Desarrollo y validación de un método rápido LC-MS/MS para la cuantificación de carfilzomib en plasma de pacientes con mieloma múltiple

Summary

Este estudio tenía como objetivo desarrollar y validar un método rápido y sensible de cromatografía líquida-espectrometría de masas tándeme (LC-MS/MS) para la cuantificación del carfilzomib en plasma humano. El método totalmente validado apoya el seguimiento terapéutico de fármacos en pacientes con mieloma múltiple, permitiendo así una optimización personalizada de la dosis.

Abstract

El carfilzomib, un inhibidor de proteasoma de segunda generación, requiere monitorización terapéutica de fármacos (TDM). Este estudio tenía como objetivo desarrollar y validar un método sensible y robusto de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para la cuantificación del carfilzomib en plasma humano. Las muestras de plasma se procesaron mediante precipitación proteica con acetonitrilo (ACN). La separación cromatográfica se logró en una columna de C₁₈ (2,1 mm × 100 mm, 3,5 μm) mantenida a 40 °C, con una fase móvil compuesta por ACN y 10 mmol/L de acetato de amonio en agua (80:20, v/v) entregada a un caudal de 0,35 mL/min. El método demostró una excelente linealidad en un rango de concentraciones de 2,00-1000,00 ng/mL. Además, se observaron una alta precisión y exactitud intradía e interdía, con tasas de recuperación de carfilzomib que oscilaron entre el 84,1% y el 93,0%. Este método validado de LC-MS/MS permite determinar de forma precisa, eficiente y sensible las concentraciones de carfilzomib en el plasma de pacientes con mieloma múltiple, apoyando así la optimización de la terapia basada en carfilzomib.

Introduction

El mieloma múltiple (MM) es una malignidad hematológica caracterizada por la proliferación clonal de células plasmáticas en la médula^{ósea 1}. Representa la segunda malignidad hematológica más común a nivel^{mundial 2}, representando aproximadamente el 10% de todos los cánceres^{hematológicos 3}. A lo largo de los años, los avances en la terapia farmacológica, incluyendo la introducción de inhibidores de proteasomas, fármacos inmunomoduladores y anticuerpos monoclonales, han conducido a mejores resultados terapéuticos. Sin embargo, una proporción significativa (20%-30%) de los pacientes con MM continúa experimentando desafíos como supervivencia libre de progresión corta (PFS)^4,5 reacciones adversas (ADR), resistencia a los medicamentos y^{recaídas 6}.

^{Bortezomib, el inhibidor del proteassoma 7 de primera clase}, ha transformado el panorama terapéutico de la MM. A pesar de su eficacia, la mayoría de los pacientes acaban desarrollando enfermedad recaída o refractaria, frecuentemente acompañada de resistencia al bortezomib ^8,9 y tasas reducidas de respuesta al tratamiento y^{supervivencia 10,11}. Estos desafíos subrayan la urgente necesidad de enfoques terapéuticos innovadores para mejorar los resultados en la MM. El carfilzomib, un inhibidor de proteasoma de segunda generación aprobado por la FDA, proporciona un perfil farmacocinético más estable, permitiendo una supresión sostenida de la actividad similar a la quimotripsina y proporcionando potentes efectos antimieloma. Generalmente está indicado para pacientes con MM que han seguido al menos dos líneas de terapia previas, incluyendo el tratamiento con bortezomib y un fármaco^{inmunomodulador 1,11}. Las investigaciones han demostrado que el carfilzomib logra una inhibición del proteasoma más robusta en las células del mieloma que el bortezomib y posee la capacidad de superar la resistencia al bortezomib^12,13.

