °C hasta un análisis más profundo.
      NOTA: Aplicar pasos idénticos de procesamiento posterior a la extracción a todas las muestras para asegurar la consistencia metodológica y la comparabilidad.
  2. Métodos de extracción biofísica
    1. Extracción asistida por maceración (MAE)
      1. Coloca la muestra en polvo de T. claveryi en un recipiente de extracción cerrado.
      2. Añade el disolvente seleccionado manteniendo una proporción disolvente-sólido constante.
      3. Incubar la mezcla a temperatura ambiente en condiciones oscuras durante 72 horas.
      4. Mantén los recipientes cerrados para evitar la evaporación del disolvente.
      5. No aplique agitación externa durante el periodo de maceración.
      6. Deja que la mezcla se asiente al final del periodo de extracción.
      7. Filtra el extracto antes de continuar procesando.
    2. Extracción Soxhlet (SE)
      NOTA: Asegura una correcta circulación del agua en el condensador y evita el calentamiento seco durante el reflujo.
      1. Coloca la muestra en polvo en un dedal de extracción de celulosa.
      2. Coloca el dedal dentro de la cámara de extracción Soxhlet conectada a un matraz de fondo redondo.
      3. Añadir el disolvente seleccionado al matraz manteniendo una proporción constante disolvente-sólido.
      4. Calienta el disolvente hasta refluir usando un manto de calentamiento controlado termostáticamente.
      5. Mantener la extracción continua durante 24 horas.
      6. Mantener la temperatura de extracción en el punto de ebullición de cada disolvente (n-hexano: 68,7 °C; acetato de etilo: 77,1 °C; metanol: 64,7 °C; acetona: 56 °C; agua destilada: 100 °C).
    3. Extracción asistida por ultrasonidos (EAU)
      NOTA: Monitoriza la temperatura de forma continua para evitar el sobrecalentamiento durante la sonicación.
      1. Coloque la muestra en polvo de T. claveryi en el recipiente de extracción.
      2. Añade el disolvente seleccionado manteniendo una proporción disolvente-sólido constante.
      3. Sonica la mezcla a una frecuencia fija de 35 kHz y una potencia de salida de 520 W durante 25 minutos.
      4. Mantener la temperatura de extracción aproximadamente en 30 °C.
      5. Añadir hielo cada 5 minutos para mantener la temperatura dentro de 25–28 °C durante la sonicación.
  3. Eficiencia de extracción
    1. Pesa el material fúngico seco (Wp) antes de la extracción.
    2. Pesa el extracto crudo seco (Wext) tras eliminar completamente el disolvente.
    3. Calcula la eficiencia de extracción usando la Ecuación (1).
      figure-protocol-1(1)
    4. Disolver de nuevo cada extracto crudo seco en su disolvente correspondiente para preparar una solución stock a una concentración estandarizada de 10 mg/mL.
    5. Prepara las soluciones de stock frescas antes de cada experimento de bioactividad in vitro .
      NOTA: Estandariza todas las concentraciones de extractos para asegurar una dosificación comparable en ensayos de bioactividad posteriores.

