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Artículo de método

Espectroscopía de Resonancia Magnética Fósforo-31 para mediciones seriadas de la energía cardíaca durante la preservación cardíaca controlada por temperatura

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DOI:

10.3791/70070

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17 de marzo de 2026

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1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Division of MR Research, Russell H. Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 4Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pediatric Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este artículo, hemos descrito un protocolo reproducible y con control de temperatura para la espectroscopía de resonancia magnética ex vivo con fósforo-31, que permite una evaluación en serie y cuantitativa de la energética miocárdica durante la preservación de órganos.

Resumen

La preservación fiable de los órganos es fundamental para aumentar la disponibilidad de donantes y mejorar los resultados de los trasplantes. Aunque el almacenamiento estático sigue siendo el estándar para los corazones donados, es necesario disponer de métodos precisos para monitorizar la energía miocárdica durante toda la preservación.

La espectroscopía de resonancia magnética de fósforo-31 (31P MRS) permite la medición directa y dinámica de metabolitos energéticos clave, incluyendo fosfocreatina (PCr), trifosfato de adenosina (ATP), fosfato inorgánico (Pi) y pH intracelular. Esta técnica permite una evaluación longitudinal, cuantitativa y precisa del estado metabólico miocárdico durante el almacenamiento ex vivo . Las ventajas de la MRS incluyen una evaluación dinámica del estado energético y una evaluación global de la energía ventricular.

El protocolo comienza con la recuperación de donantes de cerdo, administración de cardioplejía y cardiectomía. El arco aórtico se corta proximal al tronco braquiocefálico para maximizar la longitud de la aorta ascendente. Se fija una cánula con costelas en la aorta ascendente distal, se marca la aurícula izquierda y el corazón se coloca en un recipiente cilíndrico aislado, prellenado de cardioplejia específica para la temperatura. La tapa se conecta a la cánula, suspendiendo el corazón en su interior, y el recipiente se sella, manteniendo una temperatura dentro de 1 °C durante 1 hora.

El recipiente se coloca en una caja de poliestireno expandido a medida con una abertura para una bobina sintonizada con fósforo, alineando el centro de la bobina con el centro del ventrículo izquierdo (VE). Las imágenes de Scout confirman la colocación del LV cerca de la bobina 31P. El calzo B0 garantiza una excitación uniforme, seguida de la adquisición de un espectro MR no localizado de 31P. El post-procesamiento identifica picos espectrales para calcular PCr/ATP, relaciones PCr/Pi y pH intracelular.

En nuestro protocolo, la RMS 31P se realiza en momentos seriados entre h 0 y 8. Entre puntos temporales, el corazón se almacena en un dispositivo de almacenamiento estándar a la temperatura deseada.

31La P MRS nos ha permitido estudiar los cambios dependientes del tiempo en la disminución de energía y el papel de la temperatura de almacenamiento en la mitigación del agotamiento energético a lo largo del tiempo.

Introducción

El trasplante de corazón sigue siendo el tratamiento definitivo para pacientes seleccionados con insuficiencia cardíaca terminal1. Sin embargo, la persistente escasez de órganos de donación adecuados y las limitaciones de las estrategias actuales de preservación son grandes barreras para resultados óptimos y una mayor disponibilidad de trasplantes 2,3. Tradicionalmente, los corazones de donante se conservan mediante almacenamiento estático en frío, que es sencillo y rentable, pero es susceptible a un agotamiento energético subclínico durante un transporteprolongado 2,4. A medida que los programas aceptan cada vez más órganos de mayor riesgo y geográficamente distantes, existe una necesidad creciente de herramientas objetivas que caractericen la condición metabólica del miocardio durante la preservación, en lugar de depender únicamente del tiempo isquémico y la inspección macroscópica 5,6,7. Además, el metabolismo miocárdico y la tolerancia isquémica están fuertemente influenciados por la temperatura, y tanto un enfriamiento insuficiente como una hipotermia excesiva pueden agravar el agotamiento energético y la lesión celular durante el almacenamiento. Por tanto, evaluar corazones de donantes a múltiples temperaturas de conservación clínicamente relevantes ayuda a identificar las condiciones que mejor mantienen la viabilidad miocárdica a lolargo del tiempo 3.