Los métodos más utilizados para cuantificar las concentraciones de fármacos en matrices biológicas incluyen la cromatografía líquida de alta eficiencia-detección ultravioleta (HPLC-UV), el ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas tándema (LC-MS/MS⁾¹⁴. Aunque HPLC-UV ofrece simplicidad operativa y bajo coste, su utilidad está limitada por una sensibilidad y selectividad relativamente bajas. En consecuencia, la cuantificación precisa de analitos objetivo, especialmente en bajas concentraciones o dentro de matrices biológicas complejas, sigue siendo un reto¹⁵. ELISA demuestra una alta sensibilidad. Sin embargo, su aplicación presenta varias limitaciones, incluyendo un proceso de desarrollo prolongado, dependencia de anticuerpos de alta calidad y susceptibilidad a la reactividad cruzada con compuestos estructuralmente similares en la muestra. Estos factores comprometen colectivamente la especificidad del^{ensayo 16}. En cambio, LC-MS/MS ofrece una selectividad excepcional, una sensibilidad superior y un rápido rendimiento analítico. Estas ventajas la sitúan como la metodología de referencia para el seguimiento terapéutico de fármacos (TDM) y las investigaciones^{farmacocinéticas 17}. El carfilzomib presenta características de una extensa unión a proteínas plasmáticas, pobre estabilidad in vivo y un índice terapéutico estrecho. La tecnología LC-MS/MS puede realizar un análisis cuantitativo rápido del compuesto objetivo, reducir eficazmente el efecto matricial y proporcionar una base científica para la administración clínica precisa de fármacos.

El nivel de exposición al fármaco carfilzomib está estrechamente relacionado con su efecto terapéutico y con^{ADRs 18,19}. El carfilzomib tiene una propiedad dependiente de^{la dosis 20}, y su nivel de exposición aumenta positivamente con la dosis en el cuerpo, lo que puede afectar directamente a su efecto terapéutico. Un estudio mostró que la tasa de respuesta total (RC) de carfilzomib en el tratamiento de la MM fue del 28%, la tasa de respuesta parcial muy buena (VGPR) fue del 73% y la tasa de respuesta global (ORR) fue del 93^%. Además, en comparación con el grupo control, la incidencia de cardiotoxicidad en pacientes tratados con carfilzomib aumentó significativamente, mientras que no hubo un cambio significativo en la neuropatía periférica. Otro estudio también mencionó la eficacia y seguridad del carfilzomib en el tratamiento del MM y confirmó que el carfilzomib puede aumentar el riesgo de cardiotoxicidad mientras mejora el efecto^{terapéutico 22}. Por lo tanto, la eficacia y las ADRs del carfilzomib están relacionadas con el nivel de exposición. Hasta la fecha, se han reportado pocos métodos validados de LC-MS/MS para la cuantificación de carfilzomib en plasma humano, especialmente aquellos que cumplen rigurosos criterios bioanalíticos de validación (por ejemplo, directrices de la FDA). Los estudios existentes se centran principalmente en modelos animales u otras matrices^{biológicas 23,24}, lo que pone de manifiesto una carencia en los ensayos clínicamente aplicables para TDM en pacientes con MM.

Por ello, es urgente establecer un ensayo rápido, preciso y sensible para monitorizar las concentraciones de carfilzomib en pacientes con MM, con el fin de optimizar su utilidad terapéutica y perfil de seguridad. En este trabajo, desarrollamos y validamos un método fiable de LC-MS/MS capaz de cuantificar el carfilzomib en plasma humano en un plazo de 3 minutos, demostrando una excelente sensibilidad y reproducibilidad. Desarrollado para TDM del carfilzomib en MM, este método permite optimizar la dosis y la evaluación de la exposición-respuesta. Los usuarios deben ser conscientes de la inestabilidad del fármaco en el plasma; La cuantificación precisa requiere el procesamiento de la muestra en un plazo de 4 horas tras la extracción de sangre.

Protocol

Este protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital de la Universidad Médica Naval (Hospital Changzheng de Shanghái). Todos los pacientes inscritos en el estudio firmaron el consentimiento informado.

1. Instrumentación LC-MS/MS

1. Utiliza un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) acoplado a un espectrómetro de masas triple cuadrupolo equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) para realizar el desarrollo del método y el análisis de muestras.
2. Configura el sistema UHPLC para incluir un degasser online, una bomba binaria, un autosampler y un horno columna.
3. Realizar la adquisición y procesamiento de datos utilizando el software de adquisición de datos del fabricante del instrumento.