3. Determinación de la actividad antioxidante

  1. Realizar análisis de actividad antioxidante utilizando ensayos DPPH, ABTS y FRAP.
  2. Preparar cinco concentraciones diferentes de extractos que van de 0,25 a 1,0 mg/mL a partir de soluciones de fondo recién preparadas.
  3. Realizar todas las mediciones en triplicado para asegurar la reproducibilidad.
  4. Registrar los valores de absorbancia espectrofotométricamente usando un lector de microplacas.
    NOTA: Realizar todos los ensayos según los protocolos de la literatura establecida con modificaciones menores.
  5. Actividad de eliminación radical DPPH
    NOTA: La actividad de eliminación de radicales DPPH en extractos de T. claveryi fue evaluada según el método descrito en la literatura, con modificacionesmenores 30. Protege la solución de DPPH y las mezclas de reacción de la exposición a la luz.
    1. Prepara una solución de DPPH en metanol al 70%.
    2. Ajusta la solución DPPH a una absorbancia de 1,00 ± 0,02 a 517 nm.
    3. Pipetear 50 μL de extracto a diferentes concentraciones en un pozo de microplaca.
    4. Añade 250 μL de solución DPPH a cada pozo.
    5. Incuba la mezcla de reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    6. Mide la absorbancia a 517 nm usando un espectrofotómetro de microplacas.
    7. Usa metanol como control negativo y ácido ascórbico como control positivo.
    8. Construir curvas dosis-respuesta y calcular los valores IC₅₀ para cuantificar la actividad de eliminación radical.
  6. Actividad de eliminación radical catiónica ABTS
    NOTA: Realizar el ensayo de eliminación radical ABTS según el método descrito en la literatura, con modificacionesmenores 31. Prepara la solución radical ABTS⁺ al menos 16 horas antes de usarla y protégela de la luz.
    1. Genera la solución radical ABTS incubando la mezcla de reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16 horas.
    2. Diluir 1 mL de solución de ABTS con 80 mL de etanol antes del análisis.
    3. Ajusta la absorbancia de la solución diluida de ABTS a 0,80 ± 0,02 a 734 nm.
    4. Pipetear 50 μL de extracto a diferentes concentraciones en un pozo de microplaca.
    5. Añade 250 μL de solución ABTS a cada pozo.
    6. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    7. Mide la absorbancia a 734 nm usando un espectrofotómetro de microplacas.
    8. Construir curvas dosis-respuesta y calcular los valores de IC₅₀.
  7. Ensayo de poder antioxidante reductor del pórico (FRAP)
    NOTA: Realizar el ensayo FRAP según el método propuesto en la literatura, con modificacionesmenores 32. Prepara el reactivo FRAP de forma fresca antes de usarlo y protege la mezcla de reacción de la luz.
    1. Prepara el reactivo FRAP según el protocolo referenciado.
    2. Pipetear 20 μL de extracto a diferentes concentraciones en un pozo de microplacas.
    3. Añade 280 μL de reactivo FRAP recién preparado.
    4. Incuba la mezcla de reacción a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 minutos.
    5. Mide la absorbancia a 593 nm usando un espectrofotómetro de microplacas.
    6. Genera una curva de calibración usando Trolox como estándar.
    7. Expresa la capacidad antioxidante en mg de equivalentes de Trolox (TE) por gramo de extracto.

4. Análisis del contenido fenólico total (TPC)

NOTA: Determinar el contenido fenólico total (TPC) de los extractos de T. claveryi utilizando el método de Folin–Ciocalteu descrito en la literatura, con modificacionesmenores 33. Protege las mezclas de reacción de la luz durante la incubación. Prepara la solución de carbonato sódico fresca antes de usarla.

  1. Prepara las soluciones extractadas a una concentración de 1 mg/mL a partir de soluciones de caldo recién preparadas.
  2. Pipetear 25 μL de extracto en un pozo de microplacas, añadir 75 μL de agua destilada y luego añadir 25 μL de reactivo Folin–Ciocalteu.
  3. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 6 minutos.
  4. Añade 100 μL de solución de carbonato de sodio al 7% (p/v) a cada pozo.
  5. Incuba la mezcla de reacción a temperatura ambiente en la oscuridad durante 90 minutos.
  6. Mide la absorbancia a 665 nm usando un espectrofotómetro de microplacas.
  7. Preparar una curva de calibración usando ácido gálico como estándar y calcular el contenido fenólico total, expresando los resultados en mg de equivalentes de ácido gálico (GAE) por mL de extracto.

5. Análisis fitoquímico usando LC-MS/MS

NOTA: Realizar análisis LC-MS/MS según métodos cromatográficos previamente publicados con modificacionesmenores 34. Filtrar todas las muestras y fases móviles a través de filtros de membrana de 0,22 μm y desgasificar las fases móviles antes del análisis.

  1. Selecciona el extracto que muestre el mayor contenido fenólico total para el perfil fitoquímico cuantitativo.
  2. Realizar separación cromatográfica usando una columna de C18 en fase inversa mantenida a 30°C.
  3. Preparar la fase móvil compuesta por (A) 0,1% de ácido fórmico en agua desionizada y (B) 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo, fijar el caudal a 0,4 mL/min, ajustar el volumen de inyección a 5 μL y fijar el tiempo total de funcionamiento a 17 min.
  4. Realizar detección por espectrometría de masas bajo condiciones de ionización por electropulverización (ESI) utilizando nitrógeno como gas de secado, vaina y nebulización.
  5. Ajustar la temperatura del gas de secado a 350 °C con un caudal de 12 L/min, ajustar la temperatura del gas de la vaina a 250 °C con un caudal de 5 L/min, y ajustar la presión del nebulizador a 55 psi.
  6. Preparar curvas de calibración externas para cada patrón fenólico y cuantificar los analitos usando las curvas de calibración correspondientes.

