Artículo de método

Procedimiento accesible de sellado de silicona chip-membrana para una unión flexible y fiable

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DOI:

10.3791/69980

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20 de marzo de 2026

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1Department of Pathology and Medical Biology, EXPIRE Lab, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 2GRIAC Research Institute, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Department of Biomaterials and Biomedical Technology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Tissue Engineering and Cells Therapy Group (GITTC), School of Medicine, University of Antioquia, Alma Mater Hospital of Antioquia, 5Department of Pulmonary Diseases, University Medical Center Groningen, University of Groningen

En este artículo

Resumen

Un protocolo de sellado novedoso para producir sellos herméticos a base de silicona para membranas de dispositivos de chip de polidimetilsiloxano (PDMS). Destinado a laboratorios, montaje de modelos de chips y desarrollo de plataformas de chips a pequeña escala. Demostramos el protocolo utilizando membranas plásticas y tisulares nativas. Este procedimiento solo requiere PDMS, tolueno, moho, membrana y una cámara de vacío.

Resumen

Las plataformas órgano-en-chip son un aspecto en rápido crecimiento de la investigación biomédica. La expansión de este campo ha dado lugar a una variedad de materiales y metodologías diferentes para su construcción y aplicación. Aunque el número de dispositivos diferentes —ya sea comercializados o desarrollados en el ámbito académico— sigue creciendo, suele quedar un gran paso por dar para los nuevos investigadores que entran en el campo del órgano en chip. Uno de los temas centrales tanto en las tecnologías novedosas como en las actuales tecnologías de chips sigue siendo lograr un sellado seguro y libre de fugas de los dispositivos de chip. En este artículo, ofrecemos una nueva vía para el desarrollo de chips al presentar un flujo de trabajo de sellado de chips que produce conexiones fiables y herméticas entre chips de silicona y tres membranas de cultivo de diferentes materiales. El procedimiento presentado es accesible para el desarrollo de nuevos chips con materiales de entrada limitados y proporciona un órgano de interfaz aire-líquido (ALI) Organ-on-Chip. Estos chips están destinados a ser alimentados en cultivo celular a través de una membrana porosa y expuestos apicalmente al aire, como en un sistema de intestino, piel o, como en el caso presentado aquí, vía aérea sobre chip. Ofrecemos dos diseños diferentes de moldes de virutas en 3D, mostrando su unión a membranas plásticas comercialmente disponibles, así como a andamios de matriz extracelular porcina (ECM). Este Airway-on-Chip puede producirse internamente; aquí se presentan los diferentes obstáculos que pueden encontrarse, y una muestra de su uso previo como vía aérea en chip. Este nuevo procedimiento de sellado consiste en aspirar mortero de polidimetilsiloxano (PDMS) diluido con tolueno para eliminar el tolueno, lo que da lugar a una fina y resistente capa de silicona incrustada en la superficie porosa del plástico o de la membrana nativa de la ECM. La segunda novedad de este procedimiento es el curado a temperatura ambiente del mortero PDMS para evitar la ruptura de las membranas debido a la diferencia de expansión térmica en los materiales que se están sellando. Esto conduce a una técnica ampliamente aplicable para unir los materiales probados, produciendo chips PDMS de múltiples cámaras con membranas de cultivo internalizadas.

Introducción

Los dispositivos órgano-on-chip se están convirtiendo en una piedra angular de la investigación biomédica, con una amplia variedad de modelos comerciales y de acceso abierto desarrollándose en laboratorios de todo elmundo. A medida que estos modelos se convierten en una parte clave de la investigación, continuando reemplazando a los modelos estáticos tradicionales de plástico yanimales 2,3, es cada vez más importante que estos modelos sean fácilmente accesibles y estén disponibles para investigadores de diversos orígenes en todo el mundo. El centro de esto es la accesibilidad para lograr un desarrollo personalizado y en pequeños lotes, independiente de los costes de insumos yfabricación 4, especialmente en modelos no comerciales oacadémicos 1.

Uno de los mayores retos en las tecnologías On-Chip es lograr un sellado seguro de los chips sin fugas durante el flujo. Una revisión reciente sobre pruebas de fugas en dispositivos de chip identificó las fugas entre las cámaras o hacia el entorno como un modo principal para el fallo del modelo y experimental, tanto en la industria como en el ámbito académico 5,6. Existen varias razones para el fracaso en lograr un sellado exitoso: las pequeñas dimensiones de los dispositivos, el flujo y la presión aplicados, y principalmente el hecho de que estos dispositivos están compuestos por diferentes materiales sellados en capas y conectados con distintos procesos6. La variedad de materiales utilizados como membranas de cultivo en plataformas de chips es tan amplia como la de sus aplicaciones, incluyendo polietileno tereftalato (PET), policarbonato (PC), PDMS y membranasECM 1. Como resultado, existen numerosos procedimientos y tratamientos diferentes para conectar estos distintos materiales en los dispositivos finales. Estos procedimientos incluyen compresión con pegamento/PDMS, química del silano mediada por plasma, funcionalización química de estructuras, electrohilado y enlaces con disolventes vaporizados, dependiendo de los materiales involucrados en el modelo7. El hecho de que estos procesos requieran diferentes conjuntos de habilidades y entornos de laboratorio impone ciertos límites a la accesibilidad académica de la investigación On-Chip. Se ha identificado que, aunque los costes y limitaciones de participar en sistemas comerciales limitan el acceso académico, los largos procesos de construcción de chips y el equipo necesario limitan su desarrollo académicoindependiente 1,8,9. A la vanguardia de esta investigación, uno de los problemas actuales es la estandarización y validación de modelos para sureproducibilidad 10,11. Pero sigue existiendo una laguna para muchos laboratorios que intentan iniciar el desarrollo de chips para responder preguntas específicas de investigación, reemplazar trabajos con animales y trabajar en modelos más relevantesbiológicamente.

