Ensayo reproducible de migración de glioblastoma 3D con localización esferoide mediada por nanopartículas magnéticas bajo condiciones hipóxicas

Resumen

Presentamos un modelo de migración de glioblastoma 3D utilizando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes generadas a partir de tumores recién diagnosticados y recurrentes. Esta plataforma permite visualizar la dinámica migratoria específica del paciente y evaluar la eficacia terapéutica. El ensayo puede multiplexarse tras la migración para evaluar la localización y los patrones de expresión de proteínas.

Resumen

Describimos un ensayo reproducible de migración 3D para modelar el potencial migratorio e invasivo de glioblastomas de origen de pacientes a partir de tumores recién diagnosticados y recurrentes bajo condiciones hipóxicas clínicamente relevantes. Las gliomasferas de tamaño uniforme se transfieren a una fina capa de matriz extracelular y se cocultivan con nanopartículas magnéticas de óxido de hierro, lo que permite su localización centralizada dentro de pozos de cultivo mediante la colocación sobre un soporte de placa magnética. La inclusión de nanopartículas magnéticas de óxido de hierro en la siembra facilita una imagen precisa y localizada de gliomasferas derivadas de pacientes individuales mediante una fuerza magnética suave y optimiza las canaletas automatizadas de procesamiento de imágenes al reducir la variabilidad posicional. Este ensayo apoya el estudio detallado del comportamiento migratorio del glioblastoma en un microambiente fisiológicamente relevante y permite la comparación directa del potencial invasivo y del comportamiento migratorio entre gliomasferas recién diagnosticadas y derivadas de pacientes recurrentes. El método es compatible con la imagen de células vivas y el análisis multiplexado, ofreciendo una plataforma escalable para la investigación preclínica de la migración de glioblastomas, el potencial invasivo y la respuesta terapéutica.

Introducción

El glioblastoma sigue siendo uno de los desafíos más significativos en la neurooncología. Esta enfermedad está impulsada por una amplia heterogeneidad entre y dentro del paciente, una fuerte evasión de la respuesta al estándar de atención, resistencia a la inducción apoptótica y una notable plasticidad en respuesta a condiciones^ambientales. Más recientemente, la complejidad del microambiente tumoral (TME) ha recibido considerable atención, especialmente la naturaleza dinámica de las células madre tipo glioma (GSC), que pueden cambiar el fenotipo y el estado celular en respuesta a cambios^{microambientales 2,3}. Esta plasticidad fenotípica favorece la progresión tumoral y contribuye a la recurrencia inevitable a pesar del tratamiento agresivo de primera línea. La resección quirúrgica sigue siendo la intervención más eficaz para mejorar el pronóstico del paciente; sin embargo, debido a la naturaleza altamente infiltrativa e invasiva microscópica del glioblastoma, la extirpación completa del tumor no es posible⁴. Modelar la dinámica invasiva de muestras de pacientes a lo largo de las distintas fases de la enfermedad y en condiciones específicas de tumores facilitará una comprensión más profunda de la capacidad dinámica y plástica de la migración del glioblastoma y, por tanto, ayudará a identificar enfoques terapéuticos novedosos y^{eficaces 5}. Por lo tanto, desarrollar modelos fisiológicamente relevantes que capturen la dinámica específica de invasión y migración de los pacientes es esencial para mejorar la investigación preclínica y avanzar en estos objetivos. Además, estos modelos son fundamentales para evaluar la eficacia de nuevas terapias antitumorales, que en teoría podrían desarrollarse para su uso en combinación con cirugía para prevenir la invasión microscópica residual y, en última instancia, reducir el riesgo de recurrencia. La complejidad del glioblastoma justifica la necesidad de modelos preclínicos complejos avanzados que puedan recapitular características arquitectónicas clave del tumor. Los modelos tridimensionales derivados del paciente han ganado mayor atención por su capacidad para preservar las interacciones célula a célula, mantener gradientes de nutrientes, oxígeno y agentes terapéuticos, y replicar la integridad estructural de los tumores^{nativos 6,7}. Sin embargo, visualizar estos modelos 3D presenta desafíos técnicos, como la posición de los esferoides, la variabilidad de la imagen y la reproducibilidad del ensayo.