Una evaluación precisa y dinámica de la bioenergética miocárdica durante el almacenamiento es esencial para mejorar las técnicas de preservación y maximizar la utilización de los órganos. Actualmente, la práctica estándar se basa en almacenamiento en frío estático a temperaturas en el rango aproximado de 4-8 °C 8. Aunque este protocolo ha mostrado resultados exitosos en periodos cortos de almacenamiento, el almacenamiento prolongado a esta temperatura puede poner en peligro la integridad miocárdica. Por ello, es esencial realizar mediciones seriadas de la actividad metabólica a lo largo de un rango de temperaturas y duraciones para delimitar las condiciones óptimas de almacenamiento necesarias para asegurar un trasplante de órganos exitoso. La evaluación convencional de la lesión de preservación suele basarse en un examen histológico o ensayos bioquímicos a partir de biopsias miocárdicas, que son invasivas, destructivas y solo proporcionan instantáneas regionales intermitentes del estadotisular 9. En cambio, la espectroscopía de resonancia magnética de fósforo-31 (31P MRS) es una modalidad potente y no destructiva que permite la medición directa y en serie de metabolitos energéticos clave, incluyendo fosfocreatina (PCr), trifosfato de adenosina (ATP), fosfato inorgánico (Pi) y pH intracelular, dentro del tejido cardíacointacto 6,10,11,12. Al permitir mediciones repetidas en el mismo órgano sin manipulación adicional del tejido, la RMS 31P proporciona información global y longitudinal sobre el estado energético miocárdico, mejorando la precisión experimental y la reproducibilidad en comparación con enfoques basados en biopsias o sustitutosséricos 6,13.

La evaluación de la viabilidad del injerto cardíaco con 31P MRS ha sido revisada por Bernard etal 14. Aquí se presenta un protocolo detallado y con control de temperatura para la MRS ex vivo 3 Tesla 31P del corazón de cerdo durante la preservación. Este método proporciona un marco práctico para monitorizar el agotamiento de sustratos, probar variables de almacenamiento y validar intervenciones de preservación. El protocolo es especialmente adecuado para laboratorios que buscan mediciones seriadas de ventrículos completos durante almacenamiento en frío estático, como estudios de preservación dependiente de la temperatura, lesiones por isquemia-reperfusión u optimización de soluciones para corazones de donante con criterios marginales y extendidos.

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Protocolo

Este protocolo sigue las directrices institucionales de cuidado animal y fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Animal de Johns Hopkins (Protocolo número SW24M319) para todos los procedimientos que involucren animales vivos, hasta e incluyendo la captura quirúrgica. Todos los experimentos ex vivo posteriores se realizaron utilizando tejidos obtenidos tras la eutanasia.

1. Procedimiento previo a la cosecha

  1. Ajusta la incubadora a una temperatura 2 °C por debajo de la temperatura objetivo de conservación. Deja que la incubadora se estabilice durante al menos 2 horas.
  2. Coloca 6-7 bolsas de hielo en la incubadora para preenfriarlas a la temperatura establecida. Asegúrate de que las bolsas de hielo sean suficientes para mantener la temperatura durante el transporte.
  3. Prepara una solución modificada para la cardioplejia de Santo Tomás:
    1. En 1 litro de la bolsa de solución de Lacto de Ringer, añade
      1. 30 mL de bicarbonato sódico al 8,4%
      2. 5 mL de 30 mmol/10 mL de cloruro de potasio
      3. 2,5 mL de 20 mmol/10 mL de sulfato de magnesio
      4. 15 mL de dextrosa al 50%
      5. 100 mg de nitroglicerina de 50 mg/10 mL
      6. 5000 U de eritropoyetina fría
    2. Prepara un total de 3 L de solución para la cardioplejia y almacena la solución en la incubadora preenfriada.
  4. Aparta el disipador aislante con un tubo de silicona incorporado que permita una posición óptima de la altura vertical del corazón. Coloca una marca negra de referencia en el tubo de silicona en el punto que está justo debajo de la punta de la abertura en la tapa del refrigerador.
  5. Aparta una cánula acanalada para asegurar y suspender el corazón cosechado. Coloca una marca de referencia negra en la superficie exterior de la cánula para servir como punto de alineación reproducible.