En este artículo, presentamos un flujo de trabajo de sellado de chips que solo requiere habilidades y equipos disponibles en la mayoría de los entornos de investigación. Este procedimiento produce interfaces chip-membrana PDMS herméticas para tres materiales de membrana diferentes. El proceso requiere solo un tiempo de trabajo activo limitado, puede realizarse en entornos de laboratorio sin chip y puede escalarse desde la producción de chips de lotes pequeños hasta medianos.

El procedimiento de sellado presentado puede realizarse con membranas plásticas porosas o ECM; Los chips de ejemplo proporcionados están construidos con este procedimiento para su aplicación como dispositivo de vía aérea en chip con exposición al aire. Este procedimiento puede utilizarse para otros dispositivos comparables, siempre que las membranas contengan poros, que son esenciales para el procedimiento. La aplicación principal de los chips proporcionados es para cultivos ALI y células epiteliales de las vías respiratorias, pero pueden emplearse para otras aplicaciones y modelos de cocultivo con células mesenquimales o intestinales, por ejemplo 8,13. El primer chip proporcionado es una vía aérea estándar con una zona de cultivo a gran escala (92mm 2) con dos cámaras de cultivo, incluyendo una cámara apical para la exposición al aire separada por una membrana porosa de la cámara basal que contiene medio y, opcionalmente, otro tipo de célula cultivada sumergida (por ejemplo, fibroblastos, células endoteliales). Para aplicaciones de ALI, es esencial que las células con semillas apicalmente sean capaces de mantener una barrera hermética para evitar la fuga de medios hacia el canal superior. El segundo chip tiene el mismo diseño que el primero, con dos cámaras adicionales a cada lado de la membrana, aquí con el uso de ECM porcina, para facilitar el estiramiento de la membrana de cultivo mediante la aplicación de presión negativa, imitando el estiramiento de una vía aérea nativa.

Nuestro proceso de sellado reúne varios elementos del campo del desarrollo de chips PDMS con la incorporación de condiciones novedosas, que son dobles. En primer lugar, la rápida aplicación del vacío al mortero PDMS diluido con tolueno, que previene el ataque químico del tolueno a las membranas, favorece la intrusión de silicona en los poros o características superficiales de la membrana, y conduce a una superficie delgada resistente al desplazamiento. El tolueno produce hinchazón y deformación en superficies sólidas de PDMS, pero a altas concentraciones actúa como disolvente, de ahí su uso para adelgazar PDMS líquidos en este procedimiento. Para plásticos como las membranas PC y PET utilizadas aquí, el tolueno causará distorsión y grietas por estrés si no se elimina rápidamente. Es fundamental tener cuidado al aplicar manualmente el mortero para aplicarlo solo sobre la pared de la semi-astilla preconstruida y nunca entrar en el área de cultivo, ya que esto bloqueará los poros de las membranas y producirá áreas de PDMS que causarán interrupciones y variaciones en la capacidad del cultivo celular. En segundo lugar, el curado del mortero PDMS a temperatura ambiente (RT) durante 72 h evita el desplazamiento de la membrana tanto de la mitad del chip como del mortero, lo que puede ocurrir a medida que los materiales se contraen en diferentes grados tras la expansión térmica.

Ofrecemos dos diseños de moldes de astillas que pueden fabricarse con una impresora 3D o microfresadora (como se describe en el Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2), así como el método para crear un mortero fino a partir de PDMS ytolueno 14. Este método permite sellar membranas plásticas comerciales (PET, PC) dentro de un dispositivo. Además, probamos el rango de aplicabilidad de este proceso creando el mismo chip con una membrana ECM nativa porcina para producir un chip biológico con capacidad de estiramiento cíclico. Como los órganos en chip están destinados a replicar las propiedades fisiológicas del entorno in vivo , las vías aéreas en chip que tienen la capacidad de producir las fuerzas mecánicas experimentadas en el cuerpo durante la respiración, como las tensiones cortantes del aire en flujo y el paisaje mecánico de las vías respiratorias que se estrechan, son altamente relevantesbiológicamente 16. La membrana utilizada consiste en la membrana basal, la lámina propia, así como colágeno, laminina y otras proteínas de la matriz circundante. Hasta donde sabemos, este es el primer chip nativo basado en membrana basal y el primero con posibilidad de estiramiento, facilitando así la imitación del estrés mecánico de, por ejemplo, la respiración, en una membranaECM 15 no siliconada. Esta novedosa aplicación destaca la función de nuestro procedimiento de sellado con plástico y ECM. Finalmente, presentamos la aplicación de este procedimiento de sellado de chip y membrana como una vía aérea en chip que puede utilizarse para el cultivo celularALI 8.

Protocolo

Este estudio estuvo exento de la aprobación del comité de ética bajo la Ley de Experimentos en Animales, ya que los materiales se obtuvieron a posteriori y no se sacrificaron animales con fines científicos (Wet op de dierproeven). El protocolo de aislamiento de las células epiteliales primarias de las vías respiratorias humanas se basó en el código de investigación del Centro Médico Universitario de Groningen (https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg consultado el 14 de enero de 2025) y en las directrices nacionales y éticas profesionales sobre el uso de material corporal humano (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf consultado el 14 de enero de 2025). Este estudio estuvo exento del requisito de aprobación del consejo de ética, ya que el tejido traqueobronquial era restante de trasplantes y estaba completamente anonimizado conforme al Código Civil neerlandés y al Wet op de orgaandonatie (ley de donantes).

