Relación causal entre el accidente cerebrovascular isquémico y la demencia vascular: un estudio de aleatorización mendeliana

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo reproducible de aleatorización mendeliana de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre accidente cerebrovascular isquémico y demencia vascular utilizando estadísticas resumidas de estudios de asociación del genoma completo disponibles públicamente.

Resumen

El accidente cerebrovascular isquémico (ACI) es una causa importante de discapacidad y mortalidad a nivel mundial, y la demencia vascular (DVa) es un subtipo común de demencia asociado a lesión cerebrovascular. Estudios observacionales han sugerido una relación entre el ACI y la DVa, pero estos estudios son vulnerables a factores de confusión y causalidad inversa. Este protocolo describe un flujo de trabajo reproducible de aleatorización mendeliana (AM) de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre el ACI y la DVa, utilizando estadísticas resumidas de estudios de asociación del genoma completo (GWAS) disponibles públicamente. Los instrumentos genéticos asociados con el ACI se extrajeron de un conjunto de datos GWAS público, y las asociaciones del resultado para la DVa se obtuvieron de un conjunto de datos GWAS público sobre DVa. Los identificadores correspondientes de los conjuntos de datos se proporcionan en la sección de Protocolo. Tras la coincidencia de resultados y la armonización de alelos, se conservaron 51 polimorfismos de nucleótido único (SNPs) para el análisis final de AM. El flujo de trabajo incluye selección de variables instrumentales, agrupamiento por desequilibrio de ligamiento, armonización de alelos, evaluación de la fuerza del instrumento, análisis ponderado por varianza inversa (IVW), análisis de mediana ponderada, análisis MR-Egger, prueba de heterogeneidad, evaluación de pleiotropía horizontal y análisis de sensibilidad de tipo leave-one-out. En el análisis representativo, el método IVW mostró una asociación positiva entre el ACI predicho genéticamente y el riesgo de DVa, y el método de mediana ponderada arrojó un resultado con dirección concordante. La estimación de MR-Egger fue direccionalmente consistente, pero no alcanzó significación estadística. Por lo tanto, estos hallazgos deben interpretarse como evidencia sugestiva de un posible efecto causal, más que como prueba definitiva de causalidad. Este protocolo puede ayudar a los investigadores a aplicar un flujo de trabajo de AM transparente y reproducible para investigar resultados relacionados con enfermedades cerebrovasculares utilizando datos GWAS públicos.

Introducción

El accidente cerebrovascular isquémico (ACV) es una de las principales causas de discapacidad grave y muerte en todo el mundo¹. Según los datos más recientes del Estudio de la Carga Global de Enfermedades, la incidencia mundial de ACV ha disminuido, pero sigue siendo una carga significativa, especialmente en Europa del Este, Asia Oriental, Asia Central y África subsahariana^2,3. Además, la incidencia de ACV está en aumento en países con un índice sociodemográfico (SDI) bajo, y se proyecta que continúe aumentando desde 2020 hasta 2030.

Numerosos estudios epidemiológicos han sugerido una posible asociación entre las enfermedades cerebrovasculares y la demencia vascular (DVC)^4,5. Especialmente en China, la DVC es uno de los tipos más comunes de demencia entre las personas mayores, y la alta prevalencia del ACV está estrechamente relacionada con el inicio de la DVC. Sin embargo, la mayoría de los estudios existentes son observacionales, y los factores de confusión residuales, la causalidad inversa y las diferencias en la definición de la enfermedad pueden limitar la interpretación causal. Por lo tanto, se necesitan enfoques analíticos adicionales para evaluar si el ACV podría estar involucrado en el desarrollo de la DVC.

El ACV puede influir en el inicio de la Demencia Vascular a través de varios mecanismos. El daño cerebrovascular causado por el ACV puede provocar una perfusión cerebral insuficiente y cambios neurodegenerativos posteriores⁶. Además, la Demencia Vascular puede estar relacionada con lesiones cerebrovasculares crónicas, daño microvascular y respuestas inflamatorias tras un ACV^7,8. Por lo tanto, investigar la relación entre el ACV y la Demencia Vascular es importante para comprender posibles vínculos entre enfermedades y orientar estrategias futuras de prevención.

