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Artículo de investigación
Este estudio utilizó la secuenciación de 16S rRNA para comparar la microbiota intestinal entre controles sanos, pacientes con EP no tratados y pacientes tratados con piribedil, e identificó diferencias en la composición microbiana asociadas al tratamiento con piribedil.
Este estudio tuvo como objetivo determinar si la terapia con piribedil altera la microbiota intestinal de pacientes con enfermedad de Parkinson (EP), proporcionando una referencia teórica para comprender las alteraciones de la microbiota intestinal inducidas por el piribedil y sus posibles implicaciones clínicas. Las muestras fecales se analizaron mediante secuenciación génica del ARN ribosómico 16S (16S rRNA). Se realizaron comparaciones entre pacientes con EP que tomaron piribedil (grupo piribedil), pacientes con EP que no tomaron piribedil (grupo con EP) y controles sanos (grupo en blanco). En comparación con el grupo en blanco, la abundancia relativa de Staphylococcus, Rhodococcus y otros géneros fue mayor en el grupo PD, mientras que la abundancia relativa de Achromobacter y Delftia fue menor. Además, la abundancia relativa de Achromobacter, Delftia y Stenotrophomonas fue mayor en el grupo piribedil en comparación con el grupo PD, mientras que la abundancia relativa de Staphylococcus, Rhodococcus y otras especies fue menor. En comparación con individuos sanos, la microbiota intestinal de los pacientes con EP mostró cambios significativos. La microbiota intestinal de los pacientes que toman piribedil difiere significativamente de la de los pacientes no tratados. Estos resultados sugieren una asociación entre piribedil y alteración de la microbiota intestinal en pacientes con EP.
La incidencia de la enfermedad de Parkinson (EP) está aumentando gradualmente; sin embargo, su etiología y patogénesis aún no se han aclarado completamente. Más estudios han indicado que la microbiota intestinal está estrechamente relacionada con el inicio y desarrollo de la EP. He et al.1documentaron que la composición de la microbiota intestinal en pacientes con EP varía de la de las personas sanas, y que un aumento de patógenos intestinales podría estar asociado con el inicio de la EP. Scheperans et al.2confirmaron que la abundancia relativa de Prevotella y Bacteroides en el intestino de pacientes con EP se reduce. y que estos géneros bacterianos están fuertemente asociados con la función de la barrera intestinal.
Varios estudios han investigado la relación entre la microbiota intestinal y la EP. Las investigaciones sugieren que la disbiosis puede desempeñar un papel crucial en la fisiopatología de la EP, influyendo en los síntomas motores y no motores a través de múltiples mecanismos, incluyendo la inflamación y los trastornosmetabólicos 3. Además, se ha demostrado que los tratamientos farmacológicos para la EP alteran la composición del microbiomaintestinal 4,5, subrayando la compleja interacción entre los fármacos y el microbioma intestinal.
Como agonista no selectivo de los receptores de dopamina, el piribedil es fundamental en el manejo de la EP; Puede mejorar los síntomas motores en los pacientes estimulando los receptores dedopamina 6. Sin embargo, su uso clínico suele estar limitado por reacciones adversas, principalmente síntomas gastrointestinales como náuseas, vómitos y molestiasabdominales. El mecanismo subyacente de estos efectos secundarios sigue sin estar claro, y si están relacionados con cambios en la microbiota intestinal inducidos por el piribedil aún se desconoce.
La relación entre la microbiota intestinal y las reacciones adversas a los medicamentos ha despertado un interés creciente en los últimos años. Hill-Burns et al.8analizaron la microbiota intestinal en pacientes con EP y encontraron que la diversidad microbiota intestinal estaba asociada con la respuesta a la terapia farmacológica. Además, los agonistas de la dopamina pueden afectar la motilidad intestinal y la composiciónmicrobiana 9. Se cree que los mecanismos detrás de estos cambios implican alteraciones en el tiempo del transporte intestinal, que a su vez afectan a la diversidad y abundancia microbiana. Además, la microbiota intestinal puede influir en la absorción y el metabolismo del fármaco, afectando así la eficacia y los efectos secundarios de estos fármacos. Sin embargo, todavía falta investigación sistemática sobre si el piribedil, un agente comúnmente utilizado para la enfermedad de Parkinson, modula la estructura de la microbiota intestinal, así como sobre la asociación entre estos desplazamientos microbianos y sus reacciones adversas gastrointestinales.