1. Preparación de la media chip y la membrana

  1. Producción de chips
    1. Descargar . Archivos de diseño STL para las mitades superior e inferior del chip de los Archivos Suplementarios 1 y Archivo Suplementario 2 de este artículo. El molde superior produce una mitad de astilla de 5 mm de profundidad, el molde inferior una mitad de astilla de 3 mm de profundidad; ambas mitades de astillas tienen cámaras de cultivo de 1 mm de profundidad. Alternativamente, elabora un diseño de chip utilizando el software CAD adecuado.
    2. Prepara un archivo de corte para impresión 3D o un camino de fresado para microfresar los moldes de visuras. Los moldes micromecanizados estarán listos para usar; Los moldes impresos en resina requerirán dos lavados de etanol al 99,9% de 24 horas antes de la reticulación UV para prepararlos adecuadamente para su uso como molde PDMS.
  2. Producción de la mitad del chip PDMS (Figura 1)
    1. Mezcla bien la base líquida de PDMS con agente de curado en una proporción 10:1 y desgasifica en una cámara de vacío hasta eliminar todas las burbujas de aire.
    2. Llena los moldes con una jeringuilla de boquilla ancha, desgasifica durante ~10 minutos en una cámara de vacío hasta que se eliminen todas las burbujas. Coloca los mohos en un horno seco hasta que se curen durante 2 h a 65 °C.
    3. Quita las mitades sólidas de los moldes con un bisturí y corta el tapaillado de los bordes. Añade cuatro entradas en la mitad superior en cada extremo de la cámara y los dos anillos adyacentes que indican la ubicación de las entradas de la cámara inferior con un punzón de biopsia.
      NOTA: Para los resultados presentados, se utilizó una perforadora de biopsia de 2 mm y se insertó un tubo de silicona de 2 mm para el medio y el flujo de aire durante el cultivo. Las entradas de 1 mm y 2 mm facilitan la siembra de las células con una pipeta, correspondientes al tamaño de las puntas de 200 y 1000 μm, respectivamente. Otros tamaños de punzón pueden usarse para diferentes sistemas de tubos o bombas.
  3. Preparación de membranas (Figura 2)
    1. Descargar . Archivos de diseño STL para la plantilla de membrana del Archivo Suplementario 3 en este artículo. Prepara la plantilla mediante impresión 3D o un método de fabricación equivalente para asegurar una forma de membrana consistente.
    2. Coloca la plantilla sobre la membrana PET o PC, sujetándola firmemente mientras la membrana se corta con un bisturí.
      NOTA: En este punto, las membranas pueden recubrirse con proteínas matriciales para el cultivo celular en una placa de Petri sin interrumpir la unión de membranas. Esto asegurará que solo la membrana esté funcionalizada para el crecimiento celular, dejando las paredes del PDMS libres de células, como se describióanteriormente.

2. Enlace de membrana

  1. Preparación de morteros PDMS
    1. Mezcla PDMS líquido (paso 1.2.1) con tolueno en una proporción 7:5 y mezcla bien con jeringuilla arriba y abajo con una jeringuilla de boquilla ancha como se ha descritoanteriormente 14. Solo se necesitan 8 gotas para cada chip; Se recomienda 1,4 mL de PDMS con 1 mL de tolueno por lote de mortero y suficiente para 8 chips de esta escala. La mezcla consistente del mortero es importante para una unión fiable de membranas.
      PRECAUCIÓN: El tolueno es volátil y altamente inflamable. La exposición puede causar daños en los sistemas nervioso y respiratorio. Úsalo exclusivamente en una campana extractora, lejos de cualquier fuente de ignición, y gestiona los derrames con materiales absorbentes y ventilación. Durante el manejo, usa gafas protectoras para protegerte de salpicaduras y guantes impermeables (nitrilo). Deja que todos los materiales de laboratorio (puntas de pipeta, recipientes, etc.) estén 24 horas en la campana extractora, tras lo cual el tolueno se habrá evaporado y todos los materiales podrán ser eliminados en recipientes aprobados y etiquetados a través de servicios especializados en residuos. Nunca deseches el tolueno en un fregadero. Consulte la Hoja de Datos de Seguridad (SDS) para más información.
      NOTA: Prepara el mortero en el punto de uso para evitar la evaporación prematura del tolueno y la contaminación plástica, en un recipiente no de vidrio, preferiblemente desechable, y deséchalo directamente después de su uso. El PDMS curará la superficie del vidrio y será parcialmente inquitable; El tolueno disuelve y daña la mayoría de los plásticos que se usan comúnmente en laboratorio.
  2. Fijación de membrana PET/PC (Figura 2)
    1. Aplica rápidamente el mortero sobre la superficie de la mitad del chip PDMS donde se colocará la membrana con una punta de pipeta.
      NOTA: Toda la zona bajo la membrana debe humedecer con mortero. Se debe aplicar una sujeción firme con la punta para obtener la capa más fina posible. La microscopía indica que las capas están entre 3 y 5 μm.
    2. Sujeta la membrana preparada (paso 1.3) en un extremo con un par de pinzas limpias, coloca la punta sobre el mortero húmedo en la posición correcta para la astilla y deja que la membrana encaje en su sitio.
      NOTA: No permitas que la membrana se desplace después de este punto; la entrada de PDMS húmedos en la cámara producirá paredes irregulares e inutilizables en la membrana. Si se produce desplazamiento, la silicona cubrirá la zona del cultivo, lo que interrumpirá el potencial de cultivo celular a ambos lados de la membrana, descartará la membrana y repetirá el paso anterior.
    3. Sujeta suavemente la membrana con la pinza y vuelve a aplicar mortero PDMS sobre la parte superior de la membrana, alejándote suavemente de la cámara con cada pasada para eliminar burbujas y asegurar la membrana sin moverla de su posición original.
      NOTA: Ten cuidado de no aplicar PDMS en la zona de cultivo interno de la membrana; Esto es esencial, ya que la silicona evitará la adhesión celular y alterará la superficie natural de la membrana del cultivo.
    4. Coloca las mitades de astillas con membranas inmediatamente después de la fijación del mortero húmedo en una cámara de vacío y curas a temperatura ambiente bajo 25 mBar de vacío durante 72 horas.
      NOTA: Las mitades de astillas con membranas unidas deben curarse a temperatura ambiente. PET/PC y PDMS experimentan diferentes grados de expansión térmica, y el curado térmico hará que la silicona se expanda y luego se contraiga al enfriarse, produciendo una membrana distendida (Figura 3).
  3. Construcción completa del chip
    1. Las mitades de chip unidas a membrana pueden ahora unirse a la segunda mitad del chip. Para obtener resultados más consistentes, expone ambas mitades al tratamiento con plasmaO2 (320 mBar, 30 s) y presiónalas rápidamente a mano bajo una ligera presión.
      PRECAUCIÓN: Los hornos de plasma de oxígeno producen ambientes saturados de oxígeno, óxidos peligrosos como el ozono y radiación ultravioleta intensa. Los hornos deben instalarse en una zona bien ventilada o en una campana extractora. La ventana del horno debería bloquear toda la radiación UV, pero se recomienda usar gafas de protección. Los materiales combustibles y metales deben mantenerse fuera del área del plasma de oxígeno para evitar la combustión acelerada o la liberación de humos tóxicos. Consultar el documento SDS de plasma de oxígeno es esencial para su uso con cualquier material distinto de los mencionados en este protocolo.
      NOTA: Si no hay horno de plasma disponible, se puede lograr una unión similar con una varita de plasma o aplicando mortero PDMS en la segunda mitad y curando las mitades juntas a temperatura ambiente bajo ligera compresión durante 72 h13. Aunque son menos efectivos en comparación con un horno de plasma completo deO2 , estas opciones pueden usarse cuando no hay hornos disponibles.