La aleatorización mendeliana (MR) es un método analítico que utiliza variantes genéticas como variables instrumentales para evaluar posibles asociaciones causales entre una exposición y un resultado⁹. En comparación con estudios observacionales convencionales, la MR puede reducir los sesgos por confusión y causalidad inversa bajo supuestos válidos de variables instrumentales. En comparación con ensayos controlados aleatorizados o modelos experimentales, la MR puede utilizar estadísticas resumidas de estudios de asociación del genoma completo (GWAS) ya existentes para evaluar asociaciones clínicamente relevantes cuando los estudios de intervención directa son inviables, poco éticos o difíciles de realizar. Estudios genéticos recientes que emplean enfoques de aleatorización mendeliana han investigado la asociación entre ACV y DEM¹⁰. Sin embargo, descripciones detalladas a nivel de protocolo sobre la selección de instrumentos de exposición, extracción de datos del resultado, armonización de alelos, evaluación de la fuerza del instrumento, pruebas de heterogeneidad, evaluación de pleiotropía y análisis de sensibilidad siguen siendo fundamentales para una implementación reproducible.

Este protocolo es apropiado cuando existen estadísticas resumidas de GWAS públicamente disponibles tanto para la exposición como para el resultado de interés, se pueden seleccionar instrumentos genéticos válidos para la exposición, y la pregunta de investigación tiene como objetivo evaluar una posible asociación causal en lugar de establecer directamente mecanismos biológicos. Este estudio presenta por tanto un protocolo de MR de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre IS y VaD utilizando estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente. El objetivo es proporcionar un flujo de trabajo analítico reproducible, en lugar de establecer mecanismos biológicos definitivos. Este protocolo describe la selección de instrumentos genéticos, la coincidencia de resultados, la armonización de alelos, la estimación de MR y los análisis de sensibilidad, y utiliza la asociación entre IS y VaD como ejemplo representativo.

Protocolo

Este estudio utilizó estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente. Los estudios originales habían obtenido la aprobación del comité de ética y el consentimiento informado de los participantes. No se requirió ninguna aprobación ética adicional para este análisis secundario.

1. Diseño del estudio y declaración de ética

1. Utilice un diseño de RM de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre el ACV y la DEM.
2. Utilice únicamente estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente. Dado que todos los estudios originales incluidos en los conjuntos de datos de GWAS obtuvieron la aprobación del comité de revisión institucional y el consentimiento informado de los participantes, no se requiere ninguna aprobación ética adicional para este análisis secundario.
3. Defina el ACV como la exposición y la DEM como el resultado antes de la extracción de datos.

2. Preparación del software

1. Realice todos los análisis utilizando el software estadístico R.
2. Cargue el paquete TwoSampleMR para la extracción de instrumentos, extracción de datos de resultado, armonización de alelos, estimación de MR, pruebas de heterogeneidad y análisis de sensibilidad. Cargue el paquete MRPRESSO para evaluar la pleiotropía horizontal global y las variantes atípicas potenciales.
3. Utilice las siguientes funciones principales en el flujo de trabajo: extract_instruments, extract_outcome_data, harmonise_data, mr, generate_odds_ratios, mr_heterogeneity, mr_pleiotropy_test, mr_singlesnp, mr_leaveoneout, mr_scatter_plot, mr_forest_plot, mr_funnel_plot y mr_leaveoneout_plot. Utilice MRPRESSO::mr_presso para realizar la prueba global MR-PRESSO y, cuando corresponda, las pruebas de valores atípicos y distorsión.

3. Selección del conjunto de datos de exposición y cribado de variables instrumentales

1. Extraiga polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) asociados con el ACV del conjunto de datos IEU OpenGWAS ebi-a-GCST90018864. Este conjunto de datos incluye 11.929 casos de ACV y 472.192 controles, con un tamaño total de muestra de 484.121 participantes.
2. Seleccione SNPs candidatos asociados con el ACV utilizando un umbral de significancia de p < 5 × 10^-6.
   1. El umbral de p < 5 × 10^-6 se utiliza en este protocolo representativo para conservar un número adecuado de instrumentos independientes para los análisis de sensibilidad. Dado que este umbral es menos estricto que el umbral convencional de significancia a nivel del genoma, los hallazgos basados en estos instrumentos deben interpretarse como exploratorios y sugerentes, no definitivos.
3. Realice el agrupamiento por desequilibrio de ligamiento para conservar SNPs independientes. Utilice un umbral de r² de 0,001 y una ventana de agrupamiento de 10.000 kb.
4. Utilice el siguiente comando en R para extraer los instrumentos candidatos:
   extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE)
5. Calcule el estadístico F para cada SNP conservado utilizando la fórmula F = (β/SE)², donde β y SE son la estimación del efecto del SNP sobre la exposición y el error estándar, respectivamente.
6. Excluya los SNPs con un estadístico F < 10 para reducir el riesgo de sesgo por instrumentos débiles. Resuma la distribución de los estadísticos F utilizando el valor mínimo, máximo, mediano y el rango intercuartílico (IQR).

4. Extracción del conjunto de datos de resultados

1. Extraiga las asociaciones de resultados de DEMV a partir del conjunto de datos GWAS de FinnGen finn-b-F5_VASCDEM. Este conjunto de datos incluye 881 casos de DEMV y 211.508 controles.
2. Extraiga las asociaciones de resultados para todos los SNPs asociados a ACV seleccionados utilizando la función extract_outcome_data.
3. Busque SNPs proxy cuando los SNPs objetivo no estén directamente disponibles en el conjunto de datos de resultado. Mantenga las variantes emparejadas con proxy cuando haya información de proxy válida y correspondencia de alelos disponible.
4. Utilice el siguiente comando de R para extraer el conjunto de datos de resultado:
   extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)

5. Armonización de alelos y retención de SNP

1. Harmonice los conjuntos de datos de exposición y resultado antes del análisis de MR.
2. Alinee el alelo de efecto y el otro alelo de modo que las estimaciones del efecto del SNP–exposición y del SNP–resultado correspondan al mismo alelo de efecto.
3. Revise los SNPs durante la harmonización para identificar desajustes alélicos, asociaciones de resultado no disponibles y alineaciones alélicas ambiguas. Mantenga los SNPs con estimaciones de efecto disponibles para exposición y resultado tras la harmonización.
4. Utilice el siguiente comando en R para la harmonización alélica: harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
5. Registre el número de SNPs extraídos inicialmente del conjunto de datos de exposición, el número de SNPs con asociaciones de resultado disponibles, el número de variantes emparejadas por proxy y el número de SNPs mantenidos para el análisis final de MR.

6. Análisis principal de MR y análisis de sensibilidad

1. Realice el análisis principal de MR utilizando el método ponderado por la inversa de la varianza (IVW, por sus siglas en inglés).
2. Realice análisis complementarios de MR utilizando los métodos de mediana ponderada y MR-Egger para evaluar la consistencia de la estimación causal bajo diferentes supuestos.
3. Genere odds ratios (OR) e intervalos de confianza del 95% (IC) a partir de las estimaciones de MR.
4. Utilice los siguientes comandos en R para ejecutar el análisis de MR y calcular los odds ratios:
   res <- mr(dat)
   res <- generate_odds_ratios(res)
5. Dado que se evalúa una única asociación prespecificada entre exposición y resultado, defina el umbral corregido por Bonferroni para la inferencia principal de MR como 0,05/1 = 0,05. Utilice un valor p bilateral < 0,05 como umbral de significancia estadística para el análisis principal IVW.
6. Para contextualizar la precisión estadística del análisis principal dada la limitada cantidad de casos de DEMV, realice un cálculo post hoc de potencia mediante la prueba de Wald bilateral basado en la estimación IVW observada y su error estándar. Calcule la potencia utilizando el parámetro de no centralidad βIVW/SEIVW a un nivel α bilateral de 0,05. Calcule el efecto mínimo detectable correspondiente a una potencia del 80% como exp[(z0,975 + z0,80) × SE]. Dado que el ACV es una exposición binaria y las asociaciones entre SNP y exposición se expresan en escala logarítmica de odds, presente este análisis como una evaluación descriptiva condicionada al efecto sobre la precisión, en lugar de como un cálculo prespecificado del tamaño de la muestra¹¹.