2. Condiciones cromatográficas líquidas

1. Logra la separación cromatográfica usando una columna ZORBAX-SB_{C 18} (2,1 mm × 100 mm, 3,5 μm).
2. Mantén la temperatura de la columna a 40 °C.
3. Realizar elución isocrática con una fase móvil que comprende 20% de acetato de amonio 10 mmol/L en agua y 80% de ACN.
4. Ajusta el caudal a 0,35 mL/min.
5. Asegurar formas de pico simétricas y tiempos de retención adecuados tanto para el analito como para el estándar interno (IS) bajo estas condiciones.
   NOTA: El carfilzomib-d8 fue seleccionado como IS debido a su similitud estructural con el carfilzomib, lo que garantiza una recuperación de extracción, comportamiento cromatográfico y eficiencia de ionización comparables.
6. Pon la duración total en 3,0 minutos.

3. Condiciones de espectrometría de masas

1. Operar el espectrómetro de masas en modo ESI negativo.
2. Ajusta el voltaje capilar a -6000 V.
3. Emplea nitrógeno tanto como gas de nebulización como de secado.
4. Utiliza nitrógeno de alta pureza como gas de colisión a una presión de 0,2 MPa.
5. Mantén la presión del nebulizador en 20 psi.
6. Calienta el gas de secado a 400 °C y entregalo a un caudal de 10 L/min.
7. Ajusta la temperatura del gas de vaina a 350 °C, con un caudal de 12 L/min.
8. Adquirir datos en modo de monitorización de múltiples reacciones (MRM).
9. Adquiere espectros iónicos de producto del carfilzomib (Figura 1A) y del IS (Figura 1B) para ilustrar sus patrones de fragmentación.
10. Utiliza el modo de escaneo MS2 para identificar el ion padre.
11. Usa el modo SIM MS2 para optimizar el voltaje del fragmentador.
12. Utiliza el modo Producto Ion para determinar la Energía de Colisión (CE) óptima.
13. Detalla los parámetros optimizados de espectrometría de masas para carfilzomib y el IS (Tabla 1).

4. Muestras de calibración y control de calidad

1. Prepara una solución estándar de carfilzomib (1,0 mg/mL) pesando con precisión 2,0 mg de carfilzomib en un matraz volumétrico de 2 mL y disolviéndolo en 2 mL de metanol (MeOH).
   PRECAUCIÓN: MeOH es inflamable y tóxico. Al operar, debe hacerse en una campana extractora para evitar la inhalación de vapores o el contacto con la piel. Utiliza el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y protección ocular/facial.
2. Guarda la solución original a -80 °C.
3. Generar soluciones de trabajo mediante dilución serial de la solución original con un 10% de MeOH para alcanzar concentraciones de 100,0 μg/mL, 10,0 μg/mL y 1,0 μg/mL.
4. Establecer estándares de calibración aplicando plasma en blanco con las soluciones de trabajo.
5. Diluir el plasma con espiga con plasma en blanco en una proporción de 1:9 (v/v) para obtener concentraciones finales de 2,0, 5,0, 50,0, 200,0, 500,0, 750,0 y 1000,0 ng/mL.
6. Preparar de forma independiente muestras de control de calidad (QC) utilizando el mismo método a concentraciones de 5,0 ng/mL (baja), 200,0 ng/mL (media) y 750,0 ng/mL (altas).