Resultados

Prueba de integridad de sello de membrana
Para comprobar la integridad de la astilla sellada, la cámara superior de cultivo se llena con demi-agua con tinte azul, y la parte inferior con demi-agua pura. Las astillas se dejan toda la noche para evaluar la posible fuga de tinte azul desde la cámara superior alrededor de la membrana hacia la cámara inferior.

Las astillas de silicona completamente construidas preparadas con nuestro método pueden deformarse a lo largo hasta 35° sin alterar la integridad de la membrana, ahora recubiertas y unidas a la mitad superior con mortero flexible PDMS en ambos lados. La deformación de chips PDMS es una parte normal del uso, por ejemplo, cuando las mitades o chips se adhieren a una placa de Petri.

Los chips se conectaban a un sistema de bomba de jeringuilla bidireccional para probar su rendimiento con presión inducida por el flujo. Los chips con membranas PET y PC pueden funcionar sin fugas entre cámaras ni rotura de los chips hasta e incluyendo 30 kPa (la presión máxima proporcionada por las bombas). En estudios previos, los chips funcionan normalmente a 150 μL/h, lo que ejerce 0,7 Pa de presión sobre las cámaras de cadadispositivo 8.

Visualización de la unión de membranas
Para visualizar la intrusión del mortero líquido de PDMS en los poros de 0,4 μm de la membrana bajo el microscopio como resultado del sellado al vacío RT, el mortero PDMS se teñió con Rojo del Nilo. Se eligió Nile Red porque es un tinte hidrofóbico y se mezcla bien con el PDMS en su forma líquida. La tinción se preparó mezclando minuciosamente 1% de Rojo del Nilo en PDMS líquido para producir un color rojo bajo microscopía óptica. El procedimiento de curado por RT se repitió como se describió anteriormente. Las membranas con mortero teñido se incrustaron en parafina y se seccionaron usando un microtomo. Las láminas de membrana se montaron sobre láminas de vidrio y se fotografiaron con un microscopio óptico (Figura 4). Para validar la necesidad tanto de adelgazar el PDMS en mortero con tolueno como de aplicar un vacío para la intrusión del PDMS en los poros de membrana, se puede ver una comparación de membranas con y sin estos métodos en la Figura Suplementaria 3.

Prueba de Viabilidad Celular
En un estudio previo, se probó la posible toxicidad química derivada del uso de tolueno en la construcción de estos dispositivos. Los chips se prepararon con y sin tolueno en un mortero PDMS, las células epiteliales de Calu-3 de adenocarcinoma pulmonar humano se cultivaron hasta confluir en 2 días y se cultivaron durante 1 día en los chips como se describióanteriormente en 8. La muerte celular se evaluó mediante tinción azul con Trypan, eliminando todas las células del dispositivo y contando las células muertas (azules) contra las células viables no teñidas. La proliferación se evaluó incubando los reactivos en el medio del chip antes de realizar un ensayo AlamarBlue, leyendo la absorbancia fluorescente mediante un lector de placas, que refleja la proliferación (Figura 5)8.

Fijación de membrana basal ECM
Para demostrar la aplicabilidad general de este procedimiento en la producción de unión fuerte y flexible con una variedad de membranas, el protocolo se repitió con una membrana basada en matriz extracelular (ECM) (Figura 6). Se preparó membrana basal que contiene andamios ECM a partir de vejigas urinarias porcinas como se describió antesdel 17. Brevemente, se obtuvieron vejigas urinarias porcinas de animales hembras de entre 4 y 8 meses de edad en un matadero local (Kroon Vlees b.v., Groningen, Países Bajos) y procesadas en menos de 3 horas tras la recogida. Se extrajeron tejido conectivo y grasa de la vejiga, la vejiga se volteó del revés y se disecó la capa epitelial roma, manteniendo el tejido en PBS a temperatura ambiente. Los andamios de ECM fueron deshidratados para el procedimiento de fijación demembranas 17. Los andamios preparados se cortaban y unían a las mitades del chip PDMS tal y como se describe en el protocolo anterior. Se produjo un nuevo molde con cámaras adicionales para el estiramiento de la membrana dentro del dispositivo, para demostrar que los enlaces de silicona al vacío también pueden soportar tensión mecánica horizontal (Archivo Suplementario 2).