En el presente estudio, comparamos la estructura de la microbiota intestinal entre controles sanos, pacientes con EP no tratados y pacientes tratados con piribedil. Planteamos la hipótesis de que el tratamiento con piribedil está asociado con alteraciones distintivas en la composición de la microbiota intestinal en pacientes con EP y que estos cambios microbianos podrían estar relacionados con efectos secundarios gastrointestinales asociados al piribedil. Nuestro objetivo era identificar alteraciones microbianas específicas asociadas al piribedil y explorar su posible asociación con efectos secundarios gastrointestinales, proporcionando así una base teórica para comprender el mecanismo de las reacciones adversas relacionadas con el piribedil.
La microbiota intestinal es una dirección importante para la investigación sobre la patogénesis de la PD11. Al observar los efectos del piribedil sobre la microbiota intestinal en pacientes con EP, este estudio ayuda a clarificar la importancia clínica de los cambios en la microbiota intestinal relacionados con fármacos y proporciona una referencia para optimizar el uso clínico y la gestión de la seguridad del piribedil.
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Este estudio fue revisado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Anhui (Número de revisión ética: 2025AH-101, fecha de aprobación ética: 2025-07-02).
Sujetos de investigación
Se inscribiron pacientes con EP y controles sanos en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Anhui. Se recogieron muestras heces frescas para su análisis de seguimiento. Se recogían muestras fecales frescas, se alocaban en tubos EP estériles, se congelaban inmediatamente en nitrógeno líquido y luego se almacenaban a −80 °C para su conservación a largo plazo. Los criterios de inclusión de los pacientes con EP fueron los siguientes: (1) diagnóstico clínico de EP; (2) edad >70 años; (3) para el grupo de Piribedil: inició la monoterapia con piribedil tras la inscripción y no tuvo exposición previa a este fármaco; para el grupo de Parkinson: no recibir tratamiento con fármacos anti-Parkinson; (4) no hay otras enfermedades sistémicas graves, como enfermedades cardíacas graves, hepáticas, renales o cáncer. Antes de la inscripción, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: (1) complicaciones graves de la EP, como disfunción motora severa; (2) recibió recientemente tratamiento antibiótico; (3) presencia de otras condiciones de salud que puedan afectar los resultados del estudio, como enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome de intestino irritable, etc.; (4) alérgica al piribedil. Los sujetos controladores sanos (grupo Blank) eran individuos con edades iguales (edad >70 años) sin antecedentes de enfermedades neurológicas ni gastrointestinales mayores.
Todos los participantes debían mantener sus hábitos alimenticios habituales antes de inscribirse. Ninguno había recibido probióticos, prebióticos, suplementos de fibra dietética u otros suplementos nutricionales. Además, todos los participantes no habían recibido ningún tratamiento antibiótico durante al menos tres meses antes de la recogida de la muestra. No se realizó ninguna intervención dietética estandarizada durante el estudio, pero se instruyó a todos los participantes para mantener un estilo de vida y una dieta estables para minimizar posibles efectos de confusión sobre la microbiota intestinal.
Agrupación de investigación
Esta cohorte de estudio se dividió en tres grupos: grupo de Parkinson (n = 10): muestras fecales recogidas de pacientes con enfermedad de Parkinson que no estaban tomando medicación anti-Parkinson. Grupo Piribedil (n=10): muestras fecales recogidas de pacientes con enfermedad de Parkinson tras 21 días consecutivos de tratamiento con piribedil (50 mg, dos veces al día). Grupo de control en blanco (n=5): muestras fecales recogidas de individuos sanos.