6. Prueba de actividad antimicrobiana

NOTA: Evalúe la actividad antibacteriana utilizando el método de difusión del pozo de agar según protocolos microbiológicos establecidos. Realizar todos los procedimientos microbiológicos en condiciones asépticas en un gabinete de bioseguridad. Esteriliza todos los materiales antes y después de usarlos.

  1. Selecciona las siguientes cepas tipo para pruebas antimicrobianas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, y Enterobacter aerogenes ATCC 13048.
  2. Inocular cada cepa bacteriana en caldo de soja de triptona (TSB) e incubar a la temperatura óptima de crecimiento hasta alcanzar una densidad óptica de OD₆₀₀ = 0,7.
  3. Distribuye los cultivos bacterianos de forma uniforme sobre placas de agar de soja con triptona (TSA) usando un hisopo estéril.
  4. Perfora los pozos asépticos en el agar usando un barrenador de corcho estéril.
  5. Añadir 100 μL de cada extracto (100 μg/mL) en los pozos correspondientes.
  6. Incuba las placas a 37 °C durante 18 horas.
  7. Mide los diámetros de las zonas de inhibición que rodean cada pozo para evaluar la actividad antimicrobiana.
  8. Realiza todos los experimentos en triplicado y expresa los resultados como valores medios.

7. Inhibición de biofilm

NOTA: Evalúe la actividad antibiofilm utilizando un ensayo de tinción violeta cristalina frente a cepas bacterianas de referencia. Realizar todos los procedimientos en condiciones asépticas y evitar alterar las biopelículas adheridas durante los pasos de lavado.

  1. Selecciona Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 como cepas de referencia y cultivalas en TSB a 37 °C hasta alcanzar la fase de crecimiento logarítmico.
  2. Ajustar las suspensiones bacterianas a una densidad óptica de OD₆₀₀ = 0,132.
  3. Pipetear 100 μL de soluciones extractadas (0,625–10 mg/mL) en placas estériles de microtitulación de poliestireno de 96 pozos, añadir 100 μL de suspensión bacteriana a cada pozo y mezclar suavemente.
  4. Incuba las placas a 37 °C durante 24 horas. Utiliza pozos que contienen TSB solo como blanks y pozos con suspensión bacteriana sin extracto como controles.
  5. Retira cuidadosamente las células no adherentes, lava los pozos dos veces con agua destilada y deja que las placas se sequen al aire.
  6. Añade 200 μL de solución de violeta cristalina al 0,4% (p/v) a cada pozo e incuba durante 30 minutos.
  7. Elimina el exceso de mancha, enjuaga los pozos dos veces con agua destilada y deja que las placas se sequen completamente.
  8. Añade etanol para solubilizar el tinte unido y mide la absorbancia a 595 nm usando un lector de microplacas.
  9. Calcula la actividad del antibiofilm usando la Ecuación (2).
    figure-protocol-2(2)

8. Cultivo celular y análisis de actividad citotóxica (ensayo MTT)

NOTA: Evalúe los efectos citotóxicos utilizando el ensayo MTT según los protocolos estándar de viabilidad celular. Realizar todos los procedimientos en condiciones estériles en un armario de bioseguridad y precalentar medios y reactivos a 37 °C antes de su uso.

  1. Obtener la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y de un repositorio celular acreditado y cultivar las células en el medio modificado Eagle (DMEM) de Dulbecco, suplementadas con suero fetal bovino al 10% (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de L-glutamina en25 cm de 2 frascos de cultivo.
  2. Mantener los cultivos a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga un 5% deCO2 y aumentar las células hasta aproximadamente un 80% de confluencia.
  3. Se desprenden las células por tripsinización, se siembran en placas de 96 pozos a una densidad de 2 × 104 células por pozo, e incuban durante 24 horas para permitir la inserción.
  4. Tratar las células con extractos de T. claveryi a concentraciones de 150, 300, 600, 1200 y 2000 μg/mL e incubarlas durante 24 horas.
  5. Retirar el medio de cultivo, añadir 100 μL de medio fresco que contenga 10 μL de solución MTT a cada pozo e incubar durante 4 horas a 37 °C.
  6. Aspirar el medio, disuelver los cristales de formazan añadiendo 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pozo y medir la absorbancia a 570 nm usando un espectrofotómetro de microplacas.
  7. Realiza todos los experimentos en triplicado.

figure-protocol-3
Figura 1: Resumen esquemático del flujo de trabajo experimental. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

9. Análisis estadístico

  1. Realizar análisis estadísticos utilizando paquetes de software estadísticos adecuados y comparar grupos de control y tratamiento utilizando la prueba t de Student o el análisis bidireccional de varianza (ANOVA), según corresponda.
  2. Expresa todos los datos como media ± error estándar de la media (SEM).
  3. Define la significación estadística en p < 0,05.
  4. Indicar significación estadística en cifras usando asteriscos de la siguiente manera: **** para p < 0,0001, *** para p < 0,001, ** para p < 0,01 y * para p < 0,05, y usar "ns" para denotar la no significación.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificación molecular de T. claveryi
La amplificación por PCR de la región ITS se realizó utilizando los cebadores universales ITS1 e ITS4 para la identificación molecular de T. claveryi. Las secuencias resultantes fueron analizadas y comparadas con secuencias de referencia en la base de datos NCBI utilizando el algoritmo BLAST, permitiendo la identificación definitiva de especies (Archivo suplementario 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente estudio establece una plataforma comparativa y estandarizada de extracción–bioactividad para T. claveryi, demostrando que la estrategia de extracción es un determinante decisivo tanto de la composición química como de la funcionalidad biológica. La principal fortaleza metodológica de este protocolo radica en el estricto control de los parámetros de extracción, especialmente la proporción sólida-líquido fija, el volumen estandarizado de disolventes, el proceso post-ex...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran intereses en competencia. Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el manuscrito principal y en los archivos de información complementaria. Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles por el autor correspondiente a petición razonable.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declararon que este estudio no ha recibido apoyo financiero.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placas de microtitulación de poliestireno de 96 pozosNest Scientific701001Placas de cultivo celular / ensayo
ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico))Sigma-AldrichA3219Ensayo de recuperación radical catiónico
Acetona (grado analítico)Sigma-Aldrich179124Disolvente de extracción
Acetonitrilo (grado LC-MS)Sigma-Aldrich34851Fase orgánica móvil
Acinetobacter baumanniiATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 17978
Triple quad LC-MS/MS con sistema UPLC 1290 InfinityAgilent Technologies6460Análisis cuantitativo
Columna analítica (C18, 4,6 y veces 100 mm, 3,5 y mu; m)Tecnologías Agilent (Zorbax)959990-902Columna de fase inversa
Estándares antioxidantes (ácido ascórbico / Trolox)Sigma-AldrichA7506 / 238813Controles positivos
Analizadores de ADN Applied Biosystems 3730xlBiosistemas Aplicados Analizadores de ADN 3730xlSistema de secuenciación de ADN
Biosistemas Aplicados y comercio; BigDye y comercio; Kit de secuenciación de ciclos Terminator v3.1Biosistemas Aplicados 4337455Kit de secuenciación Sanger
Bacillus cereusATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 14579
Análisis de bioinformática, software BioEdit, algoritmo utilizado: ensamblaje contig CAPIbis BiosciencesNASoftware de ensamblaje de secuencias
Dedal de extracción de celulosaFisherbrand y comercio;  11724043Utilizado para la extracción de Soxhlet
Dimetilsulfóxido (DMSO)Merck102952Disolvente
Kit de aislamiento de ADN (Plant & Plant & Kit de aislamiento de ADN de hongos (Polonia)EurX GeneMATRIXE3595Aislamiento de ADN 
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidril)Sigma-AldrichD9132Ensayo radical de saqueo
Eagle Medium Modificado de DulbeccoCapricornio,  DMEM-HA
Enterobacter aerogenesATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 13048
Enterococcus faecalisATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 29212
Escherichia coliATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 25922
EtanolMerck100983Disolvente
Acetato de etiloMerck109623Disolvente de extracción
Suero fetal bovino (FBS)Capricorn ScientificFBS-16A
Kit de secuenciación de ciclos BigDyeTerminator v3.1ThermoFisher4337455Kit de secuenciación
Reactivo Folin-CiocalteuSigma-Aldrich & nbsp;47641Contenido fenólico total
Ácido fórmicoSigma-Aldrich & nbsp;33015Aditivo de fase móvil
Ácido galoCarlo Erba406335Curva de calibración
Planta y Matriz Genética Kit de aislamiento de ADN de hongosEurX E3595Kit de aislamiento de ADN
GraphPad Prism (v9)Visualización de datos y análisis estadísticoN/AAnálisis estadístico
Manto calefactorElectrotérmica y Electrotermalia;EME30500Se usa para mantener el reflujo del disolvente
HighPrep y comercio; Sistema de limpieza de PCRMAGBIOAC-60005
HieloGrado de laboratorio—Control de temperatura durante los EAU
Klebsiella pneumoniaeATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 13883
L-glutaminaCapricorn ScientificAlemania
Listeria monocytogenesATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 19115
LiofilizadorScientzN/ALiofilización de extractos
Cuenta magnética y guion; sistema de limpieza basado en PCRMAGBIOAC-60005PCR
MetanolMerck106009Disolvente de extracción
n-HexanoMerck103701Disolvente de extracción
Penicilina/EstreptomicinaCapricorn ScientificAlemania
Pseudomonas aeruginosaATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 27853
Papel de filtro (nº 541)Cytiva1541-125 VEn el proceso de filtración por extracto
Evaporador rotatorioBuchi R10011100V101Eliminación de disolventes
Shigella dysenteriaeATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 13313
Carbonato de sodioMerck106392Análisis fenólico total
Lector de microplacas nano SPECTROstar  BMG LabtechMediciones de absorbancia
Staphylococcus aureusATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 25923
Staphylococcus epidermidisATCCManassas, VA, EE. UU.ATCC 12228
Software de análisis estadístico (SPSS, v23)Análisis de datosNA
Thermo Scientific Nanodrop 2000 Thermo Fisher ScientificND-2000
Agar de soja de triptona (TSA)MerckAlemania—
Caldo de soja de triptona (TSB)MerckAlemania—
Homogeneizador ultrasónicoScientzSCIENTZ-650LExtracción asistida por ultrasonidos

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wasser, S. P., Weis, A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (Review). Int. J. Med. Mushrooms. 1 (1), 31-62 (1999).
  2. Wasser, S. P. Current findings, future trends, and unsolved problems in studies of medicinal mushrooms. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89 (5), 1323-1332 (2011).
  3. Badalyan, S. Medicinal aspects of edible ectomycorrhizal mushrooms. Edible Ectomycorrhizal Mushrooms: Current Knowledge and Future Prospects. Zambonelli, A., Bonito, G. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 317-334 (2012).
  4. El Enshasy, H. A., Hatti-Kaul, R. Mushroom immunomodulators: unique molecules with unlimited applications. Trends Biotechnol. 31 (12), 668-677 (2013).
  5. Morte, A., Kagan-Zur, V., Navarro-Ródenas, A., Sitrit, Y. Cultivation of desert truffles—A crop suitable for arid and semi-arid zones. Agronomy. 11 (8), 1462(2021).
  6. Gutiérrez, A., Morte, A., Honrubia, M. Morphological characterization of the mycorrhiza formed by Helianthemum almeriense Pau with Terfezia claveryi Chatin and Picoa lefebvrei (Pat.) Maire. Mycorrhiza. 13 (6), 299-307 (2003).
  7. Loizides, M., Hobart, C., Konstandinides, G., Yiangou, Y. Desert truffles: the mysterious jewels of antiquity. Field Mycology. 13 (1), 17-21 (2012).
  8. Atila, F., Kazankaya, A. Terfezia species natural distributed in Türkiye and their ecologies. Mantar Dergisi. 13 (3), 119-130 (2022).
  9. Türkoğlu, A., Castellano, M., Trappe, J., Yaratanakul Güngör, M. Turkish truffles I: 18 new records for Turkey. Turkish J. Bot. 39, 359-376 (2015).
  10. Doğan, H., Kurt, F. New macrofungi records from Turkey and macrofungal diversity of Pozantı-Adana. Turkish J. Bot. 40, 209-217 (2016).
  11. İnci, Ş, Kırbağ, S. Nutritional content, antioxidant and antimicrobial activity of Terfezia claveryi Chatin. Artvin Çoruh Univ. J. For. Fac. 19 (2), 138-143 (2018).
  12. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  13. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P T. 40 (4), 277-283 (2015).
  14. Cushnie, T. P. T., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
  15. Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 39 (1), 44-84 (2007).
  16. Morte, A., Honrubia, M., Gutiérrez, A. Biotechnology and cultivation of desert truffles. Mycorrhiza: State of the Art. Varma, A. , 467-483 (2008).
  17. Corrêa, R. C. G., et al. Biotechnological, nutritional and therapeutic uses of Pleurotus spp. related with its chemical composition: a review. Trends Food Sci Technol. 50, 103-117 (2016).
  18. Ma, G., et al. A critical review on the health promoting effects of mushrooms nutraceuticals. Food Sci. Hum. Wellness. 7 (2), 125-133 (2018).
  19. Reis, F. S., et al. Functional foods based on extracts or compounds derived from mushrooms. Trends Food Sci. Technol. 66, 48-62 (2017).
  20. Mandeel, Q. A., Al-Laith, A. A. Ethnomycological aspects of the desert truffle among native Bahraini and non-Bahraini peoples. J. Ethnopharmacol. 110 (1), 118-129 (2007).
  21. Patel, S. Food, health and agricultural importance of truffles: a review. Curr. Trends Biotechnol. Pharm. 6, 15-27 (2012).
  22. Janakat, S., Nassar, M. Hepatoprotective activity of desert truffle (Terfezia claveryi) compared with Nigella sativa in rats. Pak. J. Nutr. 9, 52-56 (2010).