Prueba de integridad de membrana ECM
La prueba de integridad del sello de membrana se realizó como se mencionó anteriormente. A continuación, el chip de estiramiento se acoplaba a bombas de jeringuilla, que extraían un vacío en las cámaras laterales del dispositivo para producir 1 mm de estiramiento horizontal en la membrana ECM durante la noche (Figura 7).

Diferenciación de células epiteliales y co-cultivo de fibroblastos en la vía aérea estándar con membrana PET
Para validar el rendimiento del chip proporcionado como vía aérea en chip para células ALI, se cultivaron células epiteliales de Calu-3 de adenocarcinoma pulmonar humano (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) hasta confluir y se expusieron al aire en el dispositivo, en un estudioprevio 8. Tras 10 días de exposición al aire apical, se puede observar que las células epiteliales de Calu-3 se diferencian en células productoras de moco, demostrado por la producción de moco, medida por la tinción de azul Alciano (Figura 8)8.

Para validar nuestro procedimiento para flujo prolongado sin fugas y co-cultivo, se puede ver un ejemplo en una publicación anterior; Para la metodología completa de cultivo celular, véase este artículo8. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se cultivaron en la cámara de cultivo apical del chip bajo flujo de aire constante durante 21 días, cultivando fibroblastos primarios de las vías respiratorias boca abajo en el lado opuesto de la membrana. En resumen, las células epiteliales primarias de las vías respiratorias se aislaron mediante tratamiento con proteasa (0,2 mg/mL en HBSS, 2 horas, 37 °C), raspado celular y criopreservación de células extraídas del tejido traqueobronquial residual de 3 donantes pulmonares sanos, de quienes no se disponía de más información. Los fibroblastos de las vías respiratorias (FA) humanos se aislaron de la misma manera del tejido bronquial del tejido pulmonar de EPOC trasplantado de un solo donante.

En la Figura 9, se puede ver un gráfico del chip y cómo aparecen las celdas mencionadas tanto a través como a lo largo de las cámaras del dispositivo.

Cultivo de células epiteliales en co-cultivo con fibroblastos en la membrana de la ECM
El andamiaje que contiene la membrana basal facilita el cultivo celular epitelial y mesenquimal. Los queratinocitos humanos inmortalizados (células HaCaT) se sembraron a una densidad de 60 x 103 células/cm2 en el lado epitelial (interno) de la membrana, y la viabilidad fue del 95% tras 24 horas en comparación con el 91% en un matraz de cultivo celular de plástico (Figura 10A). A continuación, se sembraron fibroblastos MRC-5 normales del pulmón humano a una densidad de60 x 10 3 células/cm2 en el lado estromalico (externo) y se cultivaron en cocultivo con las células HaCat durante 14 días para evaluar la viabilidad epitelial-mesenquimatosa a largo plazo para el cocultivo en la membrana ECM nativa (Figura 10D). Las células epiteliales formaban una monocapa confluente en el lado interno de la membrana, mientras que los fibroblastos se distribuían menos densamente a lo largo de la superficie externa de la membrana ECM pero conservaban su morfología característica similar a un huso (Figura 10C). El vídeo de reconstrucción 3D puede verse en el Archivo Suplementario 417.

El estudio actual presentó un procedimiento mejorado de sellado de membrana que produce una conexión fuerte entre PDMS y membrana, capaz de resistir las interrupciones causadas por el manejo manual del chip y permitir un cultivo a largo plazo bajo flujo usando presiones de hasta 0,7 Pa. Demostramos que estas membranas están unidas por silicona que ha penetrado las membranas de cultivo a través de sus poros, facilitando enlaces covalentes de silano entre las dos mitades del chip y el mortero PDMS al vacío. Además, el procedimiento presentado no induce citotoxicidad, siempre que el mortero se aplique correctamente. Además, los chips producidos facilitaron coculturas epiteliales mono- y epitelial-mesenquimalesas a largo plazo. Aunque este procedimiento solo es aplicable a membranas porosas, sigue siendo un procedimiento de baja entrada para la producción de chips ALI fiables y listos para cultivo celular.