Secuenciación de ARN ribosómico 16S
La secuenciación se realizó sobre una plataforma de secuenciación, como se ha informado en otrosestudios 12,13. En resumen, se aisló ADN microbiano total de muestras fecales utilizando el método 14,15,16 de dodecilo sulfato de sodio (SDS). La integridad del ADN extraído se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, y la concentración y pureza del ADN se determinaron con un espectrofotómetro. La región hipervariable V3-V4 del gen bacteriano 16S rRNA fue amplificada a partir del ADN genómico usando cebadores degenerados 341F (5'-CCTAYGGGRBGGCASCAG-3') y 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') con termociclador de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La amplificación del gen bacteriano 16S rRNA se realizó bajo las siguientes condiciones térmicas: un paso inicial de predesnaturalización a 94 °C durante 2 minutos, seguido de 28 ciclos que consisten en desnaturalización a 94 °C durante 30 s, recocido a 55 °C durante 30 s y elongación a 72 °C durante 30 s. Se realizó una extensión final a 72 °C durante 10 minutos, y la reacción se mantuvo a 4 °C. Las mezclas PCR contienen 2× mezcla maestra PCR de 25 μL, cebador directo (10 μM) 2 μL, cebador inverso (10 μM) 2 μL, ADN plantilla 10 ng y, finalmente, ddH2O hasta 50 μL. Las reacciones PCR se realizaron en triplicado. Las mezclas PCR contienen 2× mezcla maestra PCR de 25 μL, cebador directo (10 μM) 2 μL, cebador inverso (10 μM) 2 μL, ADN plantilla 10 ng y, finalmente,ddH 2O hasta 50 μL. Las reacciones PCR se realizaron en triplicado. El producto de PCR se extrajo de gel de agarosa al 2% y se purificó usando un kit de extracción en gel. El kit de preparación de la biblioteca Universal Plus DNA para MGI V2 se utilizó para construir la biblioteca: (1) Enlace Splinter; (2) Utilizar apantallamiento magnético de perlas para eliminar los segmentos autocontiguos de la articulación; (3) Enriquecimiento de plantillas de biblioteca mediante amplificación por PCR; (4) Esferas magnéticas para recuperar productos de PCR; (5) Ciclización de productos PCR. Tras la validación de la biblioteca, se realizó la secuenciación.
Puntos de control de calidad: Punto de control 1 (Recogida de muestras): Las muestras se congelaron inmediatamente después de la recogida y se almacenaron a −80°C. Cualquier muestra con signos visibles de deshielo o contaminación fue descartada. Punto de control 2 (extracción de ADN): pureza aceptable: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 ≥1,8; Integridad verificada mediante una única banda de alto peso molecular en gel de agarosa al 1%. Punto de control 3 (amplificación por PCR): Una sola banda a ~460 bp en gel de agarosa al 2% indica amplificación exitosa (cebadores 341F/806R, región V3-V4); si están ausentes o no son específicas, ajusta la temperatura de recocido o la concentración de plantilla. Se requería concentración de recuperación ≥0,5 ng/μl para la preparación de la biblioteca. Punto de control 4 (Preparación y secuenciación de bibliotecas): Realizado por la instalación de secuenciación siguiendo sus protocolos estándar validados; no se aplicó ningún punto de control interno adicional (por ejemplo, el tamaño del bioanalizador).
Seguridad y eliminación de residuos: Se usaban guantes y batas de laboratorio durante toda la manipulación de muestras. Las superficies de trabajo se limpiaron con un 70% de etanol. Todos los consumibles contaminados (puntas, tubos, geles) fueron autoclavados (121°C, 20 min) antes de su eliminación como residuos biopeligrosos.
Bioinformática
Las lecturas de secuenciación en bruto del gen 16S rRNA fueron primero demultiplexadas, sometidas a filtrado de calidad usando fastp (versión 0.20.0) y ensambladas mediante FLASH (versión 1.2.11) bajo criterios de cribado estandarizados. En resumen: (i) Las secuencias brutas de 300 pbs se recortaron cuando la puntuación media de calidad bajó de 20 dentro de una ventana deslizante de 50 pb. Se eliminaron las lecturas con longitudes truncadas inferiores a 50 pb o que contenían bases ambiguas; (ii) El ensamblaje de secuencias se realizó solo para solapamientos superiores a 10 pb, con la razón máxima de desajuste de la región superpuesta fijada en 0,2. Se eliminaron las lecturas no emparejadas que no se ensamblaron; (iii) Las muestras individuales se particionaron en función de secuencias de códigos de barras y cebadores para el posterior ajuste de orientación. El emparejamiento de códigos de barras se realizó con alineación exacta, mientras que el emparejamiento de cebadores permitió un máximo de 2 desajustes de nucleótidos. Las lecturas de 16S rRNA se analizaron utilizando la cadena Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) (versión 1.8.0)17. Las secuencias de etiquetas se añadieron a las lecturas de extremos emparejados usando FLASH (versión 1.2.11)18. El recorte se realizó usando UPARSE (versión 7.0.1090) con una longitud mínima de 200 pb y una calidad media de 25, seguido de agrupamiento con un corte del 97% para generar unidades taxonómicas operativas (OTUs)19. Las lecturas OTU representativas se clasificaron taxonómicamente mediante el clasificador RDP 2.2, con un límite de confianza ≥0,6. Las abundancias de etiquetas y lecturas se determinaron mediante comparación usando USEARCH global20. La identificación de secuencias quiméricas se basó en comparaciones con la base de datos Gold utilizando UCHIME (v4.2.40)21. Posteriormente se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) sobre el conjunto de datos disperso basado en la disimilitud de Bray–Curtis, con un umbral de similitud de secuencia fijado en el 97% para agrupamiento. Las OTUs representativas y los perfiles taxonómicos correspondientes se analizaron más a fondo utilizando el software R (versión 3.1.1). El algoritmo de tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe), basado en el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LDA), se aplicó para cribar biomarcadores con abundancia diferencial significativa a nivel de OTU. Este método enfatiza tanto la significación estadística como la relevancia biológica, identificando primero características con diferencias consistentes entre grupos (utilizando la prueba de Kruskal-Wallis para comparación multigrupo) y luego estimando el tamaño del efecto de cada característica diferencial abundante usando LDA. Una puntuación LDA >2,0 se define como un aumento significativo deabundancia 22.
