Este protocolo describe un flujo de trabajo reproducible de aleatorización mendeliana de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre accidente cerebrovascular isquémico y demencia vascular utilizando estadísticas resumidas de estudios de asociación del genoma completo disponibles públicamente.
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Relación causal entre el accidente cerebrovascular isquémico y la demencia vascular: un estudio de aleatorización mendeliana
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11 de septiembre de 2026
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Resumen
Resumen
El accidente cerebrovascular isquémico (ACI) es una causa importante de discapacidad y mortalidad a nivel mundial, y la demencia vascular (DVa) es un subtipo común de demencia asociado a lesión cerebrovascular. Estudios observacionales han sugerido una relación entre el ACI y la DVa, pero estos estudios son vulnerables a factores de confusión y causalidad inversa. Este protocolo describe un flujo de trabajo reproducible de aleatorización mendeliana (AM) de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre el ACI y la DVa, utilizando estadísticas resumidas de estudios de asociación del genoma completo (GWAS) disponibles públicamente. Los instrumentos genéticos asociados con el ACI se extrajeron de un conjunto de datos GWAS público, y las asociaciones del resultado para la DVa se obtuvieron de un conjunto de datos GWAS público sobre DVa. Los identificadores correspondientes de los conjuntos de datos se proporcionan en la sección de Protocolo. Tras la coincidencia de resultados y la armonización de alelos, se conservaron 51 polimorfismos de nucleótido único (SNPs) para el análisis final de AM. El flujo de trabajo incluye selección de variables instrumentales, agrupamiento por desequilibrio de ligamiento, armonización de alelos, evaluación de la fuerza del instrumento, análisis ponderado por varianza inversa (IVW), análisis de mediana ponderada, análisis MR-Egger, prueba de heterogeneidad, evaluación de pleiotropía horizontal y análisis de sensibilidad de tipo leave-one-out. En el análisis representativo, el método IVW mostró una asociación positiva entre el ACI predicho genéticamente y el riesgo de DVa, y el método de mediana ponderada arrojó un resultado con dirección concordante. La estimación de MR-Egger fue direccionalmente consistente, pero no alcanzó significación estadística. Por lo tanto, estos hallazgos deben interpretarse como evidencia sugestiva de un posible efecto causal, más que como prueba definitiva de causalidad. Este protocolo puede ayudar a los investigadores a aplicar un flujo de trabajo de AM transparente y reproducible para investigar resultados relacionados con enfermedades cerebrovasculares utilizando datos GWAS públicos.
Introducción
El accidente cerebrovascular isquémico (ACV) es una de las principales causas de discapacidad grave y muerte en todo el mundo1. Según los datos más recientes del Estudio de la Carga Global de Enfermedades, la incidencia mundial de ACV ha disminuido, pero sigue siendo una carga significativa, especialmente en Europa del Este, Asia Oriental, Asia Central y África subsahariana2,3. Además, la incidencia de ACV está en aumento en países con un índice sociodemográfico (SDI) bajo, y se proyecta que continúe aumentando desde 2020 hasta 2030.
Numerosos estudios epidemiológicos han sugerido una posible asociación entre las enfermedades cerebrovasculares y la demencia vascular (DVC)4,5. Especialmente en China, la DVC es uno de los tipos más comunes de demencia entre las personas mayores, y la alta prevalencia del ACV está estrechamente relacionada con el inicio de la DVC. Sin embargo, la mayoría de los estudios existentes son observacionales, y los factores de confusión residuales, la causalidad inversa y las diferencias en la definición de la enfermedad pueden limitar la interpretación causal. Por lo tanto, se necesitan enfoques analíticos adicionales para evaluar si el ACV podría estar involucrado en el desarrollo de la DVC.
El ACV puede influir en el inicio de la Demencia Vascular a través de varios mecanismos. El daño cerebrovascular causado por el ACV puede provocar una perfusión cerebral insuficiente y cambios neurodegenerativos posteriores6. Además, la Demencia Vascular puede estar relacionada con lesiones cerebrovasculares crónicas, daño microvascular y respuestas inflamatorias tras un ACV7,8. Por lo tanto, investigar la relación entre el ACV y la Demencia Vascular es importante para comprender posibles vínculos entre enfermedades y orientar estrategias futuras de prevención.
La aleatorización mendeliana (MR) es un método analítico que utiliza variantes genéticas como variables instrumentales para evaluar posibles asociaciones causales entre una exposición y un resultado9. En comparación con estudios observacionales convencionales, la MR puede reducir los sesgos por confusión y causalidad inversa bajo supuestos válidos de variables instrumentales. En comparación con ensayos controlados aleatorizados o modelos experimentales, la MR puede utilizar estadísticas resumidas de estudios de asociación del genoma completo (GWAS) ya existentes para evaluar asociaciones clínicamente relevantes cuando los estudios de intervención directa son inviables, poco éticos o difíciles de realizar. Estudios genéticos recientes que emplean enfoques de aleatorización mendeliana han investigado la asociación entre ACV y DEM10. Sin embargo, descripciones detalladas a nivel de protocolo sobre la selección de instrumentos de exposición, extracción de datos del resultado, armonización de alelos, evaluación de la fuerza del instrumento, pruebas de heterogeneidad, evaluación de pleiotropía y análisis de sensibilidad siguen siendo fundamentales para una implementación reproducible.
Este protocolo es apropiado cuando existen estadísticas resumidas de GWAS públicamente disponibles tanto para la exposición como para el resultado de interés, se pueden seleccionar instrumentos genéticos válidos para la exposición, y la pregunta de investigación tiene como objetivo evaluar una posible asociación causal en lugar de establecer directamente mecanismos biológicos. Este estudio presenta por tanto un protocolo de MR de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre IS y VaD utilizando estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente. El objetivo es proporcionar un flujo de trabajo analítico reproducible, en lugar de establecer mecanismos biológicos definitivos. Este protocolo describe la selección de instrumentos genéticos, la coincidencia de resultados, la armonización de alelos, la estimación de MR y los análisis de sensibilidad, y utiliza la asociación entre IS y VaD como ejemplo representativo.