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Figura 1. Gráficos de la producción de la mitad del chip PDMS y preparación de membranas. Para la producción de la mitad del chip PDMS (paso 1.2), los moldes de astillas se rellenan con PDMS líquido con una jeringuilla de boquilla ancha, 4,4 mL en el molde superior y 2,4 mL en el molde inferior. Las mitades PDMS se curan durante 2 horas a 65 °C, tras lo cual se perforan 4 entradas en la parte superior de la parte superior de la recámara y se indican las puntas en el molde. Para la preparación de la membrana (paso 1.3), la plantilla impresa de membrana se mantiene firmemente sujeta a la superficie de la membrana. Con una hoja nueva, se corta alrededor de la plantilla y se elimina la membrana de la astilla del material circundante. Las membranas pueden recubrirse para cultivo celular o usarse directamente en el paso 2. Creado en BioRender. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2. Procedimiento de unión de membranas. El mortero PDMS se mezcla como se ha descrito anteriormente justo antes de su uso. El mortero se gotea en las cuatro esquinas alrededor de la cámara de cultivo y se extiende suavemente alrededor del punto de unión de la membrana con el extremo inclinado de una pipeta. Un extremo de la membrana se coloca sobre el mortero y, una vez alineado con la cámara de cultivo, se deja caer suavemente en su lugar. El mortero se reaplica por goteo y se pinta sobre los bordes de la membrana, con mucho cuidado para que ninguna silicona toque la superficie de la membrana dentro del área de cultivo. Las membranas unidas a la mitad del chip se colocan inmediatamente en una cámara de vacío para eliminar microburbujas, asegurar la invasión de silicona en la superficie y los poros, y eliminar el tolueno para minimizar el ataque químico a la membrana. Creado en BioRender. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3. Ejemplos de colocación de membranas. (A) Colocación exitosa de membrana, curado en RT. (B) Curado de unión de membrana en un horno (65 °C en lugar de RT), se puede observar que la membrana se ha distendido dentro de la cámara mientras la silicona se contraía tras el calentamiento. (C) Chips completos con la correcta colocación de membranas PET y PC. (D) Una colocación incorrecta de la membrana hará que el volumen de cada lado del chip cambie con el movimiento de la membrana, provocando un flujo variable y aplicando tensión tanto a las células dentro del chip como a las bombas conectadas al chip. Creado en BioRender. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4. Imágenes de microscopio óptico de membranas PET y PC cortadas y montadas. Mostrando la invasión de silicona en los poros de membrana como resultado de nuestro procedimiento de curado RT al vacío. (A) Se pueden ver imágenes de la misma membrana sin PDMS aplicado a la membrana, poros claros, así como una superficie limpia en la imagen polarizada. (B) El mortero PDMS ha sido teñido con Rojo del Nilo, y se puede ver que la silicona en magenta ha invadido con éxito los poros y recubierto finamente la superficie bajo vacío. Resaltado en formas blancas/magenta. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5. La viabilidad de las células en los dispositivos de chip no se vio alterada por la construcción con o sin tolueno como agente diluyente en el mortero PDMS. Las células de Calu-3 se sembraron a 6,5 × 104 células por chip y, al alcanzar la confluencia, se incubaron durante la noche antes de realizar un ensayo AlamarBlue sobre el sobrenadante y TrypanBlue en las células. Las diferencias entre grupos (n=4) preparados con y sin tolueno se evaluaron mediante el test t de Student no apareado, p > 0,05 = ns (no significativo)8. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 6. Chips de membrana en el sótano. (A) La integridad de la membrana ha fallado porque el mortero PDMS/tolueno no se aspiró lo suficientemente rápido; esto ha dañado las proteínas de la matriz y alterado el sellado de chips. (B) El sellado de membrana y astillas ha tenido éxito, pero la membrana ha sido sellada en estado flojo. (C) Sellado exitoso de membrana y astilla, el chip es funcional para el flujo y el estiramiento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 7. Dos imágenes del chip ECM estirado. (A) Astilla en reposo. (B) Astilla bajo un estiramiento horizontal de 1,2 mm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 8. Mancha de azul alciano (núcleos en magenta, mucosidad en azul) de células epiteliales Calu-3 pulmonares humanas crecidas en los chips tras la exposición al aire en el dispositivo. Las células de Calu-3 se cultivaron hasta la confluencia y se cultivaron durante 10 días bajo un caudal continuo de 150 μL/h en el compartimento basal y expuestas al medio o al aire desde el lado apical. El flujo se produjo con una bomba peristáltica dentro de una incubadora a 37 °C y un 5% deCO2. Al final del cultivo, se retiraron y teñieron las membranas. Vista transversal de la tinción de Alcian Blue de células de Calu-3 cultivadas durante 10 días sumergidas (A) y expuestas al aire (B)8. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 9. Visualización de células epiteliales humanas primarias y fibroblastos en cocultivo extendido dentro del dispositivo. Los fibroblastos de las vías respiratorias se siembraban en el dispositivo y se dejaban adherirse durante la noche antes de invertir el dispositivo y sembrar células epiteliales al otro lado de la membrana. Las células se cultivaron hasta la confluencia, se expusieron al aire y se cultivaron durante 21 días bajo un caudal continuo de 150 μL/h producido con una bomba peristáltica dentro de una incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Las membranas se retiraron tras el cultivo, se fijaron, se incrustaron y se montaron sobre portaobjetos antes de teñir. Se tinturaron células epiteliales para Mucin 5AC (MUC5AC)18, un componente del moco, y la proteína de la caja de la horquilla J1 (FOXJ1)19, un factor de transcripción implicado en la señalización para la producción de cilios. Los fibroblastos se tiñeron con aglutinina germinal de trigo (WGA) para visualizar las bicapas celulares de fosfolípidos. Las células fueron incubadas con 5 μg/mL en HBSS durante 15 minutos y lavadas tres veces con PBS antes de la imagen. Todos los núcleos celulares se visualizaron con DAPI. (A) Vista de sección transversal: producida a partir de una proyección en pila Z de imágenes de (B) y (C). (B) Tinción epitelial MUC5AC/FOXJ1/DAPI en una membrana de chip. (C) Estructura externa completa de la capa de fibroblastos en la cámarabasal 8. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-10
Figura 10. Viabilidad celular y cocultivo en el andamiaje de membrana basal. (A) viabilidad viva/muerta de las células HaCaT sembradas en el lado epitelial, se analizaron 3 muestras independientes y se capturaron 3 campos aleatorios de cada muestra (n = 3). Se realizó una prueba ANOVA unidireccional ordinaria con la corrección de Tukey. El gráfico muestra la media con la desviación estándar. Cocultivo de (B) células HaCaT en el lado epitelial y (C) fibroblastos pulmonares MRC-5 en el lado estromalo del andamiaje basal que contiene membrana, rodeados de fibras de colágeno, las barras de escamas de 50 μm. (D) Vista 3D de la cocultura desde las vistas isométricas superiores e inferiores, las barras de escala miden 100 μm, la visualización animada puede encontrarse en la Figura Suplementaria 4. (E) Grosor del andamiaje de la membrana basal antes y después de la descelularización, se midieron 14 mucosas, y de estas, se tomaron 6 (representadas por triángulos) para la descelularización. En cada una de las muestras, se escanearon tres campos aleatorios y al menos 10 puntos por campo se obtuvieron en la medida17. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1. Diseños de moldes de virutas para las mitades superior e inferior del chip estándar PET/PC. (A) Imagen del molde inferior del chip que puede producirse a partir de . STL en el Archivo Suplementario 1. (B) Imagen del molde superior del chip que puede producirse a partir de . STL en el Archivo Suplementario 2. (C) Imagen de la plantilla de membrana para cortar membranas para el chip que puede producirse a partir de . STL en el Archivo Suplementario 3. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2. Diseños de moldes de astillas para las mitades superior e inferior del chip de membrana ECM elástica. (A) Imagen del molde inferior del chip que puede producirse a partir de . STL en el Archivo Suplementario 4. (B) Imagen del molde superior del chip que puede producirse a partir de . STL en el Archivo Suplementario 5. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3. Validación del procedimiento de sellado: comparación de la intrusión de PDMS en poros sin tolueno para reducir la viscosidad del mortero y curado en RT sin vacío. Todas las condiciones son con membranas PET (poros de 0,4 μm); tras el tratamiento con PDMS (Nilo Red 1%), las membranas se incrustaron en parafina antes de su montaje y la imagen por microscopio óptico. (A) PDMS sin diluir aspirado sobre una membrana PET. Se puede observar una gruesa capa de PDMS en la superficie de la membrana, mientras que no se observa que haya entrado en los poros (resaltado con cajas blancas). (B) Mortero PDMS diluido aspirado sobre una membrana PET. Se puede observar una capa de PDMS en la superficie de la membrana, mientras que no se observa que haya entrado en los poros (resaltado con recuadros blancos). (C) Mortero PDMS diluido aspirado sobre una membrana PET. Se puede observar una fina capa de PDMS en la superficie de la membrana, así como la intrusión en los poros a lo largo de la membrana (resaltada con cajas blancas). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4. 3D visualización de co-cultivo de células HaCat (epiteliales) y MRC-5 (estromales) en el andamiaje de ECM porcina. Una vista animada 3D de la cocultura desde vistas isométricas superiores e inferiores, cuyas imágenes pueden verse en la Figura 10D, las barras de escala miden 100 μm. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1. 3D . Archivo STL del molde inferior. El molde puede utilizarse para producir la mitad inferior del chip estándar mediante impresión 3D o un método de fabricación equivalente. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2. 3D . Archivo STL del molde superior. El molde puede utilizarse para producir la mitad superior del chip estándar mediante impresión 3D o un método de fabricación equivalente. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3. 3D . Archivo STL de la plantilla de membrana. La plantilla puede usarse para producir membranas del tamaño correcto para el chip proporcionado y puede producirse mediante impresión 3D o un método de fabricación equivalente. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 4. 3D . Archivo STL del molde inferior de la astilla elástica. El molde puede usarse para producir la mitad inferior del chip de estiramiento mediante impresión 3D o un método de fabricación equivalente. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 5. 3D . Archivo STL del molde superior de la astilla elástica. El molde puede utilizarse para producir la mitad superior del chip elástico mediante impresión 3D o un método de fabricación equivalente. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo de sellado de chips que ofrecemos aquí representa una nueva forma de producir sellos de chip de membrana PDMS herméticos, viables para el cultivo a largo plazo bajo flujo, que pueden producirse con equipos limitados y que no requieren habilidades especializadas para abordarlos. Mostramos el procedimiento para producir obleas de chip con membranas (PET, PC, ECM) unidas a la superficie con mortero de silicona, y demostramos que la aplicación rápida del vacío facilita la intrusión del PDMS en los poros y a través de la superficie de las membranas plásticas. También demostramos que los chips resultantes están bien sellados y son capaces de realizar una amplia variedad de aplicaciones en cultura.

Existen varias formas diferentes de abordar el enlace PDMS-plástico, una estrategia común de unión debido a las propiedades beneficiosas para el cultivo celular de PDMS, como la permeabilidad o patronabilidad a los gases, y las membranas plásticas para su viabilidad en cultivocelular 7. Estos incluyen la activación superficial con plasma deO2 , corona o tratamiento con ozono, que facilita la formación de enlaces covalentes entre silicona ovidrio 20. De lo contrario, técnicas de pegado químico utilizando organosilanos como APTES ((3-Aminopropil)trietoxisilano) o MPTMS ((3-mercaptopropil)trimetoxisilano) permiten funcionalizar la superficie de ambos materiales añadiendo grupos reactivos21. Alternativamente, los PDMS y los sustratos plásticos pueden pegarse con un método adhesivo que involucra epoxi u otrosadhesivos 22. Presentamos un híbrido entre activación superficial y pegado químico, utilizando membranas porosas y vacío para producir una conexión física a través de la membrana que puede unirse únicamente mediante la activación superficial del plasmaO2 . Al adelgazar el PDMS con tolueno, permitimos la invasión del PDMS a través de los poros de una membrana bajo vacío, lo que permite que diferentes membranas se unan covalentemente mediante enlaces PDMS-PDMS a través de las mitades del chip y la membrana embebida en mortero. Al producir una red física de silicona a través de estos poros, evitamos la necesidad de tratamiento químico superficial o de calor y presión proporcionados por una máquina de relieve en caliente, lo que a menudo facilita estastécnicas 23.