2. Procedimiento de cosecha

  1. Sedar al animal usando una combinación de telazol, ketamina y xilazina mezclados en una sola jeringuilla y administrada intramuscularmente, para minimizar el estrés y el dolor asociados a múltiples inyecciones.
    1. Telazol (50 mg de tiletamina + 50 mg de zolazepam) a 4,4 mg/kg para cada componente.
    2. Ketamina a 2,2 mg/kg.
    3. Xilazina a 2,2 mg/kg.
  2. Intuba y anestesia al animal.
    1. Volumen de marea en 5-10 mL/kg.
    2. Frecuencia respiratoria de 12-15 respiraciones al minuto.
    3. Presión positiva al final de la espiración a 5 cm h2o.
    4. Inhalé isoflurano al 0,5-2% con un flujo de oxígeno de 1-2 L/min.
  3. Colocar líneas intravenosas periféricas, realizar una esternotomía y abrir el pericardio15. Administrar antiarrítmicos si es necesario.
  4. Colocar una aguja de cardioplegia en la aorta ascendente, posicionándose por encima de la válvula aórtica pero por debajo del arco aórtico.
  5. Pica y conecta una bolsa de 1 L de solución para cardioplejía a la aguja.
  6. Ventila la aurícula izquierda, vena cava inferior y vena cava superior.
  7. Aplica una pinza transversal aórtica proximal al arco.
  8. Inicia el flujo de cardioplejía a través de las coronarias a una presión de aproximadamente 75-80 mmHg. Monitoriza la presión usando un manómetro en línea.
  9. Cosecha el corazón manteniendo la integridad anatómica.
  10. Vierte solución salina prefría sobre el corazón cosechado para enfriar rápidamente su superficie.
  11. Coloca el corazón en un cuenco lleno de solución fría para la cardioplegia.
  12. Introduce una sonda de temperatura miocárdica en el ápice del corazón y un termómetro en el cuenco con solución cardiopléjica para controlar la temperatura.
  13. Separa la aorta de la arteria pulmonar (PA).
  14. Asegura la cánula elástica en la aorta usando bridas de seda y bridas, asegurando que la parte marcada de la cánula corresponda a la posición del ventrículo izquierdo (VI).
  15. Llena la nevera con solución Saint Thomas hasta el 60-70% de su capacidad, luego transfiere el corazón y la solución del cuenco al recipiente para llenarlo totalmente, maximizando la inmersión.
  16. Mide y documenta la solución final y la temperatura del tejido.
  17. Sujeta la cánula acanalada a la tapa del refrigerador con tubos de silicona en la marca predefinida. Asegúrese de que las marcas en la cánula acanalada y el tubo de silicona estén alineadas, de modo que el VE mantenga una orientación consistente respecto a la tapa cuando el enfriador esté cerrado, asegurando una posición reproducible del VE en cada escaneo (Figura 1A).
  18. Desairear el órgano para asegurar una homogeneidad óptima del campo de RM y una buena relación señal-ruido durante la recogida de datos de RM.
  19. Asegura la tapa de la nevera para asegurarte de que la alineación de la ventanilla baja.
  20. Coloca bolsas de hielo y una nevera en una bolsa de transporte.