5. Preparación de muestras

1. Pretrata las muestras de plasma (100 μL) añadiendo 20 μL de una solución de ácido fosfórico al 4%.
   PRECAUCIÓN: El ácido fosfórico es corrosivo. Lleva guantes, gafas de seguridad y bata de laboratorio para evitar el contacto visual y de piel. En caso de contacto, enjuaga inmediatamente con grandes cantidades de agua.
2. Mezcla de vórtices de la muestra durante 2 minutos a máxima velocidad usando un mezclador estándar de vórtices de laboratorio.
3. Añadir 200 μL de ACN, asegurando que contiene una solución IS a una concentración de 200,0 ng/mL, a la^{mezcla de 25}.
   PRECAUCIÓN: El ACN es inflamable, volátil y tóxico. Todas las operaciones deben realizarse en una campana extractora y mantenerse alejadas de fuentes de calor y llamas. Utiliza el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y protección ocular/facial.
4. Vuelve a hacer vórtice de la mezcla combinada.
5. Centrifuga la mezcla a 12.500 ×g durante 10 minutos a 4 °^{C 25}.
6. Recoge 100 μL del sobrenadante.
7. Combina el sobrenadante de 100 μL con 100 μL de agua.
8. Transfiere la solución resultante a un vial HPLC equipado con un inserto de vidrio.
9. Inyectar 10 μL de la solución final en el sistema LC-MS/MS para su análisis.

6. Evaluación de la especificidad

1. Evalúa la especificidad comparando las respuestas del carfilzomib y el IS en seis lotes diferentes de plasma en blanco, plasma con IS-spike, la muestra del límite inferior de cuantificación (LLOQ) y muestras de plasma auténticas.
2. Considera la interferencia aceptable si la respuesta es inferior al 15% del LLOQ del analito y menos del 5% de la respuesta IS.

7. Evaluación de linealidad

1. Evalúa la linealidad analizando tres conjuntos de estándares de calibración en días diferentes (al menos dos días).
2. Utiliza un modelo de regresión lineal ponderado de mínimos cuadrados para generar curvas de calibración basadas en al menos seis estándares de calibración.
3. Define el estándar de concentración más baja como el LLOQ.
4. Exigir que las concentraciones calculadas retroactivamente para cada estándar estén dentro de ± 15% de sus valores nominales, con una tolerancia de ± 20% para el LLOQ.

8. Precisión y determinación de exactitud

1. Determinar la precisión y exactitud intradía e interdía analizando cinco réplicas de muestras de control de calidad en tres niveles de concentración y la muestra LLOQ en al menos dos días diferentes.
2. Expresa la precisión como desviación estándar relativa (RSD%), requiriendo que sea ≤ 15% para muestras de QC y ≤ 20% para el LLOQ.
3. Expresa la precisión como el error relativo (RE%), requiriendo que esté dentro de ± 15% para muestras de QC y ± 20% para el LLOQ.

9. Recuperación y determinación del efecto matricial

1. Determinar la recuperación comparando el área máxima de carfilzomib disparada al plasma antes de la extracción con el área máxima de carfilzomib disparada en la matriz extraída a la misma concentración.
2. Evalúa el efecto matricial comparando el área máxima de carfilzomib en la matriz extraída con el área máxima de carfilzomib en una solución pura a la misma concentración.
3. Indicar un impacto consistente de la matriz de plasma en blanco sobre la señal del analito si el RSD% para el factor de efecto matricial es inferior al 15%.

10. Evaluación de traslado

1. Evalúa la transferencia inyectando una muestra en blanco inmediatamente después del estándar de calibración más alto para detectar cualquier señal residual del analito de la inyección anterior.
2. Considera aceptable la transferencia si la respuesta de carfilzomib en la muestra en blanco es inferior al 20% del LLOQ y menos del 5% de la respuesta IS.

11. Evaluación del efecto de dilución

1. Evalúa el efecto de dilución diluyendo muestras de plasma con picos con concentraciones superiores al límite superior de cuantificación (ULOQ) con plasma en blanco para situar la concentración dentro del rango de calibración.
2. Compara la concentración medida con la concentración nominal.

12. Evaluación de estabilidad

1. Evalúa la estabilidad analizando muestras de control de calidad en tres niveles de concentración bajo diferentes condiciones de almacenamiento.
2. Almacena muestras de control de calidad a temperatura ambiente y analízalas después de 6 horas.
3. Almacena las muestras procesadas en el automuestreador y analiza a 0, 2, 4 y 6 horas.
4. Someter muestras de control de calidad a tres ciclos de congelación-deshielo alternando el almacenamiento a −20 °C y temperatura ambiente, y luego analizar.
5. Almacena muestras de control de calidad a −80 °C durante dos meses y luego analiza.
6. Comparar concentraciones medidas con valores nominales y confirmar que las desviaciones están dentro del ±15% (RE%).