  23. Al-Laith, A. A. A. Antioxidant components and activities of desert truffle (Tirmania nivea). J. Food Compos. Anal. 23 (1), 15-22 (2010).
  24. Shavit, E., Shavit, E. The medicinal value of desert truffles. Desert Truffles. Kagan-Zur, V., Roth-Bejerano, N., Sitrit, Y., Morte, A. 38, 323-340 (2014).
  25. Patel, S., et al. Potential health benefits of natural products derived from truffles. Trends Food Sci. Technol. 70, 1-8 (2017).
  26. Beara, I. N., et al. Phenolic profile, antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities of truffles. Food Chem. 165, 460-466 (2014).
  27. Dahham, S. S., et al. Antioxidant, anticancer and apoptosis properties of Terfezia claveryi. Saudi J. Biol. Sci. 25 (8), 1524-1534 (2018).
  28. Azmir, J., et al. Techniques for extraction of bioactive compounds: a review. J. Food Eng. 117 (4), 426-436 (2013).
  29. Kumar, M., Shukla, P. K. PCR targeting of ITS regions for rapid diagnosis of mycotic keratitis. J. Clin. Microbiol. 43 (2), 662-668 (2005).
  30. Bondet, V., Brand-Williams, W., Berset, C. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH method. LWT Food Sci. Technol. 30, 609-615 (1997).
  31. Re, R., et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS assay. Free Radic. Biol. Med. 26 (9-10), 1231-1237 (1999).
  32. Đorđević, T. M., et al. Effect of fermentation on antioxidant properties of cereals. Food Chem. 119 (3), 957-963 (2010).
  33. Herald, T. J., et al. High-throughput micro plate assays for screening flavonoid content and DPPH-scavenging activity in sorghum bran and flour. Sci. Food Agric. 92 (11), 2326-2331 (2012).
  34. Kısa, D., et al. Evaluation of Biological Potency of two Endemic Species Integrated with in vitro and in silico Approches: LC-MS/MS Analysis of the Plants. Chem. Biodivers. 21 (3), e202301351(2024).
  35. Kumoro, A., Singh Hasan, Effects of solvent properties on the soxhlet extraction of diterpenoid lactones from andrographis paniculata leaves. ScienceAsia. 35, 306-309 (2009).
  36. Ng, Z. X., Samsuri, S. N., Yong, P. H. The antioxidant index and chemometric analysis of tannin, flavonoid, and total phenolic extracted from medicinal plant foods with the solvents of different polarities. Food Process. Preserv. 44 (9), e14680(2020).
  37. Kıvrak, İ Analytical methods applied to assess chemical composition, nutritional value and ın vitro bioactivities of Terfezia olbiensis and Terfezia claveryi from Turkey. Food Anal. Methods. 8 (5), 1279-1293 (2015).
  38. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2015).
  39. Monteiro, M., et al. Effect of extraction method and solvent system on the phenolic content and antioxidant activity of selected macro- and microalgae extracts. J. Appl. Phycol. 32 (1), 349-362 (2020).
  40. Pingret, D., et al. Degradation during application of ultrasound in food processing: A review. Food Control. 31, 593-606 (2013).
  41. Şahin, A., et al. Total phenol, antioxidant activity, fatty acid composition and mineral contents of the species of fungi known as domalan. J. Agroalimentary Process. Technol. 26 (3), 149-154 (2020).
  42. Fidan, M., et al. cytotoxic and protective effects of truffles. Anal. Biochem. 641, 114566(2022).