Protocolo
Este estudio utilizó estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente. Los estudios originales habían obtenido la aprobación del comité de ética y el consentimiento informado de los participantes. No se requirió ninguna aprobación ética adicional para este análisis secundario.
1. Diseño del estudio y declaración de ética
- Utilice un diseño de RM de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre el ACV y la DEM.
- Utilice únicamente estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente. Dado que todos los estudios originales incluidos en los conjuntos de datos de GWAS obtuvieron la aprobación del comité de revisión institucional y el consentimiento informado de los participantes, no se requiere ninguna aprobación ética adicional para este análisis secundario.
- Defina el ACV como la exposición y la DEM como el resultado antes de la extracción de datos.
2. Preparación del software
- Realice todos los análisis utilizando el software estadístico R.
- Cargue el paquete TwoSampleMR para la extracción de instrumentos, extracción de datos de resultado, armonización de alelos, estimación de MR, pruebas de heterogeneidad y análisis de sensibilidad. Cargue el paquete MRPRESSO para evaluar la pleiotropía horizontal global y las variantes atípicas potenciales.
- Utilice las siguientes funciones principales en el flujo de trabajo: extract_instruments, extract_outcome_data, harmonise_data, mr, generate_odds_ratios, mr_heterogeneity, mr_pleiotropy_test, mr_singlesnp, mr_leaveoneout, mr_scatter_plot, mr_forest_plot, mr_funnel_plot y mr_leaveoneout_plot. Utilice MRPRESSO::mr_presso para realizar la prueba global MR-PRESSO y, cuando corresponda, las pruebas de valores atípicos y distorsión.
3. Selección del conjunto de datos de exposición y cribado de variables instrumentales
- Extraiga polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) asociados con el ACV del conjunto de datos IEU OpenGWAS ebi-a-GCST90018864. Este conjunto de datos incluye 11.929 casos de ACV y 472.192 controles, con un tamaño total de muestra de 484.121 participantes.
- Seleccione SNPs candidatos asociados con el ACV utilizando un umbral de significancia de p < 5 × 10-6.
- El umbral de p < 5 × 10-6 se utiliza en este protocolo representativo para conservar un número adecuado de instrumentos independientes para los análisis de sensibilidad. Dado que este umbral es menos estricto que el umbral convencional de significancia a nivel del genoma, los hallazgos basados en estos instrumentos deben interpretarse como exploratorios y sugerentes, no definitivos.
- Realice el agrupamiento por desequilibrio de ligamiento para conservar SNPs independientes. Utilice un umbral de r2 de 0,001 y una ventana de agrupamiento de 10.000 kb.
- Utilice el siguiente comando en R para extraer los instrumentos candidatos:
extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE) - Calcule el estadístico F para cada SNP conservado utilizando la fórmula F = (β/SE)2, donde β y SE son la estimación del efecto del SNP sobre la exposición y el error estándar, respectivamente.
- Excluya los SNPs con un estadístico F < 10 para reducir el riesgo de sesgo por instrumentos débiles. Resuma la distribución de los estadísticos F utilizando el valor mínimo, máximo, mediano y el rango intercuartílico (IQR).
4. Extracción del conjunto de datos de resultados
- Extraiga las asociaciones de resultados de DEMV a partir del conjunto de datos GWAS de FinnGen finn-b-F5_VASCDEM. Este conjunto de datos incluye 881 casos de DEMV y 211.508 controles.
- Extraiga las asociaciones de resultados para todos los SNPs asociados a ACV seleccionados utilizando la función extract_outcome_data.
- Busque SNPs proxy cuando los SNPs objetivo no estén directamente disponibles en el conjunto de datos de resultado. Mantenga las variantes emparejadas con proxy cuando haya información de proxy válida y correspondencia de alelos disponible.
- Utilice el siguiente comando de R para extraer el conjunto de datos de resultado:
extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)
5. Armonización de alelos y retención de SNP
- Harmonice los conjuntos de datos de exposición y resultado antes del análisis de MR.
- Alinee el alelo de efecto y el otro alelo de modo que las estimaciones del efecto del SNP–exposición y del SNP–resultado correspondan al mismo alelo de efecto.
- Revise los SNPs durante la harmonización para identificar desajustes alélicos, asociaciones de resultado no disponibles y alineaciones alélicas ambiguas. Mantenga los SNPs con estimaciones de efecto disponibles para exposición y resultado tras la harmonización.
- Utilice el siguiente comando en R para la harmonización alélica: harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
- Registre el número de SNPs extraídos inicialmente del conjunto de datos de exposición, el número de SNPs con asociaciones de resultado disponibles, el número de variantes emparejadas por proxy y el número de SNPs mantenidos para el análisis final de MR.
6. Análisis principal de MR y análisis de sensibilidad
- Realice el análisis principal de MR utilizando el método ponderado por la inversa de la varianza (IVW, por sus siglas en inglés).
- Realice análisis complementarios de MR utilizando los métodos de mediana ponderada y MR-Egger para evaluar la consistencia de la estimación causal bajo diferentes supuestos.
- Genere odds ratios (OR) e intervalos de confianza del 95% (IC) a partir de las estimaciones de MR.
- Utilice los siguientes comandos en R para ejecutar el análisis de MR y calcular los odds ratios:
res <- mr(dat)
res <- generate_odds_ratios(res) - Dado que se evalúa una única asociación prespecificada entre exposición y resultado, defina el umbral corregido por Bonferroni para la inferencia principal de MR como 0,05/1 = 0,05. Utilice un valor p bilateral < 0,05 como umbral de significancia estadística para el análisis principal IVW.
- Para contextualizar la precisión estadística del análisis principal dada la limitada cantidad de casos de DEMV, realice un cálculo post hoc de potencia mediante la prueba de Wald bilateral basado en la estimación IVW observada y su error estándar. Calcule la potencia utilizando el parámetro de no centralidad βIVW/SEIVW a un nivel α bilateral de 0,05. Calcule el efecto mínimo detectable correspondiente a una potencia del 80% como exp[(z0,975 + z0,80) × SE]. Dado que el ACV es una exposición binaria y las asociaciones entre SNP y exposición se expresan en escala logarítmica de odds, presente este análisis como una evaluación descriptiva condicionada al efecto sobre la precisión, en lugar de como un cálculo prespecificado del tamaño de la muestra11.
7. Análisis de heterogeneidad, pleiotropía horizontal y de exclusión uno por uno
- Evalúe la heterogeneidad entre SNP utilizando el estadístico Q de Cochran.
- Utilice el siguiente comando en R para calcular las estadísticas de heterogeneidad:
mr_heterogeneity(dat) - Evalúe la pleiotropía horizontal direccional mediante la prueba del intercepto de MR-Egger.
- Utilice el siguiente comando en R para calcular el intercepto de MR-Egger:
mr_pleiotropy_test(dat) - Evalúe la pleiotropía horizontal global y las variantes atípicas potenciales utilizando MR-PRESSO con 10.000 simulaciones, un umbral de significancia de 0,05 y habilitando ambas pruebas: de valores atípicos y de distorsión12.
- Utilice el siguiente comando en R para el análisis con MR-PRESSO:
set.seed(20260729)
mr_presso(
BetaOutcome = "beta.outcome",
BetaExposure = "beta.exposure",
SdOutcome = "se.outcome",
SdExposure = "se.exposure",
OUTLIERtest = TRUE,
DISTORTIONtest = TRUE,
data = dat,
NbDistribution = 10000,
SignifThreshold = 0.05
) - Realice un análisis de un solo SNP para estimar el efecto de cada SNP por separado.
- Utilice el siguiente comando en R para el análisis de un solo SNP:
res_single <- mr_singlesnp(dat) - Realice un análisis de exclusión secuencial eliminando un SNP a la vez y repitiendo el análisis IVW.
- Utilice el siguiente comando en R para el análisis de exclusión secuencial:
res_loo <- mr_leaveoneout(dat)
8. Visualización y resultados
- Genere un gráfico de dispersión para mostrar las estimaciones de MR mediante diferentes métodos.
- Genere un gráfico de bosque para mostrar las estimaciones individuales de cada SNP y la estimación global de MR.
- Genere un gráfico en embudo para evaluar visualmente la simetría de las estimaciones específicas de cada SNP.
- Genere un gráfico de exclusión individual (leave-one-out) para evaluar si la estimación global está determinada por un solo SNP.
- Utilice los siguientes comandos de R para generar los gráficos:
mr_scatter_plot(res, dat)
mr_forest_plot(res_single)
mr_funnel_plot(res_single)
mr_leaveoneout_plot(res_loo) - Exporte los resultados de MR, la tabla de variables instrumentales, la tabla de asociación del resultado y los resultados del análisis de sensibilidad para su presentación y reproducibilidad.
Resultados
Figura 1 resume el flujo de trabajo general del protocolo de aleatorización mendeliana de dos muestras, desde la selección de conjuntos de datos y el cribado de instrumentos hasta los análisis de sensibilidad y la visualización de resultados. A continuación se presentan salidas representativas de cada etapa.
Variables instrumentales genéticas y control de calidad de la armonización
Inicialmente se extrajeron un total de 52 SNP asociados a IS del conjunto de datos GWAS de exposición utilizando un umbral de significancia de p < 5 × 10-6. Luego, las asociaciones del resultado se extrajeron del conjunto de datos GWAS de DaV. Después del apareamiento del resultado, la búsqueda de SNP proxy y la armonización de alelos, se conservaron 51 SNP para el análisis final de MR. Dos variantes se aparearon utilizando SNP proxy. Los instrumentos genéticos conservados se enumeran en la Tabla 1. Los estadísticos F de los 51 instrumentos conservados oscilaron entre 20,91 y 46,06, con una mediana de 25,08 y un RIC de 22,95–30,71. Ningún SNP conservado tuvo un estadístico F inferior a 10, lo que indica una baja probabilidad de sesgo por instrumento débil.
Estimaciones de RM para ACV y DEM
El diagrama de dispersión mostró la dirección y magnitud de las estimaciones específicas de SNP mediante diferentes métodos de MR (Figura 2). Los métodos IVW y mediana ponderada mostraron asociaciones positivas, mientras que la estimación de MR-Egger fue coherente en dirección pero no alcanzó significancia estadística.
El gráfico de bosque con las estimaciones individuales de SNP mostró las asociaciones específicas de cada SNP con el riesgo de demencia vascular (Figura 3). Las estimaciones globales de MR se resumen en la Figura 4. El método IVW mostró una asociación positiva estadísticamente significativa entre el ACV predicho genéticamente y el riesgo de demencia vascular (OR = 1,63, IC 95 %: 1,21–2,21, p = 0,0013). El método de mediana ponderada produjo una estimación significativa concordante (OR = 1,60, IC 95 %: 1,06–2,42, p = 0,0240). La estimación mediante MR-Egger fue direccionalmente consistente, pero no alcanzó significancia estadística (OR = 2,21, IC 95 %: 0,97–5,01, p = 0,0645).
El estudio GWAS del resultado de VaD de FinnGen incluyó 881 casos y 211.508 controles. En un cálculo post hoc de la prueba de Wald bilateral condicional a la estimación observada de IVW, la potencia estimada para el análisis principal de IVW fue del 89,5 % con α = 0,05. El efecto mínimo detectable correspondiente para una potencia del 80 % fue una OR de 1,54. En contraste, el efecto mínimo detectable para el análisis MR-Egger fue una OR de 3,23, que superó la estimación MR-Egger observada con dirección coherente (OR = 2,21). Por lo tanto, el resultado no significativo de MR-Egger debe interpretarse como un reflejo de la precisión limitada de este estimador de sensibilidad menos eficiente, y no como evidencia por sí sola contra la dirección de la estimación principal de IVW.
Dado que se evaluó una única asociación prespecificada entre exposición e resultado principal, el umbral corregido por Bonferroni para la inferencia principal de MR fue de 0,05/1 = 0,05. Por lo tanto, el resultado de IVW cumplió el umbral de significancia corregido. En conjunto, estos hallazgos aportan evidencia sugestiva de un posible efecto positivo del IS predicho genéticamente sobre el riesgo de DEM, basado principalmente en la estimación de IVW y respaldado por el análisis de sensibilidad de mediana ponderada. Sin embargo, la estimación de MR-Egger fue direccionalmente consistente, pero no alcanzó significancia estadística; por consiguiente, los resultados no deben interpretarse como evidencia definitiva de causalidad.
Análisis de heterogeneidad y pleiotropía horizontal
La heterogeneidad entre SNP se evaluó utilizando el estadístico Q de Cochran. La prueba de heterogeneidad IVW arrojó un valor de Q = 57,46 con 50 grados de libertad (p = 0,218), y la prueba de heterogeneidad MR-Egger arrojó un valor de Q = 56,77 con 49 grados de libertad (p = 0,208). Estos resultados no indicaron una heterogeneidad sustancial entre las estimaciones específicas de cada SNP. La pleiotropía horizontal direccional se evaluó mediante la prueba del intercepto de MR-Egger. El intercepto de MR-Egger fue de -0,0195 (EE = 0,0253, p = 0,444), lo que indica ausencia de evidencia estadística de pleiotropía horizontal direccional. Se realizó un análisis MR-PRESSO utilizando los 51 SNP armonizados retenidos con 10.000 simulaciones. La prueba global de MR-PRESSO no mostró evidencia de pleiotropía horizontal global (RSSobs = 59,61; p empírico = 0,2388). Dado que la prueba global no fue estadísticamente significativa, las pruebas individuales de valores atípicos y de distorsión no fueron aplicables, y no se generó ninguna estimación corregida por valores atípicos. El gráfico en embudo proporcionó una evaluación visual de la simetría de las estimaciones específicas de cada SNP (Figura 5). Los ajustes y resultados detallados de MR-PRESSO se presentan en Tabla Suplementaria 1.
Análisis de sensibilidad de exclusión individual y validación de la salida del protocolo
Se realizó un análisis de exclusión individual para evaluar si la estimación global de MR estaba siendo influenciada por un solo SNP. El gráfico de exclusión individual mostró que la eliminación sucesiva de SNPs individuales no alteró materialmente la estimación global (Figura 6), lo que sugiere que ningún instrumento genético individual dominó la asociación. En conjunto, estos resultados representativos demuestran el resultado práctico del flujo de trabajo de MR de dos muestras descrito en este protocolo. Tabla 1 muestra los instrumentos genéticos conservados tras la selección y armonización de SNPs. Figura 2 ilustra la dirección de las estimaciones de MR entre diferentes métodos, Figura 3 presenta estimaciones específicas para cada SNP, Figura 4 resume las estimaciones globales de MR, Figura 5 facilita la evaluación visual de pleiotropía o asimetría, y Figura 6 evalúa la influencia de SNPs individuales. Tabla Suplementaria 2 vincula cada paso principal del protocolo con su resultado validador correspondiente.
Todas las estadísticas resumidas de GWAS en bruto analizadas en este estudio están disponibles públicamente. El conjunto de datos de exposición a accidente cerebrovascular isquémico se obtuvo de la base de datos IEU OpenGWAS bajo el identificador de conjunto ebi-a-GCST90018864. El conjunto de datos de resultado para demencia vascular se obtuvo del conjunto de datos FinnGen GWAS bajo el identificador de conjunto finn-b-F5_VASCDEM. La tabla de variables instrumentales extraída, el conjunto de datos analizado armonizado, las tablas de resultados de MR y los archivos de salida relevantes se proporcionan como archivos complementarios.
Figura 1. Flujo de trabajo del protocolo MR de dos muestras. Esta figura resume los pasos principales del protocolo, incluyendo la selección del conjunto de datos de exposición, el cribado de variables instrumentales, la extracción de datos del resultado, la armonización de alelos, la estimación MR, la prueba de heterogeneidad, la evaluación de pleiotropía horizontal, el análisis de exclusión uno por uno y la visualización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Gráfico de dispersión de las estimaciones de aleatorización mendeliana (MR) para la asociación entre ACV e ID. Cada punto representa una estimación específica para un SNP. Las líneas ajustadas representan la asociación estimada obtenida mediante diferentes métodos de MR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Gráfico de bosque de estimaciones de MR individuales por SNP. Esta figura muestra las estimaciones individuales específicas para cada SNP sobre la asociación entre variantes genéticas asociadas con el ACV y el riesgo de demencia vascular. Las líneas horizontales representan los intervalos de confianza al 95 %. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Gráfico de bosque de las estimaciones globales de MR mediante diferentes métodos. Esta figura resume las estimaciones globales de MR obtenidas mediante los métodos IVW, mediana ponderada y MR-Egger. Las líneas horizontales representan intervalos de confianza del 95 %. MR, aleatorización mendeliana; IVW, ponderado por la inversa de la varianza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Gráfico en embudo de las estimaciones específicas de SNP para la MR. Esta figura muestra la distribución de las estimaciones específicas de SNP para la MR y permite evaluar visualmente la simetría entre los instrumentos genéticos. MR, aleatorización mendeliana; IVW, ponderado por la varianza inversa. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 6. Análisis de sensibilidad leave-one-out. Esta figura muestra la estimación de MR tras eliminar secuencialmente cada SNP. El gráfico se utilizó para evaluar si la estimación global estaba influenciada por un único instrumento genético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| No. | SNP | Gen | Chr. | EA | OA | EAF.IS | EAF.VD | IS β (EE) | VD β (EE) | estadístico F | R² |
| 1 | rs10886430 | GRK5 | 10 | G | A | 0.118244 | 0.09536 | 0.1147 (0.0220) | -0.0172 (0.0852) | 27.18 | 5.61E-05 |
| 2 | rs10936572 | LOC107986051 | 3 | T | C | 0.179643 | 0.1235 | -0.0512 (0.0104) | 0.1444 (0.0743) | 24.24 | 5.01E-05 |
| 3 | rs11045239 | PDE3A | 12 | A | G | 0.492943 | 0.4629 | 0.0604 (0.0089) | 0.0303 (0.0494) | 46.06 | 9.51E-05 |
| 4 | rs11047532 | LOC105369698 | 12 | G | C | 0.305214 | 0.1513 | 0.0499 (0.0105) | 0.0159 (0.0689) | 22.59 | 4.66E-05 |
| 5 | rs11065836 | CUX2 | 12 | A | G | 0.159123 | 0.07442 | -0.0608 (0.0103) | 0.0245 (0.0929) | 34.84 | 7.20E-05 |
| 6 | rs11105378 | ATP2B1 | 12 | T | C | 0.203466 | 0.07522 | -0.0540 (0.0098) | -0.1174 (0.0916) | 30.36 | 6.27E-05 |
| 7 | rs117140252 | - | 14 | A | G | 0.041216 | 0.06988 | 0.1568 (0.0311) | 0.1498 (0.0967) | 25.42 | 5.25E-05 |
| 8 | rs117343276 | - | 10 | G | A | 0.030533 | 0.0431 | -0.0905 (0.0196) | -0.1449 (0.1233) | 21.32 | 4.40E-05 |
| 9 | rs11831940 | HDAC7 | 12 | A | G | 0.251914 | 0.3526 | 0.0631 (0.0130) | 0.1226 (0.0513) | 23.56 | 4.87E-05 |
| 10 | rs11880613 | DNM2 | 19 | A | G | 0.184857 | 0.1804 | -0.0613 (0.0110) | 0.1499 (0.0640) | 31.06 | 6.41E-05 |
| 11 | rs12445022 | LOC124903748 | 16 | A | G | 0.271667 | 0.3193 | 0.0605 (0.0112) | 0.0218 (0.0527) | 29.18 | 6.03E-05 |
| 12 | rs12509595 | - | 4 | C | T | 0.297929 | 0.3124 | 0.0577 (0.0091) | 0.1462 (0.0533) | 40.2 | 8.30E-05 |
| 13 | rs12633109 | - | 3 | T | G | 0.360897 | 0.3263 | 0.0436 (0.0089) | 0.0395 (0.0526) | 24 | 4.96E-05 |
| 14 | rs1275980 | KCNK3 | 2 | T | C | 0.498545 | 0.5481 | -0.0582 (0.0094) | -0.0128 (0.0495) | 38.33 | 7.92E-05 |
| 15 | rs13123551 | - | 4 | A | T | 0.616442 | 0.5065 | 0.0552 (0.0097) | 0.0818 (0.0493) | 32.38 | 6.69E-05 |
| 16 | rs147871383 | MIR99AHG | 21 | A | G | 0.02368 | 0.01925 | 0.2259 (0.0494) | 0.2534 (0.1903) | 20.91 | 4.32E-05 |
| 17 | rs16918175 | - | 10 | C | T | 0.104037 | 0.0811 | -0.0649 (0.0131) | 0.0332 (0.0895) | 24.54 | 5.07E-05 |
| 18 | rs17182166 | ACVR1 | 2 | T | G | 0.12494 | 0.137 | 0.0751 (0.0156) | -0.0046 (0.0703) | 23.18 | 4.79E-05 |
| 19 | rs1906779 | - | 15 | A | G | 0.211386 | 0.1239 | 0.0438 (0.0095) | -0.0342 (0.0758) | 21.26 | 4.39E-05 |
| 20 | rs1948696 | ITGB5 | 3 | C | T | 0.650138 | 0.6041 | -0.0459 (0.0091) | 0.0219 (0.0501) | 25.44 | 5.25E-05 |
| 21 | rs1973765 | LSP1 | 11 | C | T | 0.486717 | 0.4124 | 0.0441 (0.0092) | -0.0229 (0.0505) | 22.98 | 4.75E-05 |
| 22 | rs2429123 | CACNA1C, DCP1B | 12 | C | T | 0.729926 | 0.725 | 0.0473 (0.0098) | 0.0190 (0.0549) | 23.3 | 4.81E-05 |
| 23 | rs2447561 | - | 8 | T | A | 0.873442 | 0.8382 | -0.0589 (0.0116) | -0.0570 (0.0674) | 25.78 | 5.33E-05 |
| 24 | rs245015 | MSH3 | 5 | A | G | 0.685061 | 0.6562 | -0.0456 (0.0089) | 0.0065 (0.0519) | 26.25 | 5.42E-05 |
| 25 | rs2501968 | CENPQ | 6 | G | A | 0.465302 | 0.4229 | -0.0490 (0.0086) | -0.0879 (0.0498) | 32.46 | 6.71E-05 |
| 26 | rs2526620 | - | 7 | G | A | 0.252144 | 0.2459 | 0.0500 (0.0092) | 0.0505 (0.0576) | 29.54 | 6.10E-05 |
| 27 | rs284160 | TGFBR3 | 1 | A | G | 0.192644 | 0.1186 | 0.0572 (0.0096) | 0.1573 (0.0768) | 35.5 | 7.33E-05 |
| 28 | rs2842870 | PMF1, PMF1-BGLAP | 1 | C | T | 0.360398 | 0.3434 | -0.0446 (0.0087) | -0.0727 (0.0518) | 26.28 | 5.43E-05 |
| 29 | rs2880492 | NCOR2 | 12 | C | T | 0.035841 | 0.01984 | -0.1293 (0.0266) | -0.1917 (0.1781) | 23.63 | 4.88E-05 |
| 30 | rs35790371 | RBFOX1 | 16 | A | G | 0.005125 | 0.001903 | 0.5587 (0.1176) | 0.1447 (0.5420) | 22.57 | 4.66E-05 |
| 31 | rs5752720 | TTC28 | 22 | T | C | 0.28441 | 0.1844 | 0.0422 (0.0091) | -0.0311 (0.0635) | 21.51 | 4.44E-05 |
| 32 | rs57694670 | SH3PXD2A | 10 | G | A | 0.433638 | 0.3834 | -0.0507 (0.0086) | 0.0080 (0.0507) | 34.76 | 7.18E-05 |
| 33 | rs6462001 | - | 7 | T | G | 0.881494 | 0.8329 | -0.0765 (0.0151) | -0.0567 (0.0662) | 25.67 | 5.30E-05 |
| 34 | rs6843082 | - | 4 | A | G | 0.65294 | 0.6907 | -0.0438 (0.0092) | -0.0568 (0.0534) | 22.67 | 4.68E-05 |
| 35 | rs7091346 | SH3PXD2A | 10 | T | C | 0.45273 | 0.2664 | -0.0582 (0.0098) | -0.0143 (0.0552) | 35.27 | 7.28E-05 |
| 36 | rs7194129 | CFDP1 | 16 | T | C | 0.573691 | 0.5538 | 0.0399 (0.0084) | 0.0293 (0.0495) | 22.56 | 4.66E-05 |
| 37 | rs7341574 | ZFPM2 | 8 | T | C | 0.313243 | 0.3895 | 0.0463 (0.0094) | -0.0774 (0.0505) | 24.26 | 5.01E-05 |
| 38 | rs7451833 | - | 6 | G | A | 0.103042 | 0.1166 | 0.1280 (0.0220) | 0.1253 (0.0777) | 33.85 | 6.99E-05 |
| 39 | rs74617384 | LPA | 6 | T | A | 0.070999 | 0.04573 | 0.1415 (0.0281) | -0.0532 (0.1162) | 25.36 | 5.24E-05 |
| 40 | rs74849463 | PIK3C2B | 1 | T | C | 0.240949 | 0.2043 | 0.0445 (0.0092) | -0.0319 (0.0616) | 23.4 | 4.83E-05 |
| 41 | rs757241 | AFAP1-AS1 | 4 | C | G | 0.673377 | 0.6704 | -0.0681 (0.0145) | -0.0274 (0.0523) | 22.06 | 4.56E-05 |
| 42 | rs76099321 | CNNM2 | 10 | A | G | 0.052085 | 0.02979 | -0.0691 (0.0150) | -0.2215 (0.1464) | 21.22 | 4.38E-05 |
| 43 | rs7670136 | - | 4 | C | T | 0.571088 | 0.6269 | -0.0473 (0.0101) | 0.0391 (0.0509) | 21.93 | 4.53E-05 |
| 44 | rs77455924 | MNT | 11 | T | C | 0.056457 | 0.02996 | 0.1632 (0.0331) | 0.0444 (0.1477) | 24.31 | 5.02E-05 |
| 45 | rs7820334 | - | 8 | T | C | 0.246549 | 0.2949 | -0.0643 (0.0127) | -0.1327 (0.0648) | 25.63 | 5.29E-05 |
| 46 | rs7859727 | CDKN2B-AS1 | 9 | T | C | 0.518845 | 0.4151 | 0.0569 (0.0087) | 0.0281 (0.0498) | 42.77 | 8.83E-05 |
| 47 | rs7989823 | COL4A1, COL4A2 | 13 | C | A | 0.591615 | 0.6188 | 0.0527 (0.0089) | 0.0693 (0.0518) | 35.06 | 7.24E-05 |
| 48 | rs79960344 | - | 17 | G | T | 0.102808 | 0.1031 | 0.0651 (0.0130) | -0.1596 (0.0805) | 25.08 | 5.18E-05 |
| 49 | rs880315 | CASZ1 | 1 | C | T | 0.445525 | 0.4139 | 0.0416 (0.0089) | 0.0444 (0.0501) | 21.85 | 4.51E-05 |
| 50 | rs9112 | LOC100505841 | 5 | A | G | 0.436595 | 0.3573 | 0.0407 (0.0085) | -0.0274 (0.0523) | 22.93 | 4.74E-05 |
| 51 | rs979380 | - | 17 | A | G | 0.531844 | 0.6197 | -0.0417 (0.0084) | -0.0196 (0.0506) | 24.64 | 5.09E-05 |
| EAF.IS y EAF.VD indican las frecuencias del alelo de efecto en los conjuntos de datos de accidente cerebrovascular isquémico (exposición) y demencia vascular (resultado), respectivamente. Estadístico F = (β/SE)². R² por SNP = F/(F + N − 2), donde N = 484.121. Los SNPs se seleccionaron utilizando p < 5 × 10-6 y agrupamiento por desequilibrio de ligamiento con r² < 0,001 dentro de una ventana de 10 000 kb. | |||||||||||
Tabla 1: Instrumentos genéticos para el accidente cerebrovascular isquémico y asociaciones SNP–resultado correspondientes para la demencia vascular. La tabla enumera los 51 SNP finales, incluyendo el identificador del SNP, el gen asignado, el cromosoma, los alelos, la FEA, las estimaciones del SNP–rasgo, las estadísticas F y la R2 por SNP. Los SNP se seleccionaron con p < 5 × 10-6 y se agruparon con r2 < 0,001 dentro de 10.000 kb. EAF.IS y EAF.VD indican las frecuencias del alelo efecto en los conjuntos de datos de IS y VD, respectivamente. Chr., cromosoma; EA, alelo efecto; OA, otro alelo; EAF, frecuencia del alelo efecto; IS, accidente cerebrovascular isquémico; VD, demencia vascular. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla suplementaria 1. Evaluación de la pleiotropía horizontal mediante MR-PRESSO para el análisis de accidente cerebrovascular isquémico y demencia vascular. Esta tabla resume el análisis realizado con MR-PRESSO para evaluar la pleiotropía horizontal global y las variantes atípicas potenciales, utilizando el conjunto de datos armonizado final de 51 SNP.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 2. Pasos del protocolo y resultados correspondientes de validación. Esta tabla vincula cada paso principal del protocolo con su resultado representativo correspondiente y la ubicación informada en el manuscrito, demostrando la implementación y validación del flujo de trabajo analítico.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Este estudio presenta un protocolo de MR de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre el ACV y la Demencia Vascular utilizando estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente. En el análisis representativo, los métodos IVW y mediana ponderada respaldaron una asociación positiva entre el ACV predicho genéticamente y el riesgo de Demencia Vascular, mientras que la estimación MR-Egger fue direccionalmente consistente pero no alcanzó significancia estadística. Por lo tanto, estos hallazgos proporcionan evidencia sugestiva de un posible efecto causal, más que una prueba definitiva de causalidad.
La asociación observada es biológicamente plausible en el contexto de la lesión cerebrovascular. El ACV puede provocar lesión neuronal regional, perfusión cerebral comprometida y cambios neurodegenerativos posteriores. Estudios previos han mostrado que la DEM a menudo ocurre en el contexto de un flujo sanguíneo cerebral reducido o daño cerebrovascular13,14. Los cambios cerebrovasculares crónicos posteriores al ACV podrían contribuir aún más al deterioro cognitivo y al riesgo de DEM15. Además, la lesión microvascular postaccidente cerebrovascular, las respuestas inflamatorias y la disfunción neurovascular crónica podrían constituir vínculos biológicos potenciales entre el ACV y la DEM. Sin embargo, el presente protocolo de RM no puede establecer directamente estos mecanismos, y los hallazgos deben interpretarse junto con futuros estudios de validación clínica y mecanicista.
La estimación mediante MR-Egger no alcanzó significación estadística. Este hallazgo debe interpretarse con cautela, y no como una contradicción directa de los resultados obtenidos con IVW y la mediana ponderada. MR-Egger puede proporcionar estimaciones más robustas frente a ciertas formas de pleiotropía direccional, pero generalmente tiene menor potencia estadística, especialmente cuando los efectos del instrumento son modestos. En este análisis, el intercepto de MR-Egger no indicó pleiotropía horizontal direccional estadísticamente significativa, y las pruebas de heterogeneidad no mostraron heterogeneidad sustancial entre SNP. Además, la prueba global MR-PRESSO no mostró evidencia de pleiotropía horizontal global. Estos análisis de sensibilidad reducen la preocupación por una pleiotropía direccional o global medible, pero no excluyen todas las fuentes posibles de sesgo ni establecen causalidad.
Sin embargo, se debe considerar el número modesto de casos de demencia vascular al interpretar estos hallazgos. Aunque el análisis principal IVW tuvo una potencia post hoc estimada del 89,5 % condicional al tamaño del efecto observado, este resultado es descriptivo y no debe interpretarse como una justificación prespecificada del tamaño de la muestra. El recuento limitado de casos redujo particularmente la precisión de los estimadores de sensibilidad menos eficientes; el efecto mínimo detectable del 80 % para MR-Egger fue una OR de 3,23, que fue mayor que su estimación observada. Por consiguiente, el resultado no significativo de MR-Egger no elimina la incertidumbre respecto a la magnitud de la asociación. Estos cálculos de potencia tampoco abordan posibles sesgos relacionados con la validez del instrumento, la superposición de muestras, la heterogeneidad del fenotipo o la pleiotropía horizontal residual.
Varios pasos analíticos son fundamentales para la fiabilidad de este flujo de trabajo de RM. Primero, los conjuntos de datos de GWAS para la exposición y el resultado deben identificarse claramente mediante IDs de conjuntos de datos o información de acceso. Segundo, la selección de SNPs y la agrupación por desequilibrio de ligamiento deben realizarse utilizando umbrales predefinidos para obtener instrumentos genéticos independientes. Tercero, la fuerza del instrumento debe evaluarse mediante estadísticos F para reducir el riesgo de sesgo por instrumentos débiles. Cuarto, la armonización de alelos es esencial para asegurar que las estimaciones de SNP–exposición y SNP–resultado correspondan al mismo alelo efecto. Finalmente, deben utilizarse análisis de heterogeneidad, pleiotropía horizontal y de tipo leave-one-out (dejar uno fuera) para evaluar si la estimación principal se ve influenciada por efectos de SNPs inconsistentes, pleiotropía direccional o un solo instrumento genético dominante.
Las fuentes comunes de fallo o sesgo en este flujo de trabajo incluyen SNPs asociados con exposición insuficientes, instrumentos débiles, SNPs de resultado no disponibles, alineación ambigua de alelos, variantes palindrómicas, desajuste de SNPs proxy, heterogeneidad entre estimaciones específicas de SNPs, pleiotropía horizontal, desajuste de población, heterogeneidad fenotípica y posible superposición de muestras. Estos problemas pueden abordarse verificando los identificadores de conjuntos de datos de GWAS, aplicando umbrales consistentes de selección y agrupamiento de SNPs, documentando el uso de SNPs proxy, revisando los resultados de la armonización, resumiendo las estadísticas F y interpretando las estimaciones de MR junto con los resultados de heterogeneidad, pleiotropía y análisis de exclusión individual. Si se detecta una heterogeneidad o pleiotropía sustanciales, la estimación principal IVW debe interpretarse con cautela y se deberían considerar análisis de sensibilidad adicionales o conjuntos de datos alternativos.
También se debe considerar la posible superposición de muestras. Los estudios GWAS de exposición y los estudios GWAS de resultados de FinnGen se derivaron ambos de recursos de ascendencia europea, y no fue posible cuantificar el grado de superposición de participantes a partir de las estadísticas resumidas disponibles. Dicha superposición podría sesgar las estimaciones de MR de dos muestras hacia asociaciones observacionales, particularmente cuando los instrumentos no están fuertemente asociados con la exposición. Esta limitación debe tenerse en cuenta al interpretar el resultado representativo.
En comparación con los estudios observacionales convencionales de cohorte o de casos y controles, la MR puede reducir los sesgos por confusión y causalidad inversa bajo supuestos válidos de variable instrumental. Sin embargo, los estudios observacionales siguen siendo valiosos para estimar la incidencia de enfermedades, los patrones temporales y el pronóstico clínico. En comparación con los ensayos aleatorizados controlados o los modelos experimentales, la MR puede evaluar asociaciones causales potenciales utilizando datos genéticos existentes cuando los estudios de intervención directa son inviables o inéticos. No obstante, la MR no puede revelar directamente los mecanismos celulares ni sustituir la validación mecanicista. Por lo tanto, este protocolo debe considerarse complementario a los estudios de cohorte, los análisis transversales, los modelos animales y los experimentos celulares, y no como un sustituto de ellos.
Estudios previos han explorado factores de riesgo vasculares y resultados relacionados con demencia mediante enfoques epidemiológicos y genéticos. Por ejemplo, la diabetes y la hipertensión se han asociado con el riesgo de demencia en investigaciones clínicas y basadas en poblaciones anteriores16. Los estudios existentes basados en MR también han investigado el ACV, la DEM y los mecanismos relacionados con comorbilidades. El presente manuscrito difiere de estos estudios en su objetivo principal. En lugar de tratar de identificar nuevos blancos moleculares o validar experimentalmente mecanismos de enfermedad, este artículo se centra en presentar un protocolo reproducible para realizar un análisis de MR de dos muestras utilizando estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente.
Este protocolo tiene varias limitaciones. En primer lugar, el análisis se basó en estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente, y los resultados podrían no ser completamente generalizables a poblaciones no europeas o a conjuntos de datos con definiciones de casos diferentes. En segundo lugar, se utilizó un umbral relajado para la selección de SNP (p < 5 × 10-6) con el fin de conservar un número adecuado de instrumentos independientes para los análisis de sensibilidad. Aunque todos los instrumentos conservados tenían valores de F-estadística >10, este umbral es menos estricto que el umbral convencional de significancia a nivel genómico y podría incluir variantes con asociaciones de exposición más débiles o menos robustas. Por lo tanto, los hallazgos representativos deben interpretarse como exploratorios y sugerentes, más que como evidencia definitiva de causalidad. En tercer lugar, aunque el MR puede reducir el sesgo por confusión y causalidad inversa, no puede excluir completamente la pleiotropía horizontal, la mala clasificación fenotípica, el solapamiento de muestras o el sesgo introducido por instrumentos inválidos. En cuarto lugar, la estimación no significativa de MR-Egger indica que la interpretación causal debe mantenerse cautelosa. En quinto lugar, este protocolo no incluye experimentos en células, modelos animales ni validación en cohortes independientes; estos enfoques serían valiosos para aclarar los mecanismos biológicos y la aplicabilidad clínica.
Además, la IS fue modelada como un fenotipo general. Este protocolo representativo no fue diseñado para determinar si alguna asociación se debe a un accidente cerebrovascular aterosclerótico de arteria grande, oclusión de vaso pequeño, accidente cerebrovascular cardioembólico o cualquier otro subtipo. En consecuencia, el resultado no debe interpretarse como evidencia de un efecto específico de un subtipo. Trabajos futuros deberían aplicar el mismo flujo de trabajo a conjuntos de datos de GWAS bien potenciados y específicos de subtipos, utilizando un plan de análisis preespecificado y armonizado.
Las aplicaciones futuras de este protocolo pueden extenderse más allá del ACV y la DEM. El mismo flujo de trabajo puede adaptarse para evaluar otras relaciones exposición-resultado de tipo cerebrovascular, neurodegenerativo, metabólico, inflamatorio o cardiovascular cuando se dispone de estadísticas resumidas de GWAS adecuadas. Los estudios futuros también podrían ampliar este flujo de trabajo mediante la incorporación de validación independiente de GWAS, MR bidireccional, MR multivariable, MR de mediación, o la integración con evidencia basada en cohortes y experimental.
En resumen, este protocolo proporciona un flujo de trabajo reproducible para realizar análisis de MR de dos muestras utilizando estadísticas resumidas de GWAS públicas. Los resultados representativos aportan evidencia sugestiva de una posible asociación positiva entre la IS predicha genéticamente y el riesgo de DEM, respaldada principalmente por los métodos IVW y mediana ponderada, mientras que la estimación MR-Egger no alcanzó significancia estadística. Sin embargo, los hallazgos no deben interpretarse como prueba mecanicista definitiva. Se necesitan estudios de validación independientes basados en poblaciones e investigaciones experimentales para aclarar aún más los mecanismos biológicos y la relevancia clínica de esta asociación.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores. No se utilizaron herramientas de inteligencia artificial (IA) ni modelos de lenguaje grandes (MLG) en la redacción, edición o preparación de este manuscrito.
Agradecimientos
Los autores no recibieron financiamiento específico para este estudio.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Conjunto de datos GWAS de FinnGen | FinnGen | finn-b-F5_VASCDEM | Conjunto de datos GWAS público utilizado como fuente del resultado para la demencia vascular |
| Base de datos IEU OpenGWAS | MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol | ebi-a-GCST90018864 | Conjunto de datos GWAS público utilizado como fuente de exposición para el accidente cerebrovascular isquémico |
| Software R | R Foundation for Statistical Computing | No aplicable | Software estadístico utilizado para el análisis de MR |
| RStudio | Posit Software, PBC | No aplicable | Entorno de desarrollo integrado utilizado para ejecutar scripts de R |
| Paquete TwoSampleMR | MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol | No aplicable | Paquete de R utilizado para la extracción de instrumentos, armonización, análisis de MR y análisis de sensibilidad |
| Paquete MRPRESSO | CRAN | Versión 1.0 | Paquete de R utilizado para evaluar la pleiotropía horizontal global y los posibles instrumentos atípicos |
| Paquete writexl | CRAN | No aplicable | Paquete de R utilizado para exportar tablas de resultados como archivos xlsx |
Referencias
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