Aquí describimos un modelo de migración 3D específico del paciente para glioblastomas realizado en condiciones hipóxicas, lo que permite investigar la dinámica migratoria entre muestras derivadas de varios subtipos tumorales y estadios de la enfermedad del paciente, incluyendo muestras tumorales ingenuas y recurrentes en el tratamiento. Esta plataforma permite la evaluación de respuestas diferenciales a agentes terapéuticos y soporta el análisis multiplex post-migración mediante segmentación de imágenes, permitiendo la evaluación cuantitativa de la dinámica migratoria, el crecimiento esferoide y la expresión proteica. La incorporación de nanopartículas magnéticas de óxido de hierro permite una centralización consistente de los esferoides dentro de cada pozo aplicando una fuerza magnética^{suave 8}. Los esferoides cultivados en placas estándar de varios pozos suelen mostrar una tendencia a desplazarse hacia los bordes del pozo, un comportamiento que se cree está influenciado por la formación de meniscos líquidos y la evaporación periférica, especialmente en pozos en el perímetro de la placa ^9,10,11. Estos fenómenos introducen artefactos de imagen y ruido de fondo, especialmente durante la microscopía de luz transmitida, lo que puede complicar la imagen en lapso de tiempo de la dinámica de invasión. A diferencia de los cultivos monocapa 2D, donde se pueden seleccionar regiones de densidad celular uniforme para la imagen, los ensayos de invasión de esferoides únicos requieren una posición precisa y consistente de toda la zona esferoide y de migración dentro del campo de imagen. Esto añade un desafío adicional, ya que la deriva o la posición irregular dentro del pozo pueden comprometer la calidad y la reproducibilidad de los datos. Por lo tanto, centralizar consistentemente los esferoides dentro de placas multipozo minimiza estos desafíos y mejora no solo la calidad de la imagen, sino también la consistencia experimental, las canalizaciones de procesamiento de imagen y los análisis posteriores a la migración. Además, iniciar cultivos esferoides con densidades celulares uniformes en estas placas especializadas de cultivo esferoides favorece la formación de esferoides reproducibles, reduciendo la variabilidad en morfología, tasa de crecimiento e integridad^{estructural 10,11}. En términos prácticos, las gliomasferas típicas utilizadas en estos ensayos tienen un diámetro de entre 150 y 300 μm, formándose de forma reproducible bajo densidades celulares estandarizadas. Los cultivos se mantienen bajo condiciones hipóxicas (1%–2%_O2).

La plataforma descrita aquí soporta formatos de rendimiento moderado a alto, como placas de 96 pozos, que permiten múltiples réplicas por muestra de paciente, y es escalable para cribado de fármacos o ensayos multiacondicionales¹² . Por tanto, optimizar la posición de los esferoides y las condiciones de cultivo es esencial para mejorar la robustez y relevancia clínica de los modelos preclínicos 3D utilizados para estudiar el potencial invasivo de gliomas y otros procesos celulares dinámicos.

Protocolo

Las células de glioblastoma derivadas del paciente fueron proporcionadas por Erasmus MC, Róterdam, Países Bajos, y el Hospital for Sick Children (Toronto, Canadá). Las muestras primarias de origen para estas líneas se obtuvieron como parte de resecciones rutinarias de pacientes bajo su consentimiento informado (números de aprobación ética, MEC-2013-090, 0020010404).

1. Preparación de gliomasferas magnéticas derivadas del paciente (Figura 1)

1. Al menos 30 minutos antes de la disociación de la gliomasfera, se proporciona suficiente medio enzimático de desprendimiento celular y medio de gliomasfera para el experimento (típicamente 1 mL por matraz T75 confluente) y lleva ambos a temperatura ambiente.
2. En condiciones estériles, recoge gliomasferas del matraz de cultivo mediante una suave aspiración utilizando una pipeta serológica y una ayuda de pipeta de 10 mL y transfierelas a un tubo cónico de 15 mL. Centrifuga a 300 x g durante 3 minutos. Desecha cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la pastilla celular.
3. Resuspende el pellet en 1 mL de medio enzimático de desprendimiento celular a temperatura ambiente e incuba durante 10–15 minutos, agitando suavemente cada 2-3 minutos pipeteando con una pipeta P1000 para facilitar la disociación en una suspensión unicelular.
4. Añade un volumen igual de medio de gliomasfera para desactivar la enzima. Centrifugar la suspensión de célula única a 300 x g durante 3 minutos a 37 °C, luego resuspender suavemente el pellet celular en 3–5 mL de medio completo de gliomasfera, dependiendo del tamaño del pellet celular, observando el volumen exacto utilizado para el conteo celular posterior.
   NOTA: El tiempo de incubación del medio enzimático dependerá en gran medida del tamaño de las gliomasferas en cultivo; inspecciona siempre visualmente antes de usarlos y adótalo en consecuencia.
5. Toma una alícua representativa de 10 μL de la suspensión monocelular y mézclala suavemente con 10 μL de azul de tripán en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Carga 10 μL de esta mezcla en un hemocitómetro o en un contador automático de células para determinar células viables.
6. Sembrar 500 células de glioblastoma individual por pozo en una microplaca esferoide de 96 pozos de adhesión ultra baja. La densidad óptima de siembra puede variar entre muestras de pacientes.
7. Añade 1 μg/mL de yoduro de propidio (PI) y 0,05 μL de nanopartículas de óxido de hierro por pozo (por ejemplo, utiliza 1,5 μL de nanopartículas magnéticas para 20 esferoides, lo que corresponde a aproximadamente 10.000 células individuales). Asegúrese de que las nanopartículas de óxido de hierro estén homogeneizadas antes de la adición pipeteando hacia arriba y hacia abajo con un P100 ajustado a 100 μL.
   NOTA: El volumen de nanopartículas de óxido de hierro utilizadas puede optimizarse según la línea celular utilizada; sin embargo, en este caso, 1,5 μL por cada 10.000 células fue suficiente para localizar centralmente los esferoides. Esta configuración garantiza un tamaño esferoide consistente entre muestras de pacientes, facilitando la comparación directa de la dinámica de invasión y crecimiento durante el ensayo de invasión.
8. Incubar placas durante 48 horas en una incubadora de cultivos celulares humidificados a 37 °C, 5% de_CO2 y 21% de_O2 para permitir la formación de la gliomasfera.

Figura 1: Gliomasferas de tamaño uniforme y localización co-cultivadas con nanopartículas de óxido de hierro. (A) Las gliomasferas derivadas de tumores recién diagnosticados y recurrentes en pacientes presentan fenotipos duales y asociaciones aleatorias de célula a célula. (B) Representación esquemática de la formación de esferoides de tamaño uniforme dentro de las 48 horas posteriores a la siembra. (C) Imágenes de luz transmitida de gliomasferas cultivadas durante 48 horas en microplacas esferoides con fondo redondeado sin (panel superior) y con nanopartículas de óxido de hierro (panel inferior). Observa el aspecto oscuro y moteado de gliomasferas que contienen nanopartículas de óxido de hierro. (D) Posicionamiento de la gliomasfera mostrando localización aleatoria de gliomasferas cultivadas sin nanopartículas (arriba) en comparación con una localización central consistente de aquellas cultivadas con nanopartículas (abajo), lo que resulta en una reducción del ruido de fondo y una mejor calidad de imagen. Barra de escala = 100 μm. Esquema hecho con Biorender.com. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Preparación de placas multipozo recubiertas con matriz extracelular (ECM) (1 hora antes del ensayo de migración)

1. Alúcilate y guarda el ECM según las instrucciones del fabricante. Descongela una cuota de 1 mL de ECM (dilución 1:10) lentamente sobre hielo durante la noche a 4 °C. Inmediatamente antes del emplatado, se prepara una solución de trabajo final a 1:100 (v/v) realizando una dilución adicional 1:10 del material 1:10 en un medio de neurosfera completo helado. Mantén el ECM diluido en hielo en todo momento para evitar una polimerización prematura. Siempre mantén esta dilución sobre hielo, ya que la ECM polimerizará rápidamente a temperatura ambiente.
2. Dispensar 50 μL de la solución de trabajo ECM 1:100 en cada pozo de una placa de 96 pozos, de fondo plano o fondo μClear. Incubar la placa a 37 °C durante al menos 1 hora para permitir que la ECM se asiente y forme una matriz delgada en cada pozo.
3. Tras la incubación, se retiran cuidadosamente 30 μL de cada pozo, dejando 20 μL de ECM polimerizado (concentración final 1:100 v/v) recubriendo el fondo de cada pozo. La ECM debe mantenerse lo más fría posible durante este tiempo, ya que se polimeriza rápidamente a temperatura ambiente. La placa de imagen también puede preenfriarse y almacenarse en hielo durante este proceso.
    

3. Montaje de placas de imagen e imagen de células vivas

1. El día del ensayo (48 h después de la siembra en la gliomasfera) coloque la microplaca recubierta de ECM sobre un accionamiento magnético de placa de 96 pozos, como se muestra en la Figura 2B,C. Esteriliza la placa magnética rociando con etanol al 70% y limpiando seca, no la remojes.
2. Inspecciona visualmente los esferoides para comprobar su calidad y uniformidad. Utilizando una pipeta, transfiere 80 μL de medio que contenga la gliomasfera individual de cada pozo y pipetea suavemente sobre la placa con la superficie de la ECM.
   NOTA: Para esferoides particularmente grandes, hay cuidado de minimizar el esfuerzo cortante durante la transferencia; esto se puede lograr cortando 1-2 mm de la punta de una pipeta P100 con tijeras para ensanchar la abertura y reducir daños mecánicos. Asegúrate de que las tijeras hayan sido esterilizadas bajo rayos UV antes de usarlas. Lo más importante es minimizar la adición de burbujas de aire, ya que esto tiene un gran impacto en la imagen.
3. Trata a los esferoides según el diseño experimental. Preparar las soluciones de tratamiento a las concentraciones deseadas en volúmenes de 20 μL, luego añadir estos 20 μL a cada pozo que contenga los esferoides para alcanzar un volumen final de 100 μL.
   NOTA: Tratar las gliomasferas de esta manera reduce la pipeación y minimiza el riesgo de extraer los esferoides del pozo.
4. Transfiere la placa, permaneciendo en el accionamiento magnético, al sistema de imagen para la imagen en directo. Ten cuidado al retirar la placa del soporte magnético y mantén la recta más recta posible para minimizar el movimiento de los esferoides desde el centro del pozo.
5. Realizar imágenes en vivo utilizando un microscopio programable de célula invertida equipado con un objetivo Plan-Apochromat 5x/0,35 NA, un objetivo de tubo 0,5x, una cámara Axiocam 506 (binning = 2) y utilizando el software Zen 3.1 (Edición Azul). La calibración píxel-micrón está integrada en el sistema de imagen y es gestionada automáticamente por el software, por lo que no se requiere calibración manual. En este caso, realiza imágenes a una ampliación de 2,5x (objetivo 5x con un objetivo tubular de 0,5x), con la cámara agrupada a 2 x 2, resultando en una calibración de 1 píxel = 3,645 μm.
6. Ajusta los controles ambientales para que haya un 1% de oxígeno y un 5% de_CO2 con un flujo de aire muy lento desde el mezclador de gas. Esto ayuda a evitar la evaporación no deseada cuando el aire entrante pasa por una botella humidificadora.
7. Para evitar el desplazamiento de la gliomasfera durante el periodo inicial de imagen, reducir la aceleración y velocidad de la etapa del microscopio al 10%, minimizando el movimiento sobre la superficie de la ECM antes de la adhesión esferoide.
8. Carga suavemente la placa multipozo sin accionamiento magnético en el microscopio. Si procede, asegúrate de que el material de la placa esté seleccionado en el software para que la óptica se ajuste a la medida.
9. Utiliza una magnificación adecuada que abarque todo el campo visual invasivo. Por ejemplo, en Cell Discoverer 7 se seleccionaron el objetivo 5x y el objetivo de tubo 0,5x para obtener un aumento de 2,5x.
10. Localiza cada gliomasfera, enfoca y asigna una posición que incluya las coordenadas x-y-z. El enfoque automático por hardware, si está disponible, debe utilizarse para asegurar una imagen consistente del mismo plano focal durante todo el experimento.
11. Comprueba tanto el contraste del gradiente de fase (luz transmitida) como el canal de fluorescencia y ajusta el tiempo de exposición y la intensidad de la luz para asegurarte de que no hay sobreexposición. Excita yoduro propidio (tinción de células muertas) usando un LED de 590 nm. Recoge la emisión usando un filtro pasa banda cuádruple, capturando la banda de longitud de onda de 618–756 nm. Esto puede variar en otros microscopios, dependiendo de los filtros y la fuente de luz presentes.
12. Configura para tomar imágenes cada hora durante el número de días deseado.

Figura 2: Descripción del montaje de la placa de imagen. (A) Diagrama esquemático que representa el protocolo descrito. (B) Imagen de la placa multipozo adyacente a la transmisión de placa magnética y montaje sencillo de la placa multipozo sobre la unidad magnética, con cada imán individual localizado en el centro de cada pozo, facilitando la localización de la gliomasfera. Esquema hecho con Biorender.com. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Fijación de esferoides tras el ensayo de invasión para análisis de proteínas multiplexadas (Figura 3)

1. Tras completar el ensayo de invasión, lavar cada pozo con 100 μL de PBS. Esto elevará el volumen a 200 μL/pozo. Repita este paso eliminando posteriormente 100 μL de PBS y reemplazándolo por 100 μL adicionales de PBS.
2. Retira cuidadosamente 200 μL de medio, luego añade 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% en cada pozo e incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo una campana extractora.
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un químico tóxico, y se debe tener precaución para minimizar el riesgo o la exposición.
3. Después de la fijación, retira el PFA de cada pozo y lava 3 veces con PBS retirando el PFA y añadiendo 100 mL de PBS cada vez.
4. Añade manchas inmunitarias según las instrucciones del fabricante. Alternativamente, para almacenamiento a largo plazo, añadir azida de sodio (0,02%) al PBS para mantener la esterilidad y sellar la placa con una película transparente. Guárdalos a 4 °C hasta que sea necesario.

Figura 3: Análisis representativo de proteínas tras el ensayo de migración de gliomasferas situadas en el centro frente al borde del pozo. Microscopía confocal de escaneo láser de gliomasferas recurrentes inmunotinzadas con un anticuerpo dirigido al marcador de células madre CD44 del glioblastoma tras el ensayo de migración. CD44-FITC (verde) y Hoechst (núcleos, azul). Barra de escala = 100 μm. Las puntas de flecha indican el borde del pozo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

5. Pipeline de procesamiento de imágenes de la dinámica de migración derivada del paciente

NOTA: Por experiencia con nuestro conjunto de datos, recomendamos que el ordenador de procesamiento tenga un procesador multinúcleo con una alta frecuencia base de núcleos y una cantidad considerable de memoria, ya que el procesamiento WEKA se adapta mucho a un alto número de núcleos y aprovechará la memoria disponible según el tamaño del conjunto de datos.  Especificación usada y recomendada según se indica a continuación.  Ten en cuenta que este flujo de trabajo no utiliza el procesamiento por GPU.
CPU: >= 6 núcleos | >= 2 GHz (recomendado); 32 núcleos | 2,1 GHz (usado)
Memoria: > 32 GB (recomendado); 192 GB (usados)

1. Open Fiji¹³ [actualmente se utiliza el ejecutable ImageJ-win64.exe incluido para el análisis]. Abrir imagen navegando a – Archivo > Abrir Seleccionar archivo de imagen multicanal y multiescena (.czi) se abre en la Interfaz Fiji (si se usa el script, este es el Archivo Suplementario 1).
2. Selecciona las imágenes necesarias en la interfaz gráfica. Funciona mejor si las gliomasferas más invasivas del experimento entrenan inicialmente al clasificador (es decir, bien de control – DMSO), ya que esta imagen proporcionará detalles sobre cada segmento de la imagen, es decir, la apariencia de células invasoras/migratorias frente a esferoides frente a fondo.
3. Luego navega a Imagen > Color > Canales Divididos : esto separa la imagen en dos canales: uno en este caso con tinción de yoduro de propidio y otro con luz transmitida.
4. Selecciona el canal para la segmentación; en este caso, el canal de luz transmitida que representa la dinámica de migración. Navega a Plugins > Segmentación > Segmentación WEKA 14 entrenable.
5. Renombrar las dos clases predeterminadas como: Clase 1: Gliomasfera; Clase 2: Invasión/Migración. Añade una tercera clase llamada Fondo (opcional pero recomendable) navegando a Ajustes > Nueva clase > Trasfondo.
6. Usando la herramienta Freeline, anota regiones de entrenamiento dentro de cada pila de imágenes y clase dibujando en las regiones representativas, es decir, dibuja un remolino en el esferoide y haz clic en Añadir al esferoide , repite esto para el área de invasión y el fondo hasta que todas las regiones estén representadas en cada clase. Entrena el clasificador haciendo clic en Clasificador de trenes. Se pueden anotar imágenes adicionales para entrenar aún más al clasificador y mejorar la precisión si es necesario.
7. Cuando esté satisfecho, guarda el modelo de clasificador entrenado usando un nombre de archivo como CellLine_Treatment_Classifier.model. Cierra la ventana de segmentación cuando termine.
8. Para nuevas imágenes que usan este clasificador guardado, ve a Plugins > Segmentation > Trainable WEKA segmentation >Load Classifier> Open Saved Classifier CellLine_Treatment_Classifier (esto guarda un archivo .model . Es un requisito para que el Archivo Suplementario 2 tenga esto preparado antes de ejecutar el script. Cuando se inicia el script, debe seleccionarse el archivo de ejemplo adecuado).
9. Navegar para obtener probabilidad en la interfaz de segmentación WEKA Trainable - Esto produce mapas de probabilidad para cada clase seleccionada, es decir, Gliomasfera, Invasión/Migración, Fondo, indicando la probabilidad de que cada valor de píxel asignado a la imagen pertenezca a la clase o región específica de la imagen. Esto generará un archivo de 3 imágenes separadas de mapas de probabilidad (Gliomasfera, Invasión, Fondo) con un rango dinámico de 32 bits para cada imagen.
10. Selecciona el mapa de probabilidades correspondiente a Invasión/Migración. Navega a Imágenes > Hyperstacks > reducir la dimensionalidad. Selecciona Conservar fuente.
11. Desmarca los canales pero mantén los fotogramas; esto reduce el mapa a un solo canal con el tiempo; en este caso, el mapa de probabilidad de invasión. Selecciona el mapa de probabilidad correspondiente a la gliomasfera.
12. Repite los pasos 5.10-5.11. Ahora habrá dos mapas de probabilidad correspondientes a la imagen original transmitida de lapso de tiempo de luz para una escena del área de migración y del área esferoide. Guarda ambos con la siguiente convención de nombres de archivo: ImageName_Scene_Gliomasphere_ProbabilityMap y ImageName_Scene_Invasion_Probability Map en una carpeta correspondiente al experimento seleccionado, es decir, CellLine_Treatment.
13. Establece umbral para crear una máscara binaria: Ve a Imagen > Ajustar > umbral. Elige un método umbral (por ejemplo, Yen, Otsu). Mantén el método seleccionado igual en todas las imágenes procesadas.
14. Navega para analizar > establecer medidas. Selecciona las medidas deseadas; Área de marca, densidad integrada y media, luego pulsa Ok. Navega para analizar > analizar partículas. Para Invasión/Migración, tamaño del conjunto: 0 – infinito; circularidad: 0,00 – 1,00. Para gliomasferas, tamaño de conjunto: típicamente, 1500 – infinito (ajusta según sea necesario según el tamaño de la esferoide en la línea celular/tratamiento - las esferas de control crecerán naturalmente); circularidad: 0,05 – 1,00. Selecciona unidades de píxeles para todas.
15. Navegar a Analizar>Analizar Píxeles> Mostrar: Seleccionar Máscaras. Después de generar las máscaras, verifica el área segmentada de interés a lo largo de toda la pila de timelapse para asegurar un seguimiento preciso. Aplicar operaciones binarias mediante Proceso > Binario > ... (por ejemplo, seleccionando Agujeros de Relleno al refinar la máscara esferoide), seguido de navegar hasta Analizar > Analizar Partículas > Mostrar > Seleccionar Nada y seleccionar Resumir. Esto proporcionará una ventana resumen de las mediciones seleccionadas.
16. Guarda los resultados haciendo clic en Archivo > Guardar como > Resultados. Guarda como un archivo .csv. Ábrelo en hojas de cálculo u otro software de análisis.
17. Repite el umbral y el análisis de partículas para todas las clases segmentadas (por ejemplo, gliomasferas, invasión) para extraer las mediciones respectivas a lo largo del tiempo.  La .csv de salida proporciona área (en píxeles o micras según la calibración) a lo largo del tiempo.
18. Selecciona el canal de fluorescencia que representa la tinción PI (por ejemplo, canal 2).  Aplica el umbral y el análisis de partículas como se ha mencionado anteriormente para identificar células muertas. Utiliza el plugin Calculator Plus para multiplicar las máscaras de células PI-positivas con la máscara de gliomasfera y por separado con las máscaras de invasión para cuantificar las células muertas de las regiones específicas.
19. Exportar máscaras, mapas de probabilidad y tablas resumen como archivos TIFF y CSV con nombres de archivo claros y descriptivos para documentación y análisis posteriores. Al utilizar el script proporcionado en el suplemento se puede encontrar la siguiente convención de nombres: por ejemplo, FileName_Scene#_(PI-)Invasion_Summary.csv (datos de objetos a lo largo del tiempo), FileName_Scene#_(PI-)Invasion.zip (regiones definidas con analizar partículas).
    NOTA: El Archivo Suplementario 1 generará archivos tif individuales con imágenes en timelapse para cada escena. El Archivo Suplementario 2 ejecutará la clasificación de píxeles WEKA basada en un archivo modelo de clasificación predefinido en todas las escenas y todas las imágenes de cada lapso de tiempo, proporcionando mapas de probabilidad para la Gliomasfera y también para las celdas invasoras. El Archivo Suplementario 3 segmentará todas las imágenes en gliomasferas y células invasoras, y cuantificará las áreas cubiertas, así como la partición de las áreas cubiertas por células muertas (PI-positivas). El Archivo Suplementario 4 para ejecutar asume un método umbral específico y también una región específica a analizar, mientras que el Archivo Suplementario 3 permite al usuario establecer el umbral y ajustar la región para cada escena. El umbral no debe cambiarse por métodos diferentes para cada escena, sino que puede establecerse con métodos diferentes para cada objeto.

Figura 4: Desafío del procesamiento de imágenes reproducibles debido a una mala segmentación de la gliomasfera. La canalización de procesamiento de imágenes usando el plugin de segmentación WEKA entrenable en Fiyi que muestra (A) gliomasfera localizada centralmente con mayor segmentación del área migratoria frente al fondo frente a la gliomasfera (B) localizada en el borde, resulta en una mala segmentación de imagen y una replicación inutilizable. Al garantizar la consistencia en la localización de la gliomasfera, el procesamiento de imágenes entre réplicas biológicas aparece como se muestra en (A), mejorando enormemente la reproducibilidad y automatización del ensayo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

Utilizando el ensayo de migración 3D descrito en condiciones hipóxicas, se trataron gliomasferas de tumores recurrentes de pacientes con vehículo o con el Fármaco X, y se monitorizó la dinámica de invasión cada h durante 72 horas. La Figura 5 describe el análisis de segmentación WEKA de la dinámica de invasión, revelando que el Fármaco X reduce significativamente el potencial invasivo de gliomasferas recurrentes en comparación con los controles de vehículos bajo condiciones hipóxicas clínicamente relevantes.

Para evaluar mejor el impacto del Fármaco X en las características de las células madre tras la migración, se fijaron e inmunotiñaron las gliomasferas para la expresión y localización del marcador de células madre del glioblastoma CD44, como se muestra en la Figura 6. Este análisis multiplexado facilita la visualización de la dinámica migratoria y la expresión de marcadores de células madre, proporcionando información sobre cómo el Fármaco X modula tanto el potencial invasivo como las propiedades similares a los tallos de modelos recurrentes de glioblastoma bajo condiciones hipóxicas clínicamente relevantes.

Figura 5: El ensayo de migración optimizado destaca la eficacia del nuevo Fármaco X para prevenir la migración recurrente de la gliomasfera. El paciente derivó gliomasferas recurrentes tratadas con vehículo o Fármaco X durante 72 horas en condiciones hipóxicas. Se capturaron dinámicas de invasión cada h durante 72 h. (A) Imágenes representativas transmitidas de la dinámica de la invasión a 0 h y 72 h en el panel superior - Vehículo tratado y panel inferior - Fármaco X tratado. (B) Mapas de probabilidad representativos del área de invasión utilizados en el análisis de segmentación. (C) Las gliomasferas recurrentes tratadas con el Fármaco X mostraron un potencial significativamente menos invasivo que las gliomasferas tratadas con vehículos. La cuantificación del área invasora a las 72 horas reveló una disminución significativa de la invasión en gliomasferas tratadas con el Fármaco X, representada como área total cubierta en el momento de la fijación. Los datos representan el área de invasión a lo largo del tiempo a partir de n=3 réplicas independientes. La significación estadística se evaluó mediante una prueba t sin pareja; p < 0,005 está indicado por **. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Migración y expresión de marcadores de células madre tras el tratamiento. Las gliomasferas descritas en la Figura 5 fueron fijadas tras la migración e inmunotinzadas usando un anticuerpo dirigido al marcador de células madre del glioblastoma CD44 tras el tratamiento con vehículo o con el fármaco X. Esta figura demuestra el tipo de análisis multiplexado post-migración que puede realizarse utilizando técnicas estándar de inmunotinción. Las imágenes muestran CD44-FITC (verde) y Hoechst (núcleos, azul). Barra de escala = 200 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Reguardando archivos CZI multiescena desde el microscopio como una sola escena como archivos TIF.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Generación de mapas de probabilidad usando un modelo de Weka.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Análisis de segmentación sin umbral. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 4: Análisis de segmentación con umbral. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Modelar la dinámica invasiva de tumores altamente agresivos como el glioblastoma es fundamental para mejorar nuestra comprensión de los procesos de la enfermedad e identificar estrategias de tratamiento más efectivas. La naturaleza compleja, adaptativa y plástica de la migración celular del glioblastoma requiere modelos preclínicos que puedan capturar con precisión los comportamientos dinámicos de las células gliomas individuales al migrar desde la masa tumoral central. Es importante destacar que modelar estos procesos en muestras derivadas de pacientes de diferentes estadios de la enfermedad permite a los investigadores abordar mejor el desafío de la heterogeneidad tumoral e identificar cualquier cambio específico en la dinámica de invasión.