13. Inscripción de pacientes y recogida de muestras

1. Obtén el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.
2. Inscribe pacientes con MM y trátalos con carfilzomib.
3. Toma muestras de sangre inmediatamente después de administrar el medicamento (infusión intravenosa durante 30 minutos).
4. Obtener muestras de plasma centrifugando muestras de sangre recogidas en tubos EDTA-3K a 4500 ×g durante 10 minutos a 4 °C.

Results

Optimización LC-MS/MS

Para optimizar la detección de carfilzomib, se compararon los valores de respuesta del analito tanto en modos de ionización positivo como negativo. El modo de ionización negativa produjo una respuesta más alta para el carfilzomib que el modo de ionización positiva y, por tanto, fue seleccionado para análisis posteriores. Comparamos el rendimiento de las columnas C₈, C₁₈ y T3-C₁₈ para selec...

Discussion

A diferencia de los métodos tradicionales HPLC-UV y ELISA, LC-MS/MS proporciona una selectividad, sensibilidad y velocidad excepcionales, abordando eficazmente las limitaciones de sus predecesores. Estas ventajas consolidan su papel como la técnica de referencia para el análisis de fármacos en biomatrices complejas, especialmente para investigaciones TDM y^{farmacocinéticas 17}. Hemos desarrollado y validado un método LC-MS/MS para cuantificar el carfilzomib en plasm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrilo (ACN)	Compañía Merck (Darmstadt, Alemania)	34888	Grado LC-MS
Acetato de amonio	Compañía Merck (Darmstadt, Alemania)	9689	Pureza del análisis: ≥ 99.0%
Balance de análisis	Sartorius (Alemania))		Precisión: 0,01 mg
Columna analítica	Agilent Technologies (EE. UU.)		Agilent ZORBAX SB-C18, 2.1 y días; 100 mm, 3,5 y micro; m
Carfilzomib	Biotecnología yuanye de Shanghái (Shanghái, China)	868540-17-4	Analiza la muestra estándar, pureza > 99%
Carfilzomib-d8	Biotecnología yuanye de Shanghái (Shanghái, China)		Analiza la muestra estándar, pureza > 98%
Software para adquisición de datos	Agilent Technologies (EE. UU.)		Software de procesamiento de datos Agilent Masshunter (versión 6.0)
Software de análisis de datos	Agilent Technologies (EE. UU.)		Software de análisis cuantitativo Agilent MassHunter (versión 10.1)
Agua destilada	Shenzhen Watsons Distilled Water Co., Ltd (Shenzhen, China)	Grado LC-MS
Viales y HPLC Insertos	Shanghai Titan Technology Co., Ltd. ((Shanghái, China))		-
Sistema de cromatografía líquida	Agilent Technologies (EE. UU.)		La serie Agilent 1200 incluye bombas binarias, desegador online, muestreador automático y caja de temperatura de columna.
Metanol (MeOH)	Compañía Merck (Darmstadt, Alemania)	1.06035	Grado LC-MS
Micropipetas	Eppendorf (Alemania)		Múltiples rangos de medición (por ejemplo, 10 y micro; L, 100 y micro; L, 200 & micro; L, 1000 y micro; L)
Oficina y Software estadístico	-		Microsoft Office 365; GraphPad Prism 9.5
Ácido fosfórico	Compañía Merck (Darmstadt, Alemania)	49685	Pureza del análisis, 85% en peso
Centrífuga refrigerada	Eppendorf (Alemania)		Para muestras centrifugadas a 4° C
Espectrómetro de masas triple cuadrupolar	Agilent Technologies (EE. UU.)	G6475AA	Serie Agilent 1200, equipada con fuente de ionización por electrospray (ESI)
Mezclador de vórtice	Labnet  (EE. UU.)	S0200	Velocidad ajustable