3. Protocolo de espectroscopía

  1. Este protocolo está optimizado para un escáner de RM 3T. El escáner de RM está equipado con una opción de espectroscopía multinúcleo, que incluye un amplificador y receptor de radiofrecuencia de banda ancha de 4 kW, incluyendo la bobina de fósforo estándar proporcionada por el proveedor (P140). La bobina 31P es una bobina de transmisión y recepción de un solo lazo de 14 cm de diámetro con dos varillas para afinación y emparejamiento.
  2. Avisa al personal de la instalación de resonancia magnética antes del traslado y confirma la disponibilidad de la exploración.
  3. Prepara una caja de poliestireno con las siguientes dimensiones externas: longitud 33,5 cm, anchura 28 cm (borde más largo), anchura 23 cm (borde más corto) y grosor 4 cm. Haz una ranura de 3,3 cm de ancho en un lado de la caja para permitir la colocación del espiral 31P junto al corazón (Figura 1B).
  4. Inserta el disipador con el corazón suspendido adyacente al eje central de la bobina, apuntando a la ubicación del VE (Figura 1C). Prepara una nevera de 25,4 cm de alto y 11,4 cm de ancho. El tubo de silicona se fija a una longitud de 7 cm desde la superficie interior de la tapa, en el punto de montaje del corazón (Figura 1D).
  5. Coloca bolsas de hielo en huecos alrededor del refrigerador, cuidando de no crear espacio entre el enfriador y la resistencia, luego cinta cinta la tapa de la caja para asegurar la estabilidad durante el escaneo (Figura 1E).
  6. Centra el enfriador en el isocentro del imán usando las guías láser y el punto de referencia, para asegurar una homogeneidad óptima de B0 (Figura 1F).
  7. Conecta la bobina de 31P al conector de escaneo y conecta varillas de afinación y de coincidencia a la bobina (Figura 1F).
  8. Adquirir imágenes de explorador localizador triplano para verificar la colocación de la bobina y la proximidad óptima de la LV a la bobina 31P (Figura 2).
  9. Si la posición del LV es incorrecta, gira la tapa del disipador y vuelve a hacer el escaneo explorador.
  10. Adquirir unmapa de campo estático B 0 para shimminglocalizado de segundo orden16 para asegurar un campo magnético uniforme en la región de interés requerida para una alta calidad espectral:
    1. Tras la adquisición del mapaB 0, un "Shimtool"16 se lanza automáticamente con ese mapa cargado (Figura 3).
    2. Puntos de clic de un polígono suavizado que delimita el músculo cardíaco en todas las cortes (Figura 3A).
    3. El "Shimtool" realiza entonces un ajuste de mínimos cuadrados restringidos para determinar la frecuencia de resonancia localizada y las correcciones de campo de la cuña de primer (x, y, z) y segundo orden (xy, xz, yz, x2-y 2, z2-(x2+y 2)/2) (Figura 3C). Sube estos términos de corrección al escáner y aplícalos a los siguientes escaneos.
  11. Antes de la adquisición MRS 31P, girar las varillas de sintonización de la bobina para asegurar una sintonización óptima de la bobina de radiofrecuencia y ajustar su impedancia al sistema MR, maximizando así la eficiencia de la transmisión de señales y minimizando las reflexiones en el sistema de radiofrecuencia (Figura 4).
  12. Adquirir un espectro inicial no localizado de 31P MR (tiempo de repetición [TR]: 10 s, ángulo de giro = 90° usando pulsos adiabáticos B 1-Rotación-4 Insensible (BIR-4); tiempo de eco [TE] = 0,1 ms; ancho de banda = 3000 hertz (Hz); 1024 puntos espectrales, 5 promedios) para determinar la frecuencia de resonancia en el centro entre los picos PCr y γ-ATP. Tiempo total de adquisición: 50 s.
  13. Luego se adquieren espectros MR 31P no localizados y totalmente relajados tras ajustar la frecuencia de desplazamiento según el cálculo en 3,12 (TR: 16 s, ángulo de giro = 90° usando pulsos adiabáticos BIR-4; TE = 0,1 ms; ancho de banda = 3000 Hz; 512 puntos espectrales, 20 promedios). Tiempo total de adquisición: 5 min 20 s.
  14. Después del escaneo, mide el líquido y las temperaturas miocárdicas; asegurando que la desviación del objetivo sea de ≤1 °C.
  15. Guarda el corazón en la incubadora a la temperatura deseada hasta la próxima exploración programada.