7. Análisis de heterogeneidad, pleiotropía horizontal y de exclusión uno por uno

1. Evalúe la heterogeneidad entre SNP utilizando el estadístico Q de Cochran.
2. Utilice el siguiente comando en R para calcular las estadísticas de heterogeneidad:
   mr_heterogeneity(dat)
3. Evalúe la pleiotropía horizontal direccional mediante la prueba del intercepto de MR-Egger.
4. Utilice el siguiente comando en R para calcular el intercepto de MR-Egger:
   mr_pleiotropy_test(dat)
5. Evalúe la pleiotropía horizontal global y las variantes atípicas potenciales utilizando MR-PRESSO con 10.000 simulaciones, un umbral de significancia de 0,05 y habilitando ambas pruebas: de valores atípicos y de distorsión¹².
6. Utilice el siguiente comando en R para el análisis con MR-PRESSO:
   set.seed(20260729)
   mr_presso(
   BetaOutcome = "beta.outcome",
   BetaExposure = "beta.exposure",
   SdOutcome = "se.outcome",
   SdExposure = "se.exposure",
   OUTLIERtest = TRUE,
   DISTORTIONtest = TRUE,
   data = dat,
   NbDistribution = 10000,
   SignifThreshold = 0.05
   )
7. Realice un análisis de un solo SNP para estimar el efecto de cada SNP por separado.
8. Utilice el siguiente comando en R para el análisis de un solo SNP:
   res_single <- mr_singlesnp(dat)
9. Realice un análisis de exclusión secuencial eliminando un SNP a la vez y repitiendo el análisis IVW.
10. Utilice el siguiente comando en R para el análisis de exclusión secuencial:
    res_loo <- mr_leaveoneout(dat)

8. Visualización y resultados

1. Genere un gráfico de dispersión para mostrar las estimaciones de MR mediante diferentes métodos.
2. Genere un gráfico de bosque para mostrar las estimaciones individuales de cada SNP y la estimación global de MR.
3. Genere un gráfico en embudo para evaluar visualmente la simetría de las estimaciones específicas de cada SNP.
4. Genere un gráfico de exclusión individual (leave-one-out) para evaluar si la estimación global está determinada por un solo SNP.
5. Utilice los siguientes comandos de R para generar los gráficos:
   mr_scatter_plot(res, dat)
   mr_forest_plot(res_single)
   mr_funnel_plot(res_single)
   mr_leaveoneout_plot(res_loo)
6. Exporte los resultados de MR, la tabla de variables instrumentales, la tabla de asociación del resultado y los resultados del análisis de sensibilidad para su presentación y reproducibilidad.

Resultados

Figura 1 resume el flujo de trabajo general del protocolo de aleatorización mendeliana de dos muestras, desde la selección de conjuntos de datos y el cribado de instrumentos hasta los análisis de sensibilidad y la visualización de resultados. A continuación se presentan salidas representativas de cada etapa.

Variables instrumentales genéticas y control de calidad de la armonización

Inicialmente se extra...

Discusión

Este estudio presenta un protocolo de MR de dos muestras para evaluar la posible asociación causal entre el ACV y la Demencia Vascular utilizando estadísticas resumidas de GWAS disponibles públicamente. En el análisis representativo, los métodos IVW y mediana ponderada respaldaron una asociación positiva entre el ACV predicho genéticamente y el riesgo de Demencia Vascular, mientras que la estimación MR-Egger fue direccionalmente consistente pero no alcanzó significancia estadística. Por lo tanto, estos hallazgos proporci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Conjunto de datos GWAS de FinnGen	FinnGen	finn-b-F5_VASCDEM	Conjunto de datos GWAS público utilizado como fuente del resultado para la demencia vascular
Base de datos IEU OpenGWAS	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	ebi-a-GCST90018864	Conjunto de datos GWAS público utilizado como fuente de exposición para el accidente cerebrovascular isquémico
Software R	R Foundation for Statistical Computing	No aplicable	Software estadístico utilizado para el análisis de MR
RStudio	Posit Software, PBC	No aplicable	Entorno de desarrollo integrado utilizado para ejecutar scripts de R
Paquete TwoSampleMR	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	No aplicable	Paquete de R utilizado para la extracción de instrumentos, armonización, análisis de MR y análisis de sensibilidad
Paquete MRPRESSO	CRAN	Versión 1.0	Paquete de R utilizado para evaluar la pleiotropía horizontal global y los posibles instrumentos atípicos
Paquete writexl	CRAN	No aplicable	Paquete de R utilizado para exportar tablas de resultados como archivos xlsx