En el estudio actual, se proporciona un chip de gran escala de dos cámaras (Archivo Suplementario 1) que puede tener una variedad de funciones. En segundo lugar, un chip capaz de estiramiento horizontal cíclico (Archivo Suplementario 2). Estos dispositivos funcionan como vía aérea en chip, mientras que el modelo también puede usarse como un gut-on-chip, como se mostróanteriormente en el 13. Principalmente, se proporciona una guía paso a paso con varias opciones diferentes para la producción de moldes, la preparación de membranas y la construcción de chips que podrían aplicarse a plataformas novedosas adicionales según la aplicación deseada por los investigadores. Se recomienda usar un horno de plasmaO2 para el sellado final. No obstante, también se ha demostrado que un dispositivo de plasma portátil o compresión manual con mortero PDMS es exitoso para este paso24. En este protocolo para este procedimiento de sellado, se han destacado los principales obstáculos y especificaciones en cada punto. Estos incluyen la opción de prerecubrir las membranas, la importancia del uso inmediato del mortero PDMS/tolueno, la importancia de que el mortero no entre en la zona de cultivo y la importancia de que la membrana no se mueva tras la conexión con el mortero.

La reproducción de este procedimiento de sellado ha sido realizada repetidamente por los investigadores con un protocolo escrito; Solo han sido necesarias las siguientes aclaraciones para el sellado exitoso en un segundo intento. Ante la aparición de fugas durante pruebas de estrés o cultivos celulares prolongados, se pueden explorar algunas opciones. Primero, el investigador debe asegurarse de que el mortero se elabora fresco a partir de líquido PDMS que aún no ha empezado a curarse y que está bien mezclado con tolueno. La baja viscosidad del mortero es lo que permite una capa fina y lisa que puede fluir hacia los poros de la membrana al aspirar el aire. En segundo lugar, se debe aplicar suficiente mortero para cubrir toda la parte inferior y superior de la membrana; aunque demasiado hará que fluya hacia la zona de cultivo bajo compresión, demasiado poco dejará huecos que permitan la fuga entre cámaras. En tercer lugar, las membranas deben ser planas antes y durante la fijación. Por último, a pesar del esfuerzo manual que implica, las astillas deben permanecer en gran medida libres de suciedad para garantizar una unión final total, por lo que es esencial trabajar rápido y limpio.

Aunque en este artículo mostramos la unión de tres tipos diferentes de membranas porosas, la función de este método para otras membranas no puede predecirse. Esto se debe a que diferentes resistencias químicas al tolueno, así como otras densidades y tamaños de poros, afectan el resultado de este procedimiento de sellado. Sin embargo, sí mostramos la primera unión de membrana totalmente basada en ECM, extensible, lo que sugiere una gran versatilidad del protocolo. Sin embargo, la consistencia del rendimiento de estiramiento no se ha comprobado de forma fiable, ya que diferentes regiones de membranas, órganos y fuentes basales producirán diferencias mecánicas. Además, la viabilidad para el cultivo celular de las membranas de la ECM también es propensa a cambiar con el tiempo, tanto en cultivo como en almacenamiento. Aunque este procedimiento funciona para diferentes membranas y configuraciones de viscituras, requiere que la pintura manual del mortero sea efectiva, lo que requiere relativamente poco tiempo pero tendrá más éxito con modelos a mayor escala como los que proporcionamos. Por último, mientras que el proceso de unión de membrana solo requiere PDMS, tolueno, una membrana y una cámara de vacío, el sellado final del chip depende de la aplicación de plasma deO2 , que no está disponible universalmente.

A pesar de las limitaciones, el protocolo proporcionado es novedoso y no requiere ninguna habilidad especializada para abordarlo. Hasta donde sabemos, la producción de redes de silicona a través de los poros de la membrana mediante el vacío del mortero PDMS de baja viscosidad es la primera de su tipo. A diferencia de otros puentes funcionales químicos o mecánicos entre los diferentes materiales que subyacen a un chip funcional, esta solución es posible en la mayoría de los entornos de laboratorio.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo del consorcio Precision Medicine for More Oxygen (P 4O 2), así como con financiación de Stichting Proefdiervrij. Mi más profundo agradecimiento a Isadora Kraguljac por la idea de usar tinte Nile Red, ya que se mezclaría con el PDMS para la visualización de las redes de silicona, y a Marjan Reinders-Luinge por su talentoso corte y montaje de las membranas. Los autores expresan su más profundo agradecimiento al departamento de Análisis Farmacéutico y a Sabeth Verpoorte por proporcionar acceso a su Horno de Plasma de Oxígeno; el proceso no habría sido posible sin él.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringuilla de 2 mL de nariz anchaBD Emereld307727
Punzón de biopsia de 2mmMedicina de KAIBP-20F
Línea celular Calu-3ATCCHTB-55RRID:  CVCL_0609
HBSS (Solución Balanceada de Sal de Hanks)Gibco14170112
O2 Horno de plasmaHarrick PlasmaPDC-002
Membranas de cultivo celular grabado con pista PCipCELLCULTURE1000M25/620N403/47
Membranas de cultivo celular grabado con pista PETipCELLCULTURE2000M23/610N403/47
Base y agente de curado de polidimetilsiloxano/Sylgard 184 Elastómero de siliconaDow CorningDOWC25100445
Polimetilmetacrilato (8mm)ColltecN/A
Resina fotopolimérica estándar (gris) (1kg)ElegooN/A
ToluenoMerck 1,08,325
Cámara de vacíoFisherScientific12080253

Referencias

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  2. Singer, M., Akhtar, A. With What Should We Replace Nonhuman Animals in Biomedical Research Protocols. AMA J Ethics. 26 (9), E701-E708 (2024).
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