4. Análisis de datos

  1. Exporta los datos completamente relajados del MRS de 31P como . SDAT y carga en una interfaz gráfica para procesar (Figura 5A)17.
  2. Primero, apodizar los espectros usando un filtro lorentziano de 15 Hz (Figura 5B), luego aplicar un desplazamiento de fase de orden 0 y 1, y establecer la frecuencia a 0 partes por millón (ppm) en el centro del pico PCr (Figura 5C).
  3. Ajusta los espectros usando la funciónAMARES 18 usando los valores de conocimiento listados en la Tabla 1.
  4. Revise el análisis para un ajuste adecuado en la siguiente ventana (Figura 6), asegurándose de que cada pico esté correctamente identificado (componentes individuales) y que permanezca una señal residual mínima tras el análisis (residuo).
  5. Calcular las proporciones de metabolitos miocárdicos PCr/ATP y PCr/Pi basándose en la amplitud máxima espectroscópica (Figura 7). La resonancia γ-ATP se utiliza como medida del ATP.
  6. Calcular el pH intracelular basándose en el desplazamiento químico entre Pi y PCr tras ajustar, para reflejar la condición de temperatura14.
    NOTA: El protocolo puede pausarse tras cada resonancia magnética (paso 3.15). Asegúrate de mantener el control de temperatura en todo momento.

5. Ecuaciones

  1. Calcula el pH intracelular (pHi) como se ha descritoanteriormente 19:
    Ecuación 1
    Donde T es la temperatura en °C, y δ0 es la diferencia de desplazamiento químico observada entre las resonancias PCr y Pi, en ppm.

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Resultados

El shimminglocalizado de segundo orden16 resultó en un campo magnético B0 más homogéneo en la región de interés, como indica una reducción en la desviación estándar en cada punto temporal (0 h: 14,0 a 4,0 Hz; 4 h: 17,5 a 3,2 Hz; 8 h: 16,0 a 3,2 Hz). Esto aseguraba que se lograra una excelente calidad espectral en cada momento (Figura 7). Los cambios metabólicos miocárdicos durante el almacenamiento en frío ex vivo indican un rápido agota...

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Discusión

Este manuscrito describe una preparación quirúrgica y un protocolo de adquisición y análisis de MRS de 31P para la evaluación en serie de la energética miocárdica durante la preservación cardíaca. 31La P MRS permite una evaluación seria y no destructiva de metabolitos cardíacos clave a diferentes temperaturas de almacenamiento en frío, lo que proporciona nuevas perspectivas sobre la viabilidad metabólica del tejido miocárdico. Este protocolo de MRS 31P es...

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Divulgaciones

No tenemos ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Queremos reconocer a nuestro equipo en Johns Hopkins, en el departamento de cirugía cardíaca y radiología, por ayudar a llevar a cabo esta investigación con éxito. Este estudio fue financiado por la Asociación Americana de Cirugía Torácica (AATS).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IncubadoraBenchmark Scientific & nbsp;H2265-HCIncubadora de refrigeración por calefacción MyTemp 65HC
Refrigerador aislanteGatoradeUPC 052000047097Refrigerador deportivo aislado Gatorade
jMRUI versión 7.0Javawww.jmrui.euInterfaz gráfica de usuario para análisis de datos
Sonda de temperatura miocárdicaDeRoyal81-030415Sonda de temperatura miocárdica DeRoyal serie 400 (15 mm)
Escáner de Resonancia MagnéticaPhilipshttps://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingAchieva 3T, Philips Healthcare
Bobina de fósforo de lazo únicoPhilips Healthcare  https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingP140, Philips Healthcare

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