  43. Awika, J. M., et al. Screening methods to measure antioxidant activity of sorghum (sorghum bicolor) and sorghum products. J. Agric. Food Chem. 51 (23), 6657-6662 (2003).
  44. Gursoy, N., et al. Antioxidant activities, metal contents, total phenolics and flavonoids of seven Morchella species. Food Chem. Toxicol. 47 (9), 2381-2388 (2009).
  45. Elsayed, E., et al. Truffles: A potential source of bioactive compounds. Bioactive Compounds in Food. , CRC Press. 163-174 (2021).
  46. Elsayed, E. A., et al. Mushrooms: a potential natural source of anti-inflammatory compounds for medical applications. Mediators Inflamm. 2014, 805841(2014).
  47. Stanikunaite, R., et al. Cyclooxygenase-2 inhibitory and antioxidant compounds from the truffle Elaphomyces granulatus. Phytother. Res. 23 (4), 575-578 (2009).
  48. Doğan, H. H., Aydın, S. Determination of antimicrobial effect, antioxidant activity and phenolic contents of desert truffle in Turkey. Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med. 10 (4), 52-58 (2013).
  49. Abu-Odeh, A., et al. In vitro and In vivo Antidiabetic Activity, phenolic content and microscopical characterization of Terfezia claveryi. Molecules. 27 (15), 4843(2022).
  50. Nguyen, V., et al. Chlorogenic Acid: A systematic review on the biological functions, mechanistic actions, and therapeutic potentials. Nutrients. 16 (7), 924(2024).
  51. Suhag, R., et al. Mapping antioxidant mechanisms in plant extracts via reactivity kinetics inhibiting oil autoxidation. Appl. Food Res. 5 (2), 101476(2025).
  52. Harir, M., et al. Evaluation of antimicrobial activity of Terfezia arenaria extracts collected from Saharan desert against bacteria and filamentous fungi. 3 Biotech. 9 (7), 281(2019).
  53. Hamza, A., et al. Nutraceutical potential, antioxidant and antibacterial activities of Terfezia boudieri Chatin, a wild edible desert truffle from Tunisia arid zone. Arab. J. Chem. 9 (3), 383-389 (2016).
  54. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2020).
  55. Dib, S., Fortas, Z. Antimicrobial activities of desert truffle extracts and their chemical ıdentification. J. Pharm. Pharmacol. 7, 1-7 (2019).
  56. Gargano, M. B., et al. Antimicrobial activity of the extracts of Terfezia Claveryi and Tirmania Pinoyi against gram-positive and gram-negative bacteria causal agent of diseases in tomato. Chem. Eng. Trans. 58, 73-78 (2017).
  57. Khojah, H. M. J., et al. Antimicrobial efficacy of extracts of Saudi Arabian desert Terfezia claveryi truffles. Saudi J. Biol. Sci. 29 (11), 103462(2022).
  58. Akyüz, M., et al. Cytotoxicity and DNA protective effects of the Terfezia and Picoa species from the eastern region of Turkey. Istanbul J. Pharm. 51 (2), 198-203 (2021).
  59. Al Obaydi, M. F., et al. Terfezia boudieri: A Desert Truffle With Anticancer and Immunomodulatory Activities. Front. Nutr. 7, 38(2020).
  60. Pakrashi, S., et al. Quercetin alleviates 6-OHDA-caused apoptosis in SH-SY5Y cells. Toxicol. Res. 13 (4), tfae117(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Terfezia ClaveryiExtraction MethodsIn Vitro BioactivityAntioxidant ActivityAntimicrobial ActivityCytotoxic ActivityUltrasound Assisted ExtractionMaceration Assisted ExtractionPhenolic CompoundsLC MS MS Analysis

Related Articles