Dada esta complejidad, es razonable suponer que los modelos preclínicos deberían poseer un nivel equivalente de sofisticación. Aquí describimos un método refinado para generar gliomasferas derivadas de pacientes de tamaño uniforme, cocultivadas con nanopartículas de óxido de hierro. Este enfoque permite la localización controlada de gliomasferas en el centro de cada pozo, facilitando la obtención automatizada de imágenes de células vivas de la dinámica de invasión. Varios estudios han destacado una variabilidad significativa en el tamaño, forma y cinética de crecimiento de los esferoides al utilizar métodos convencionales de cultivo 3D. Sayde y sus colegas demostraron que los esferoides pueden mostrar distribuciones de diámetro amplias entre los derivados de poblaciones de células madre cancerosas no clasificadas y las clasificadas, reflejando una variabilidad inherente en la formación de^{esferoides 15,16}. Esta heterogeneidad también ha sido identificada como una fuente importante de problemas de reproducibilidad en los ensayos de detección de fármacos basados en esferoides, lo que subraya aún más la importancia de generar poblaciones esferoides^{homogéneas 12}. Estos hallazgos subrayan la necesidad de estandarizar las condiciones de formación de esferoides antes de realizar análisis funcionales, desafíos que este método aborda directamente. Al estandarizar tanto el tamaño como la posición de los esferoides, este método mejora significativamente la reproducibilidad y minimiza la variabilidad típica de los sistemas de cultivo celular 3D, donde la formación desigual de esferoides puede afectar al análisis posterior.

Durante el desarrollo inicial de este ensayo, observamos una variabilidad sustancial en la localización de los esferoides entre réplicas, lo que requirió el uso de un gran número de pozos por experimento, pero también de muchas réplicas biológicas para obtener resultados estadísticamente significativos. Esto no solo aumentó sustancialmente la carga de trabajo, sino que también generó una cantidad significativa de datos inutilizables, redujo la eficiencia y reproducibilidad del ensayo. La variabilidad resultante reflejaba por tanto la pérdida de datos cuantificables más que diferencias en el comportamiento de invasión. Al centralizar las gliomasferas dentro de cada pozo, la localización magnética garantiza que las imágenes de todas las réplicas puedan segmentarse y analizarse de forma consistente, incluso cuando se observan diferencias biológicas en la dinámica de invasión entre muestras.

La incorporación de nanopartículas de óxido de hierro introduce una fuerza magnética suave que centraliza consistentemente las gliomasferas en todos los pozos, mejorando enormemente el rendimiento de la canalización de procesamiento de imágenes, el procesamiento de datos y los análisis posteriores a la migración, sin afectar la biología o la viabilidad de la^{gliomasfera 8}. Una ventaja clave de este sistema es su compatibilidad con el análisis multiplexado posterior a la migración; por ejemplo, la Figura 6 representa el análisis de la visualización del marcador de células madre CD44 del glioblastoma, lo que permite evaluar la expresión de células madre similares a la migración y el tratamiento entre muestras de pacientes. Esta capacidad destaca el potencial de la plataforma para estudios integrativos que vinculen fenotipos invasivos con características moleculares, una consideración importante dada la plasticidad fenotípica de las células madre similares a los glioblastomas en respuesta a señales microambientales y su capacidad para evadir el tratamiento, lo que favorece la inevitable recurrencia tumoral.

Aunque este ensayo mejora considerablemente la reproducibilidad de la visualización de la dinámica de invasión de esferoides individuales, siguen existiendo algunas limitaciones críticas que deben considerarse para la optimización futura del ensayo. Matrigel es un modelo ampliamente utilizado de membrana basal, sin embargo, es un sustituto complejo e indefinido de la matriz extracelular (ECM) derivado de sarcomas murinos, que no recapitula completamente el microambiente cerebral^{humano 17}. La optimización futura del ensayo podría incorporar modelos específicos de ECM cerebrales para imitar mejor el microambiente tumoral cerebral, que creemos es un paso de optimización imprescindible de los modelos de invasión cerebral in^{vitro 18,19}. Aunque Matrigel sigue siendo un modelo ampliamente adoptado de la MCE, representa una matriz extracelular no específica del cerebro derivada de un sarcoma murino. Por ello, no recapitula completamente las propiedades bioquímicas y mecánicas del microambiente cerebral humano. Es importante destacar que la estrategia de localización magnética descrita aquí es independiente de la matriz y podría adaptarse fácilmente a sistemas de ECM específicos del cerebro en futuros estudios para aumentar aún más la relevancia fisiológica.

Otras consideraciones del ensayo son los posibles requisitos de entrenar un nuevo modelo de segmentación WEKA para cada línea celular debido a la heterogeneidad de la muestra y la variabilidad en la morfología de invasión. Además, tanto la densidad de siembra como la concentración de nanopartículas deben optimizarse para cada línea celular y tipo de esferoide para mantener la uniformidad y viabilidad antes de realizar ensayos de migración de alto rendimiento. A pesar de estas limitaciones, esta plataforma proporciona un marco escalable y adaptable para estudiar la invasión específica de glioblastomas y la respuesta al tratamiento. Su compatibilidad con la imagen de células vivas, las canaletas automatizadas de segmentación y el análisis multiplexado postensayo abre oportunidades para el cribado de alto contenido de nuevas terapias, terapias combinadas y estudios mecanicistas de invasión a partir de muestras altamente heterogéneas de tumores de pacientes. Además, extender este ensayo a sistemas de cocultivo, como células cerebrales residentes como astrocitos, neuronas y microglía, o modelos de interacciones hematoencefálicas y barreras hematoencefálicas aporta información adicional sobre las interacciones tumor-estroma que impulsan la progresión y recurrencia del glioblastoma.

Durante el desarrollo del ensayo se identificaron varios pasos técnicos como determinantes críticos de la reproducibilidad y el rendimiento global del ensayo. Estandarizar la densidad de siembra de las líneas celulares antes del ensayo garantiza que el tamaño inicial de la gliomasfera sea consistente, lo que permite que la dinámica del crecimiento de los esferoides sea comparable entre líneas celulares, tratamientos y condiciones. Sin este paso de estandarización, los tamaños iniciales de las esferoides añadirán un nivel significativo de variabilidad, que podría reflejar respuestas variables de las gliomasferas a condiciones experimentales. La localización central precisa de las gliomasferas dentro de cada pozo es un requisito clave para la adquisición automatizada de imágenes y la segmentación aguas abajo con precisión. Los esferoides descentrados provocaban un ruido de imagen considerable e impiden el uso de la segmentación WEKA como medio para segmentar las imágenes en regiones claramente definidas. Asegurando que todas las gliomasferas estén localizadas en el centro, el mismo clasificador WEKA puede usarse varias veces, ya que el ruido se reduce sustancialmente y la calidad de imagen mejora drásticamente. Una representación de esto se muestra en la Figura 1. La incorporación de nanopartículas magnéticas de óxido de hierro es, por tanto, un método para asegurar la ubicación central de las gliomasferas, minimizar la variabilidad posicional y mejorar sustancialmente el procesamiento y la comparabilidad de imagen entre réplicas. Por último, el entrenamiento del modelo de segmentación dentro de la tubería WEKA representa un paso crítico adicional de estandarización. Debido a la heterogeneidad interpaciente y a las diferencias en la morfología de la invasión, un único modelo de segmentación puede no generalizarse a todas las muestras. Reentrenar o refinar los parámetros de clasificación para cada línea celular garantiza mapas de probabilidad precisos de áreas invasoras y previene errores de cuantificación.

En conjunto, este ensayo proporciona una plataforma reproducible y escalable para estudiar en tiempo real los comportamientos invasivos dinámicos de muestras de glioma derivadas del paciente. Su compatibilidad con imágenes multiplexadas y análisis moleculares posteriores lo convierte en una herramienta potente y versátil tanto para la investigación básica como traslacional, lo que aumentará considerablemente la relevancia traslacional de los modelos preclínicos de glioblastoma.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
KIT DE BIOIMPRESIÓN DE 96 POCOS, TRANSPARENTE	Greiner	655840
Accutase	Invitrogen	00-4555-56	N/D
Suplemento B-27 (50X), suero y p-sáfia; libre sin vitamina A	Gibco	12587010	10%
Factor básico de crecimiento de fibroblastos, humano y p.mb.; (bFGF)	PeproTech	100-18B	20  ng/ml
Celldiscoverer  7	Zeiss	-
Microplacas esferoides de Corning	Corning	CLS4515
Matriz de Matrigel de Corning	Corning	354234	Dilución final 1:100
Contador Automatizado de Células Countess	Invitrogen	-
DMEM-F12  (500ml)	Thermofischer	11320-074	N/D
Factor de Crecimiento Epidérmico Humano (EGF)	PeproTech	AF-100-15	20  ng/ml
FITC Ratón Anti-Humano CD44	BD Pharmingen	555478	1:100
Microplacas de cultivo celular de poliestireno de 96 pozos Greiner CELLSTAR con fondo en F/pozo de chimenea, y micro; Transparente, negro, TC, estéril, con tapa	Greiner	655090
Heparina	Thermofischer	A16198	5µ g/ml
Hoechst 33258	Sigma Aldrich (Merck)	861405	1µ g/ml
NanoShuttle-PL	Greiner	657841	1.5  & micro; 1/10.000 celdas
Penicilina - Estreptomicina	Merck	P4333	1%