Métodos estadísticos
Se realizaron análisis estadísticos utilizando SPSS. Los datos normalmente distribuidos se analizaron mediante el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). Los datos que no siguieron la distribución normal se analizaron utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Todos los datos cuantitativos se expresaron como medio ± error estándar (SE) para parámetros que cumplen con una distribución normal, mientras que los datos no distribuidos normalmente se presentaron como mediana con rango intercuartíl. Se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05.
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Diferencias en diversidad microbiana asociadas al tratamiento con piribedil
Los resultados del control de calidad de la extracción de ADN (rango de concentración, pureza) se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1. El control de calidad de la amplificación por PCR (tamaño de la banda, concentraciones de recuperación) se muestra en la Tabla Suplementaria 2. Las métricas de control de calidad de secuenciación (recuentos de lect...
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La enfermedad de Parkinson ocupa el segundo trastorno neurodegenerativo más común a nivel mundial, solo precedida por la enfermedadde Alzheimer 23. Desde 1970, el piribedil, como agonista de los receptores de dopamina, se ha utilizado ampliamente en el tratamiento de la PD24. Sin embargo, en la práctica clínica, el piribedil puede causar algunas reacciones adversas, como náuseas, vómitos y molestias gastrointestinales. La creciente investig...
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Los autores afirman que no existen intereses en competencia.
Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de Financiación de Candidatos a Reservas de Líderes Académicos de la Provincia de Anhui (Nº 2022H287), el Proyecto de Talentos Sobresalientes de Higiene y Salud de la Provincia de Anhui (Nº ahsjhmypygc20230074), el Proyecto de Investigación Científica Provincial de Anhui sobre Herencia e Innovación de la Medicina Tradicional China (2025CCCX017) y el Proyecto Especial para la Integración Básica-Clínica de la Universidad de Medicina China de Anhui (JCLCA2025009).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | Kangweii | CW0690 | |
| Agarose | (general) | no aplicable | grado de biología molecular |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (no proporcionado) | |
| Centrífuga de congelación de alta velocidad de sobremesa | Hunan Kosei | GTR116C | |
| Reactivos de extracción de ADN (SDS, fenol, cloroformo, etanol) | (general) | no aplicable | |
| Plataforma de secuenciación DNBSEQ-G99 PE300 | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| Aparato de electroforesis en gel | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Sistema de imagen de gel | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| Software LEfSe | (código abierto) | versión en línea | |
| Espectrofotómetro NanoDrop | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| Máquina PCR | Hangzhou Langji | A200 | |
| Piribedil | Servier | 6094078 | |
| Primers: 341F y 806R (sintetizados) | (síntesis personalizada) | no aplicable | |
| Software QIIME | (código abierto) | http://qiime.org | versión 1.8.0 |
| Fluorómetro Quantus | Promega | E6150 | |
| Fluorómetro Qubit 4.0 | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS (dodecilsulfato de sodio) | (general) | no aplicable | |
| Software UPARSE | (código abierto) | http://drive5.com/uparse | versión 7.0.1090 |
| Kit de preparación de bibliotecas de ADN VAHTS Universal Plus para MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |