Un modelo murino de ablación linfática cardíaca con donante mediante electrocauterización para investigación de trasplantes

Resumen

Desarrollamos un modelo novedoso de ratón de ablación linfática cardíaca con donante en trasplante de corazón. Este modelo demuestra que la alteración de los linfáticos del donante atenúa el rechazo agudo, reduce la lesión miocárdica y prolonga la supervivencia del injerto, proporcionando nuevos conocimientos sobre la función linfática cardíaca en la inmunidad al trasplante.

Resumen

Aunque los vasos linfáticos cardíacos han recibido cada vez más atención en los últimos años, la relación entre el sistema linfático cardíaco donante y el rechazo agudo en el trasplante cardíaco sigue por esclarecerse.

La actividad electrofisiológica cardíaca se evaluó mediante electrocardiografía (ECG) en ratones normales antes y después de la ablación linfática cardíaca. Los principales vasos linfáticos de los corazones de donantes se visualizaron mediante la inyección de Evans Blue y posteriormente se ablacionaron mediante electrocauterización. Se estableció un modelo de trasplante cardíaco con disfunción linfática cardíaca de donante utilizando corazones sometidos a ablación linfática. La función del injerto cardíaco se evaluó mediante ecocardiografía, western blot y ELISA. El impacto de la ablación linfática con donante en el rechazo agudo se evaluó mediante la tinción por hematoxilina-eosina (HE) y el seguimiento del tiempo de supervivencia del injerto.

Los resultados del ECG no indicaron cambios significativos en la electrofisiología cardíaca antes ni después de la ablación linfática, confirmando que los principales vasos cardíacos permanecieron intactos. Se inyectó Evans Blue en el ápice cardíaco para marcar los vasos linfáticos. Posteriormente, los linfáticos principales se ablacionaron mediante electrocauterización. Tras completar el procedimiento de ablación, los ratones fueron heparinizados y posteriormente se les extrajeron los corazones. Se seccionaron la aorta y la arteria pulmonar, y se ligaron las venas cavas superior/inferior, junto con las venas pulmonares. Los corazones de donante preparados (ablados) fueron trasplantados después. Los niveles de cTnI y fracción de eyección demostraron que la ablación linfática no agravó la lesión cardíaca. La tinción con HE reveló que la ablación de linfáticos cardíacos de donante aliviaba el rechazo agudo, reducía la lesión miocárdica y prolongaba la supervivencia del injerto.

Establecimos con éxito un modelo de trasplante de corazón murino con disfunción linfática cardíaca de donante y demostramos que la ablación de linfáticos cardíacos de donante puede mitigar el rechazo agudo, atenuar el daño miocárdico y prolongar la supervivencia del injerto. Estos hallazgos aportan nuevas perspectivas y una base para comprender el papel del sistema linfático cardíaco en el trasplante de corazón.

Introducción

El rechazo de aloinjerto cardíaco sigue siendo una de las complicaciones más comunes y graves tras el trasplante cardíaco, clasificándose principalmente en rechazo celular agudo y rechazo mediado por anticuerpos. Aunque las terapias inmunosupresoras modernas han mejorado significativamente las tasas de supervivencia del injerto, el rechazo sigue siendo un factor determinante en los resultados del trasplante. Según la literatura, aproximadamente el 12% de los pacientes experimentan al menos un episodio de rechazo agudo moderado o severo durante el primer año tras el^{trasplante 1}.

El sistema linfático cardíaco ha recibido cada vez más atención por su posible papel en el rechazo de trasplantes. Más allá de sus funciones bien establecidas en el equilibrio de líquidos y la vigilancia inmunitaria, el sistema linfático desempeña un papel importante en la modulación de las respuestas inmunitarias. Los vasos linfáticos actúan como los conductos principales para que las células inmunitarias entren y salgan de los^{tejidos 2,3}. En el corazón, la red linfática proporciona la infraestructura fundamental para el transporte y recirculación de las células inmunitarias, incluidos los linfocitos. A través de esta vía, los linfocitos migran del torrente sanguíneo al espacio intersticial, donde realizan vigilancia inmunitaria. Posteriormente, se drenan hacia los ganglios linfáticos y finalmente regresan a la circulación^{sistémica 2,4}. Además, los estudios indican que las células T y sus subconjuntos desempeñan un papel central en las respuestas agudas al rechazo, y que la activación y migración de estas células puede estar influida por el sistema^{linfático 5}.

Aunque se sabe que los vasos linfáticos existen en el corazón y forman redes análogas a vasos sanguíneos, su importancia no ha recibido una atención comparable a lo largo de los años. Los estudios han demostrado que la ausencia de vasos linfáticos funcionales conduce a una hipertrofia cardíaca marcada y edema, lo que indica un papel crucial de los linfáticos en el mantenimiento de la homeostasis del tejido^{cardíaco 6}. Además, un drenaje linfático deficiente o ausente puede reducir la eficiencia de la eliminación de células inflamatorias, agravando así las respuestas inflamatorias locales e influyendo en el proceso de remodelación cardíaca⁷.

En las enfermedades cardíacas, existen diversas intervenciones dirigidas a los vasos linfáticos. En modelos murinos, la deficiencia linfática cardíaca puede inducirse generando ratones Vegfc+/-⁸. Clínicamente, se pueden emplear la embolización linfática intervencionista^{mediastínica 9} y la cirugía pericárdica pericárdica^{mínimamente invasiva 10} para tratar el derrame pericárdico quiloso. En pacientes con fisiología circulatoria de Fontan, la descompresión linfática puede lograrse^{quirúrgicamente 11}, mediante descompresión percutánea del conducto^{torácico 12}, o estableciendo una anastomosis linfovenosa¹³. Las técnicas de oclusión incluyen embolización del conducto^{torácico 14}, embolización selectiva del conducto^{linfático 15} y ligadura del conducto^{torácico 16}. Sin embargo, las intervenciones directas dirigidas a los propios vasos linfáticos cardíacos siguen siendo limitadas.

Dado el papel fundamental de los vasos linfáticos cardíacos, establecimos un modelo novedoso de trasplante de corazón murino ablando los principales vasos linfáticos en corazones de donantes mediante electrocauterización. Este modelo se utilizó para investigar el impacto de la disfunción linfática del injerto de donante en el rechazo agudo tras el trasplante.

Protocolo

Los ratones machos C57BL/6J y BALB/c (machos, de 6-8 semanas, 25-28 g de peso corporal) se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital Fuwai (Nº de aprobación: 0108-7-800-ZX(X)-019).

Visualización y ablación de vasos linfáticos cardíacos en ratones
Para simular la disfunción linfática cardíaca, se ablacionaron los principales vasos linfáticos cardíacos mediante electrocauterización.

Todos los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol al 1,25% a una dosis de 0,2 mL por cada 10 g de peso corporal y ventilados mecánicamente durante todo el procedimiento. Tras la anestesia con tribromoetanol, los ratones BALB/c fueron intubados endotraqueales con un catéter calibre 22 y fueron conectados a electrocardiogramas (ECG) (Figura 1A, Figura suplementaria S1). En los parámetros del ventilador, la proporción respiratoria se estableció en 1:1 o 1:2, con un volumen de marea de 0,3 mL y una frecuencia respiratoria de 100 respiraciones/min. Tras conectar el catéter al ventilador, se vigilaba de cerca el estado del ratón; La intubación se consideraba exitosa si la frecuencia respiratoria del ratón coincidía con la del ventilador, mientras que tasas inconsistentes o distensión abdominal indicaban fallo que requiriera reintubación. Posteriormente se realizó una toracotomía en el espacio intercostal izquierdo 3-4 con una incisión de aproximadamente 1 cm, y se utilizó un separador para exponer todo el corazón (Figura 1B). Posteriormente, se inyectaron 5 μL de colorante azul de Evans intramuscularmente en el ápice cardíaco para visualizar los vasos linfáticos, con un periodo de espera de 1 minuto tras la inyección para permitir la ostagnación completa (Figuras 1C, E; Figura suplementaria S2A-B), señalando que el azul de Evans debe inyectarse muy lentamente. Tras la visualización, se confirmó la ubicación de los principales vasos linfáticos cardíacos comparándola con los datos anatómicos previamente^{reportados 17,18}, y la ablación se realizó utilizando un bolígrafo electrocauterizado ajustado a 10 W en modo continuo, con un tiempo de coagulación de aproximadamente 3-7 segundos (Figura 1D,F). La electrocardiografía (ECG) se monitorizó antes y después de la ablación para asegurar la ausencia de lesión vascular (Figura 1G,H). Finalmente, tras una ablación linfática mayor, los ratones fueron heparinizados en preparación para la posterior extracción de corazón de donante. Una representación esquemática del procedimiento quirúrgico se ofrece en la Figura 2.

Trasplante de corazón heterotópico abdominal
El trasplante de corazón heterotópico en la cavidad abdominal de ratones se realizó como se describió^{anteriormente 19}. A continuación se resume un breve protocolo:

Procedimiento con donante
Se realizó una laparotomía a lo largo de la línea blanca en ratones BALB/c, y se inyectó 1 mL de suero fisiológeno de 50 U/mL a 4 °C en la vena cava inferior, mientras que se cortó la aorta abdominal para inducir heparinización sistémica. Tras esto, el corazón quedó expuesto, y 8-0 Se usaron suturas para ligar la vena cava superior izquierda y derecha, que luego se transectaron en el extremo distal de las suturas (Figuras 3A,B). Posteriormente, la aorta fue aislada del tejido adiposo circundante y cortada cerca del arco aórtico (Figura 3C), y se realizó un procedimiento similar para aislar y transectar la arteria pulmonar (Figura 3D). La vena cava inferior del segmento torácico fue ligada con 8-0 suturas y transectaciones en el extremo distal (Figura 3E), tras lo cual las venas pulmonares se ligaron y transectaron usando suturas trenzadas de seda 7-0 (Figura 3F). Finalmente, el corazón del donante extirpado se conservó en solución fisiológica salina a 4 °C para su posterior trasplante, conservando todos los corazones durante aproximadamente 30 minutos para garantizar la consistencia experimental.

Procedimiento de receptor
Anestesiar a los ratones receptores de C57BL/6J en preparación para el trasplante de corazón abdominal. Se realizó una laparotomía a lo largo de la línea blanca para exponer la aorta abdominal y la vena cava inferior del ratón receptor (Figura 4A). Tras ligar los vasos de la rama dorsal de la vena cava inferior con suturas de nailon 10-0, se utilizaron pinzas vasculares para ocluir el flujo sanguíneo a través de la aorta abdominal y la vena cava inferior (Figura 4B). Posteriormente, se creó una ventana en la aorta abdominal y la vena cava inferior del ratón receptor, y la sangre se eliminó de los vasos con solución fisiológica de heparina. Utilizando suturas de nailon 11-0, se realizó una anastomosis extrema a lateral para conectar la arteria pulmonar del corazón donante con la vena cava inferior del receptor y la aorta del corazón donante con la aorta abdominal del receptor (Figura 4C-E). Finalmente, se liberaron las pinzas vasculares para restablecer el flujo sanguíneo al ratón receptor (Figura 4F).

Diseño experimental
Grupo experimental: Se visualizaron vasos linfáticos cardíacos en ratones BALB/c utilizando tinte azul Evans y ablacionados con un bolígrafo electrocauterizado. Los corazones de ratones BALB/c con vasos linfáticos ablados fueron trasplantados a ratones C57BL/6J.

Grupo control: Se visualizaron los vasos linfáticos cardíacos en ratones BALB/c utilizando el tinte Evans Blue, pero no se realizó ablación. Los corazones de ratones BALB/c fueron trasplantados a ratones C57BL/6J.

En este estudio, el tamaño de la muestra se estandarizó en todos los grupos y puntos de tiempo experimentales, con n=5 ratones por grupo para los ensayos realizados a las 24 horas del trasplante cardíaco, n=5 por grupo para los ensayos a los 7 días posteriores al trasplante y n=5 por grupo para la observación del tiempo de supervivencia del injerto cardíaco.

Los corazones de donante extraídos se conservaron en solución salina helada a 4 °C durante 30 minutos antes del trasplante cardíaco. Tanto los corazones de donante experimental como el de control se mantuvieron en solución salina durante la misma duración.

La duración del batido de los injertos cardíacos se evaluó diariamente mediante palpación en ambos grupos (n=5 por grupo).

Evaluación histológica y puntuación por rechazo parénquimico (PR)
Las muestras de tejido miocárdico fueron fijadas en formol al 10% durante 48 horas, seguidas de deshidratación mediante una serie graduada de etanol (70%, 80%, 95%, 100%), eliminación de xileno, incrustación de parafina y sección de microtomos (4 μm), con las secciones resultantes teñidas con hematoxilina y eosina (H&E). El rechazo del injerto se evaluó utilizando la puntuación PR para el trasplante de corazón, y el grado de lesión del injerto se evaluó de forma^{cega 20}.

Examen ecocardiográfico
La función cardíaca se evaluó utilizando el sistema de ultrasonido (transductor de sonda 550 MHz). Los ratones se colocaron en posición supina sobre una plataforma animal giratoria de 360 grados. Tras la extracción del vello abdominal, se evaluó la función cardíaca bajo anestesia isoflurana al 1,0%. La fracción de eyección (FE) del injerto cardíaco se midió mediante ecocardiografía en modo M.

Detección de marcadores de lesión miocárdica
La extensión del daño tisular miocárdico se evaluó midiendo la expresión de enzimas específicas de cardiomiocitos en el suero. Los niveles de troponina I cardíaca (cTnI) se analizaron según las instrucciones del fabricante.

Western blot
A las 24 horas tras el trasplante cardíaco, se recogió tejido miocárdico de las principales regiones de los vasos linfáticos de los injertos cardíacos tanto en el grupo control como en el experimental. Siguiendo el protocolo²¹ previamente descrito, se analizó la expresión de marcadores asociados a los vasos linfáticos. Los tejidos cardíacos se lisaron completamente en un tampón de lisis RIPA que contenía inhibidores de proteasas (fluoruro de fenil metano). Antes de la desnaturalización térmica, la concentración de proteínas se determinaba mediante un kit de BCA y se ajustaba a una concentración uniforme. La proteína total de cada grupo se separaba mediante SDS-PAGE y posteriormente se transfería a una membrana PVDF. La membrana PVDF se bloqueó con leche desnatada al 5% (temperatura ambiente durante 1-2 horas) y luego se incubó durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios correspondientes. Al día siguiente, la membrana fue tratada con un anticuerpo secundario (anti-conejo, 1:1000) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las tiras de membrana se incubaron con solución ECL (1-2 mL) y se expusieron para capturar las imágenes.

Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: anticuerpo policlonal LYVE1 (1:500), anticuerpo de podoplanina (1:500) y receptor anti-VEGF 3 (1:50).

Análisis estadístico
Todos los resultados se expresan como media ± error estándar de media (SEM). Al comparar dos grupos, se realizaron análisis estadísticos utilizando la prueba t de Student o la prueba Wilcoxon de suma de rangos, dependiendo de la distribución de datos y las características. La significación estadística se definió como p < 0,05.

Resultados

Evaluación de la función del injerto cardíaco
Se establecieron modelos murinos de trasplante cardíaco tanto en grupos de control como experimentales según el protocolo descrito. El estado funcional de los injertos se evaluó a las 24 horas del trasplante. El nivel de expresión de la troponina cardíaca sérica I (cTnI) fue mayor en el grupo experimental que en el grupo control, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 5A

Discusión

El sistema linfático cardíaco constituye un componente vital para mantener la homeostasis del líquido tisular y apoyar la función inmunitaria dentro del corazón. Al facilitar la reabsorción de líquido intersticial, el transporte lipídico y el tráfico celular inmunitario, garantiza el rendimiento cardíaco tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. En los últimos años, cada vez más evidencia ha puesto de manifiesto la implicación crítica del sistema linfático cardíaco en múltiples...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bolígrafo de electrocoagulación	Weitai	V70
Pinzas microscópicas	Jinzhong	WA3030
Pinzas microscópicas	Jinzhong	WA2040
Portaagujas microscópicas	Jinzhong	YZE010
Portaagujas microscópicas	Jinzhong	YZE020
Tijeras microscópicas	Jinzhong	YBC010
Tijeras microscópicas	Jinzhong	YBC020
Portaagujas	Jinzhong	J32010
Tijeras	Jinzhong	Y00010
Ventilador para pequeños animales	Zhuodi	DW-300